Culture organotypique d'exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d'excroissance des nerfs périphériques

L’objectif global de cette procédure est de préparer des coupes transversales organotypiques de la région des membres antérieurs d’embryons de souris exprimant la GFP pour imager l’excroissance du nerf rachidien. Ceci est accompli en intégrant d’abord les embryons dans des aros à bas point de fusion et en limitant la zone de tissu et aros à la région d’intérêt. Le bloc aros est ensuite monté pour le tranchage.

Ensuite, les embryons incrustés dans le bloc sont tranchés avec le vibromasseur. La dernière étape de la procédure consiste à retirer les aros entourant les tranches et à transférer les tranches dans des plaques de culture. Les tranches sont ensuite cultivées et montrent la croissance des nerfs périphériques vers la périphérie, qui peut être surveillée par microscopie à fluorescence.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la guillotine ou le hachoir à tissus, est que les tranches sont générées de manière plus contrôlée et présentent une meilleure viabilité en culture. Par conséquent, cette méthode peut aider à l’étude de la neurobiologie du développement, comme l’examen du guidage et de la croissance des nerfs rachidiens, démontrant que la procédure sera Isabel barman. Commencez cette procédure en préparant des plaques de culture tissulaire de 10 centimètres avec six millilitres de milieu de culture et trois millimètres de centimètres de centimètres de cellules et des inserts de membrane de culture de 0,4 micron.

Conservez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, chauffez 4 % de points de fusion bas dans PBS au micro-ondes et conservez-le sur une plaque chauffante de manière à ce qu’il reste à environ 37 degrés Celsius. Remplissez des boîtes de Pétri bactériologiques de 10 centimètres avec du PBS et placez-les sur de la glace.

Installez ensuite le dispositif de refroidissement Viome. Conservez le plateau tampon et les éléments réfrigérants au congélateur jusqu’à ce qu’ils soient complètement congelés pour produire l’embryon. L’enrobage d’abord disséquer les embryons de l’utérus.

Examinez-les avec un microscope à fluorescence inversée et vérifiez l’expression de la GFP. Ensuite, placez les embryons sur une boîte de Pétri inversée de 10 centimètres à l’aide de bandes de papier watman pour les orienter et éliminer l’excès de PBS. Appliquez des aros sur l’embryon afin de le fixer.

En position orientée, attendez que les aros se solidifient, coupez les aros excessifs et, si vous le souhaitez, les tissus entourant la partie médiane de l’embryon. Faites pivoter l’embryon encastré de l’autre côté. Appliquez des aros supplémentaires sur le tissu embryonnaire pour vous assurer que l’embryon est complètement intégré.

Attendez que les aros se solidifient. Préparez un bloc aros d’embryon encastré avec des bords propres. Enfin, collez l’échantillon sur un mandrin viome avec de la Loctite 4 0 6.

Installez le plateau tampon pré-refroidi et les éléments de refroidissement. Placez le mandrin avec le tissu collé sur le viome. Ajoutez un X-H-B-S-S dans le mandrin jusqu’à ce que le tissu soit couvert.

Insérez une lame viome pré-nettoyée dans le porte-lame. Ensuite, préparez des tranches transversales d’une épaisseur d’environ 350 à 450 microns. Chaque tranche est découpée à l’aide d’un microtome HM six 50 V.

Transférez les tranches sur des plaques de culture tissulaire à l’aide d’une pipette de pâturage en verre raccourcie et conservez-les sur de la glace. À l’aide d’une paire de pinces, retirez soigneusement les aros de toutes les tranches. Transférez ensuite les tranches sur les membranes de culture millicellulaire avec un arrangement de quatre tranches sur chaque membrane dans des plaques de culture de 10 centimètres remplies de six millilitres de culture préchauffée. Douleur moyenne.

Incuber les tranches à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’au début de l’imagerie time-lapse et entre les intervalles d’imagerie. Placez la plaque de culture tissulaire contenant les membranes de culture cellulaire Millie avec des tranches sous un microscope fluorescent vertical et localisez les nerfs rachidiens, imagez la croissance du nerf rachidien à l’aide d’objectifs quatre x 10 x ou 20 x. Étiquetez l’orientation des membranes de culture millicellulaire sur la platine du microscope pour les repositionner correctement au moment de l’imagerie suivante au cas où l’on n’aurait pas une température et un dioxyde de carbone stables.

L’environnement illustré ici est une série d’images de l’excroissance du nerf rachidien pendant 24 heures de culture dans une coupe transversale d’un embryon homozygote de GFP tau. L’étoile indique les motoneurones de la moelle épinière ventrale et la flèche indique DRG. Le panneau supérieur a été imagé à l’aide d’un objectif à quatre X et le panneau inférieur à l’aide d’un objectif 10 X.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tranches transversales organotypiques d’embryons de souris qui peuvent être utilisées pour imager l’excroissance du nerf rachidien.