Enregistrements physiologiques des NMJs rendement élevé et faible sur le muscle extenseur écrevisses jambe

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment exposer et distinguer les terminaisons motrices phasiques et toniques à l'aide d'une coloration morphologique et d'un enregistrement électrophysiologique sur le muscle extenseur de l'écrevisse. Cette opération est réalisée en pinçant d'abord la première ou la deuxième patte marcheuse d'une écrevisse de taille moyenne, en découpant l'exosquelette et en retirant le muscle fléchisseur du segment méite. Cela permet d'exposer le muscle extenseur ainsi que le cordon nerveux.

La deuxième étape de la procédure consiste à colorer la préparation avec du tétraéthylamino stérile et de l'iodure de méthylperithélène, ou bien du quatre D deux asp, afin de visualiser les axones et les terminaisons nerveuses. La troisième étape de la procédure consiste à stimuler sélectivement les neurones toniques et/ou phasiques, tout en réalisant simultanément des enregistrements intracellulaires des PPSÉ évoqués dans la fibre musculaire. La dernière étape de la procédure consiste à utiliser une électrode focale pour enregistrer les événements quantiques spontanés et évoqués provenant des terminaisons.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus permettant de distinguer morphologiquement et physiologiquement les terminaisons toniques et phasiques par microscopie à immunofluorescence et par électrophysiologie. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la physiologie synaptique, notamment dans des domaines tels que la fatigue musculaire, la dépression synaptique et la communication croisée synaptique. L'expérience commence par la prise délicate de l'écrevisse, en évitant soigneusement ses pinces.

Détacher la patte du corps au niveau du segment du podite isia. Une pression vigoureuse appliquée au segment du podite isia induit l'autotomie chez l'écrevisse, c'est-à-dire la rupture naturelle de la première patte marcheuse. L'écrevisse cesse alors de saigner et est replacée dans son réservoir de maintien.

L'écrevisse n'est pas sacrifiée. Placer la patte sur un morceau de papier absorbant afin que la préparation puisse être facilement retournée pendant les incisions. Tourner la patte jusqu'à ce que l'extérieur, c'est-à-dire le côté latéral, soit orienté vers le haut sur la plaque de dissection.

Cela présente généralement le côté voûté vers le haut. À l’aide d’une lame de rasoir fine fixée à un couteau chirurgical, graver l’exosquelette dans le segment méite en suivant le motif indiqué sur la figure. Veiller à ne pas couper trop loin en direction distale lors de l’incision dorsale à ventrale le long de l’articulation carpo-métacarpienne du méite.

Cette incision crée une fenêtre dans le mérite au-dessus des muscles de la patte sous-jacents. Laissez la cuticule en place pour l'instant. Placez la préparation dans une boîte de dissection contenant une solution saline physiologique pour écrevisse.

À ce stade, insérez une épingle au milieu du segment carpod et sur l'aspect dorsal du segment ischia pod à l'aide de fines pincettes, soulevez légèrement la fenêtre découpée dans la cuticule à partir de l'extrémité distale, puis sectionnez les fibres musculaires fléchisseurs de la cuticule à l'aide d'un rasoir. Poursuivez la coupe de manière distale à proximale, puis retirez enfin la fenêtre de la cuticule. Pour exposer le muscle extenseur, il est nécessaire d'ôter le muscle fléchisseur situé au-dessus.

Séparez le tendon du muscle fléchisseur en le déplaçant par rapport au muscle à l’aide d’une épingle. Ensuite, coupez le tendon au niveau de l’articulation métacarpo-phalangienne. Comme indiqué, veillez à tirer soigneusement le tendon loin de la cavité de la patte avant de procéder à l’incision, et à ne couper que le tendon, sans endommager le nerf principal de la patte situé du côté interne du tendon.

Pincez le tendon à l'endroit où il a été coupé à l'aide de pinces et retirez le muscle fléchisseur de la patte en le soulevant dans un sens coddle. Pour exposer le nerf du muscle extenseur, sectionnez le nerf principal de la patte au niveau de l'articulation méropode-carpopodite et retirez délicatement le nerf principal de la patte par-dessus le muscle extenseur. La séparation du nerf du muscle extenseur par rapport au nerf principal de la patte peut être facilitée en tirant doucement la souche distale du nerf principal de la patte vers le côté de la préparation. Lorsque vous décollez le nerf principal de la patte par-dessus le muscle extenseur, il peut être nécessaire de couper de petits rameaux de l'axone inhibiteur.

Le faisceau nerveux peut être visualisé par coloration au bleu de méthylène. Toutefois, le bleu de méthylène ne serait pas utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques dans cette image en haut. Flèches rouges indiquant la trajectoire nerveuse d'intérêt.

Le faisceau nerveux d'intérêt est le plus gros faisceau qui part du nerf principal de la patte près de l'extrémité proximale de la méropode. Observez les ramifications des axones et les deux axones clairement visibles à l'intérieur du nerf. Maintenant que le nerf et le muscle sont exposés, préparez l'appareillage utilisé pour l'expérience.

Les enregistrements intra- et extracellulaires sont réalisés à l’aide d’un préamplificateur et d’un amplificateur standards. Nous utilisons un amplificateur Axon Clamp modèle 2B et un préamplificateur 1XLU. Trois électrodes sont nécessaires : une intracellulaire et deux extracellulaires.

Les deux électrodes extracellulaires seront utilisées pour stimuler le nerf et enregistrer les potentiels synaptiques évoqués et les événements spontanés de type « qual ». Polissez au feu les électrodes focalisées et courbez-les légèrement au-dessus d'un élément chauffant. Après avoir rempli une électrode focalisée avec du sérum physiologique, placez-la dans le support d'électrode de stimulation et insérez le fil stimulateur de manière qu'il entre en contact avec le sérum physiologique.

Ceci est relié à une unité d'isolement de stimulation P 15 pour graminées, qui est connectée à un stimulateur S 88 pour graminées. Pendant les enregistrements électrophysiologiques, le colorant vital pour D deux ASP est utilisé pour visualiser les axones et les colorer ; remplacez la solution saline du bain par une solution saline contenant cinq micromoles de quatre D deux ASP par colorant pendant cinq minutes. Après cinq minutes, remplissez à nouveau la boîte avec la solution saline physiologique pour écrevisses, placez la préparation sous un microscope et utilisez un objectif Forex.

Avec un oculaire 10 x, déplacez l'électrode de stimulation vers la zone d'intérêt. L'étape suivante consiste à positionner la lumière de l'électrode de stimulation en macro-patch sur l'axone phasique ou tonique. Cette photographie d'une préparation marquée avec quatre colorants, dont deux colorants, montre que l'axone tonique est plus nettement visible en raison de sa teneur accrue en mitochondries.

Les terminaisons toniques présentent de nombreuses varicosités, tandis que les terminaisons phasiques sont de nature plus fine en microscopie à fluorescence. L'objectif 20 x permet de positionner l'électrode sur l'axone tonique ou phasique. Ici, l'électrode est positionnée sur l'axone tonique.

Placer l'électrode intracellulaire dans son micromanipulateur, puis insérer l'électrode intracellulaire dans une cellule musculaire extenseur. Cet instrument servira à enregistrer les potentiels postsynaptiques excitateurs intracellulaires ou PPSE. Pour l'enregistrement des PPSE qualitatifs.

Placer la deuxième électrode focale dans un micromanipulateur. Pour ce faire, retirer l'ancienne électrode intracellulaire et son support, puis les remplacer par un support d'électrode propre. Utiliser le micromanipulateur pour positionner le lumen de la deuxième électrode focale directement au-dessus d'une varicosité synaptique.

La résistance de l'électrode et du scellement est déterminée en appliquant des impulsions de courant test à travers l'électrode. Dans nos expériences, les résistances de scellement variaient entre 0,3 et un mégohm, et la résistance de l'électrode entre 0,5 et un mégohm. La résistance de scellement en mégohm peut être surveillée tout au long de l'enregistrement.

Lorsque vous êtes prêt à commencer la stimulation, allumez le logiciel Scope 5.0 et commencez à stimuler l'axone isolé. Dans le faisceau nerveux, l'axone tonique est stimulé par l'électrode de succion et les PPSÉ de la fibre musculaire sont enregistrés à l'aide d'une électrode intracellulaire ou extracellulaire. Les PPSÉ sont enregistrés sur un ordinateur via une interface Power Lab Forest.

Après la stimulation de l'axone tonique, l'électrode de stimulation peut être déplacée vers l'axone phasique et l'expérience répétée après la stimulation nerveuse. L'électrode intracellulaire enregistre les PPSÉ générés en réponse à l'activité des motoneurones toniques et phasiques. La facilitation synaptique aux jonctions neuromusculaires toniques dépend de la fréquence de la stimulation nerveuse, comme illustré ici pour des trains successifs d'environ 20 stimulations chacun, à une fréquence de 60 hertz.

Remarquez la facilitation qui se produit avec plusieurs stimuli. Cette figure compare les amplitudes des PPSÉ générés par la stimulation du nerf tonique à des fréquences de 20 hertz en bleu, 40 hertz en vert et 60 hertz en rouge ; notez la forte facilitation observée à des fréquences de stimulation plus élevées. Les terminaisons toniques ont une efficacité synaptique faible, mais présentent des réponses facilitées très marquées.

Voici les PPS toniques seules, puis les réponses phasiques sont superposées à la même échelle. Contrairement aux terminaisons toniques, les terminaisons phasiques présentent une efficacité synaptique élevée, mais montrent une dépression synaptique lors d'une stimulation à haute fréquence. La dépression synaptique au niveau des terminaisons phasiques est également liée à la fréquence de stimulation, comme illustré ici.

Une stimulation continue à cinq hertz pendant 30 minutes diminue la réponse au niveau de la jonction neuromusculaire. Avec une fréquence de stimulation plus élevée, le prélèvement s'affaiblit plus rapidement sous une stimulation appropriée. La jonction neuromusculaire de l'écrevisse génère des PPSPE non déclenchés.

Ces PPSÉ peuvent être utilisées pour étudier les propriétés qualitatives qui composent les signaux électriques gradués dans ces muscles. Ici, les réponses synaptiques qualitatives du terminal tonique sont illustrées. Notez que tous les essais de stimulation ne produisent pas un événement qualitatif.

Le comptage direct des événements quantiques est possible avec une stimulation de faible fréquence pour chaque réponse évoquée. Le nombre d'événements quantiques peut être facilement déterminé pour les terminaisons toniques. En comptant les événements quantiques, les réponses synaptiques provenant du motoneurone phasique peuvent être enregistrées de la même manière.

Cependant, les réponses évoquées sont de nature multiquantale. La teneur moyenne en quanta est estimée en utilisant l'amplitude moyenne ou la surface des déflexions, ainsi que l'amplitude crête moyenne ou la surface des événements spontanés. Un dernier rappel : soyez prudent lors du retrait du muscle fléchisseur afin de ne pas endommager le nerf en attente du muscle extenseur.

C'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.