Potentiels de membrane, les réponses synaptiques, circuits neuronaux, neuromodulation et histologie muscle en utilisant l'écrevisse: des exercices de laboratoire étudiant

Les objectifs généraux des expériences suivantes sont de comprendre les propriétés des membranes excitables et la base ionique du potentiel de membrane au repos, et d’apprendre des méthodes pour mesurer le potentiel membranaire ainsi que pour démontrer les propriétés de la transmission synaptique. Dans une partie de l’expérience, le potentiel de la membrane au repos sera mesuré tout en modifiant le potassium extracellulaire. Dans une autre partie de l’expérience, les mécanismes de différenciation synaptique seront étudiés en enregistrant des réponses synaptiques stimulées dans diverses unités motrices.

Ensuite, un circuit neuronal facile à entretenir est présenté. Cette préparation peut être utilisée pour l’enseignement ainsi que pour la recherche de divers aspects d’un circuit sensoriel au SNC, au motoneurone et au circuit musculaire. Cet ensemble d’expériences montre la facilité d’utilisation du modèle d’écrevisse pour résoudre les problèmes liés à l’intégration et à la transmission synaptiques du potentiel membranaire, ainsi qu’aux différences structurelles des types de fibres musculaires.

Les principaux avantages de l’utilisation de la préparation d’écrevisses dans l’enseignement des concepts et des techniques électrophysiologiques sont la facilité de dissection, la viabilité de la préparation avec une solution saline minimale, la facilité d’obtenir des réponses synaptiques et la facilité de discerner l’arrangement anatomique global des muscles. Ces techniques peuvent également être appliquées à d’autres préparations et permettront d’approfondir notre compréhension de la physiologie et de la modulation synaptiques ainsi que des différences biochimiques et structurelles dans la préparation démontrée. Pour commencer l’opération, sélectionnez une écrevisse d’environ six à 10 centimètres de longueur et placez-la dans de la glace pilée pendant cinq minutes pour l’anesthésier afin de décapiter l’écrevisse, tenez-la par l’arrière de la tête, en vous assurant de garder vos doigts hors de portée des griffes et de la bouche de la craie à l’aide de grands ciseaux.

Retirez rapidement la tête en faisant une coupe nette derrière les yeux de l’écrevisse, retirez les pattes et les pinces de l’écrevisse pour éviter de vous blesser. Supprimez les styles chez les mâles et les filles nageuses chez les mâles et les femelles. Débarrassez-vous de la tête et des appendices.

Ensuite, séparez l’abdomen du thorax en faisant une coupe le long de la membrane articulée, qui relie l’abdomen et le thorax. Conservez la partie abdominale de l’écrevisse et jetez le thorax en pointant les ciseaux légèrement vers le côté ventral et, en biais, faites une entaille dans la coquille le long du bord latéral inférieur de chaque côté de l’abdomen. Attention à ne pas couper trop profondément les écrevisses.

Suivez le motif naturel de la coquille des lignes de l’écrevisse qui s’étendent sur toute la longueur de chaque segment à l’aide d’une pince. Retirez la partie ventrale de la coquille en la tirant vers le haut et vers l’arrière. En prenant soin de ne pas détruire les muscles abdominaux.

Retirez les muscles fléchisseurs. À ce stade, une masse blanche de tissu peut être observée au-dessus des muscles fléchisseurs profonds. Retirez ce tissu avec précaution à l’aide d’une pince.

Le tractus gastro-intestinal est maintenant visible sous la forme d’un petit tube longeant la ligne médiane des muscles fléchisseurs profonds. Retirez-le en le pinçant avec une pince en haut et en le tirant loin de l’abdomen. Coupez le bas du tractus gastro-intestinal à l’extrémité de la queue.

Rincez la dissection avec une solution saline pour vous assurer que les déchets fécaux n’interfèrent pas avec la préparation. À l’aide d’épingles de dissection, épinglez les coins supérieur et inférieur de la préparation sur une boîte de Pétri recouverte d’un garde en S. Les muscles extenseurs abdominaux sont maintenant exposés.

Versez une solution saline dans la boîte de Pétri pour couvrir la préparation jusqu’à ce que les enregistrements intracellulaires soient effectués. Déplacez la boîte de Pétri vers le microscope et utilisez de la cire sous la boîte pour l’empêcher de bouger. L’appareil utilisé pour les enregistrements intracellulaires est illustré sur cette figure.

Les connexions et les paramètres appropriés sont indiqués dans le texte d’accompagnement. Configurez le logiciel de tableau de laboratoire selon les instructions. Dans le texte d’accompagnement, placez le fil de terre dans le bain salin.

Placez l’extrémité d’une micropipette en verre remplie de chlorure de potassium à trois molaires dans le bain salin et testez la résistance de l’électrode. La résistance de l’électrode doit être de 20 à 60 méga ohms. Utilisez le bouton grossier de l’amplificateur pour mettre la ligne sur le tableau de laboratoire à zéro sous un éclairage de haute intensité.

Regardez au microscope et identifiez les muscles longitudinaux DEM. Utilisez la sonde d’électrode pour insérer l’électrode intracellulaire dans une fibre musculaire du muscle DEM. L’électrode doit à peine être insérée dans la fibre musculaire.

Veillez à ne pas pénétrer complètement dans la cellule. Mesurez l’amplitude du potentiel de repos. Faites glisser le curseur M sur la trace à partir de l’emplacement situé dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du graphique.

Placez le marqueur M sur la ligne de base et déplacez le curseur au point le plus bas du signal enregistré. La différence entre le marqueur et le curseur actif est affichée en haut à droite de l’écran. Cette valeur est la tension du potentiel de la membrane au repos.

Divisez la tension enregistrée par la quantité d’amplification, dans ce cas, 10 x amplification ont été utilisées. Convertissez ensuite la tension de volts en millivolts. Après avoir enregistré le potentiel de repos de cette fibre musculaire, regardez au microscope et retirez soigneusement l’électrode de la fibre musculaire.

Répétez l’enregistrement intracellulaire sur d’autres fibres musculaires. La prochaine partie de cette expérience surveillera l’effet de l’augmentation de la concentration de potassium extracellulaire sur la membrane au repos. Des solutions salines potentielles de six écrevisses seront utilisées avec des concentrations de potassium de 5,4, 20, 40, 60, 80 et 100 millimolaires.

Choisissez un muscle qui ne se contracte pas pour effectuer le prochain enregistrement intracellulaire entre les enregistrements. Remplacez la solution du bain par la concentration immédiatement supérieure de solution de chlorure de potassium. Assurez-vous de couvrir complètement la préparation à chaque fois.

Noter les changements de potentiel membranaire pour chaque solution. L’effet de l’augmentation de la concentration de potassium extracellulaire, le potentiel membranaire est montré dans ce graphique de capture d’écran les potentiels membranaires au repos pour chaque concentration de potassium sur un graphique semi-logarithmique de la concentration de potassium extracellulaire en fonction du potentiel membranaire. Alignez le potentiel de repos à 5,4 millimolaires de potassium extracellulaire.

Pour les courbes hypothétiques et observées, comparez la pente de la droite observée à la pente de la droite hypothétique. Après avoir terminé ces enregistrements électrophysiologiques, l’étape suivante consiste à examiner l’anatomie des fibres musculaires et leur schéma d’innervation. Transférez la préparation dans le plat sur pied et ajoutez le bleu de méthylène.

Au bout de cinq minutes, retirez le bleu de méthylène et ajoutez une solution saline d’écrevisses fraîches. Recherchez le nerf principal qui innerve les muscles d’un segment. Esquissez le motif d’innervation des muscles S-E-M-D-E-L 2D EL one et DEM dans un segment.

Ensuite, déplacez la préparation sous une hotte. Retirez la solution saline et ajoutez le fixateur. Le fixateur utilisé ici est une solution poin.

Le but de la hotte est d’éviter les vapeurs du fixateur. Faites très attention à ne pas mettre cette solution sur votre peau ou dans vos yeux. Si vos yeux commencent à brûler, lavez-les immédiatement à la station de douche oculaire.

Laissez la solution de boin sur la préparation pendant environ 10 minutes, puis utilisez une pipette pour remplacer la solution par une solution saline. Découpez un segment mince du muscle DEL un ou deux. Placez-le sur une lame de verre.

Étiquetez la diapositive. Répétez la procédure pour le muscle SEM. Utilisez le microscope composé pour visualiser le motif de bandes de sarcomère dans les deux préparations tissulaires.

La prochaine série d’expériences examinera comment enregistrer les réponses synaptiques dans les muscles abdominaux des écrevisses. Sélectionnez une autre écrevisse, décapitez-la. Retirez le thorax et les appendices et exposez les muscles extenseurs abdominaux comme indiqué lors de la chirurgie.

Dans la première section de cette vidéo, à l’aide du microscope, trouvez le nerf transportant les axones moteurs vers les muscles extenseurs. Recherchez le segment avec le nerf le plus accessible. Le nerf est blanc et peut être vu à l’aide d’une pipette pour pulvériser une solution saline sur la préparation ou en soufflant légèrement sur la préparation.

Cela fait bouger le nerf et facilite ainsi son identification. Placez l’électrode d’aspiration tenue par le manipulateur microm directement sur le nerf. Tirez doucement sur la seringue pour attirer le nerf dans l’électrode.

Vous pouvez voir le nerf être aspiré dans l’électrode à travers le microscope. Ajustez les paramètres du logiciel de tableau de laboratoire comme spécifié dans l’article ci-dessous. Remplissez une micro-électrode en verre de chlorure de potassium à trois molaires et connectez-la à l’étage principal et au laboratoire d’alimentation.

Utilisez le bouton de course de l’amplificateur pour déplacer la ligne sur le tableau de laboratoire à zéro. Avant d’insérer l’électrode, le bouton à bascule doit être allumé puis éteint plusieurs fois. Afin de tester la résistance de l’électrode, mesurez l’amplitude des valeurs résultantes.

Regardez à travers le microscope et utilisez la sonde de l’électrode pour insérer l’électrode dans l’une des fibres musculaires longitudinales, soit DEM, soit DL un, soit DL deux. Attention à ne pas pénétrer à travers la fibre musculaire. La préparation est maintenant prête pour l’expérience.

L’électrode d’aspiration est utilisée pour stimuler le faisceau nerveux segmentaire et la micro-électrode de verre est utilisée pour enregistrer la réponse synaptique de la fibre musculaire déclenchant le stimulateur de greffe pour stimuler le nerf à un hertz pour les réponses phasiques. Ensuite, placez l’électrode dans une fibre musculaire SEL. Le SEL est un muscle tonique.

Stimulez le nerf avec de courtes rafales d’impulsions à 10 hertz pour des réponses toniques. Comparez les réponses enregistrées des muscles DEL et SEL. Notez que les muscles DEL phasiques ont des réponses synaptiques d’amplitude plus grande que les muscles SEL toniques.

Cette prochaine série d’expériences se concentre sur les muscles fléchisseurs de l’écrevisse plutôt que sur les muscles extenseurs. En commençant par une nouvelle écrevisse, isolez l’abdomen comme indiqué dans cette chirurgie. Dans la première section de cette vidéo, placez la préparation de queue isolée dans une boîte de Pétri remplie de solution saline, épinglez la queue et la partie supérieure de la préparation.

Notez que dec Caro expérimente sur les muscles fléchisseurs toniques, le cordon nerveux ventral doit être laissé intact. À l’aide d’un scalpel, commencez une coupe longitudinale à travers la membrane articulée entre deux côtes de la face ventrale de la préparation. Faites très attention à ne pas couper trop profondément lorsque vous faites cette coupe, car une coupe profonde pourrait transecter la racine nerveuse motrice pour s’assurer que les muscles superficiels ne sont pas endommagés.

Passez à l’étape suivante. Regarder au microscope à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel coupé horizontalement à partir de la coupe longitudinale dans la fine couche de membrane recouvrant le muscle. Élargissez la coupe pour former un lambeau de membrane articulée et soulevez le rabat vers le haut.

Utilisez des ciseaux pour couper le lambeau, exposant les muscles fléchisseurs superficiels pour l’enregistrement intracellulaire des muscles fléchisseurs superficiels. Utiliser les mêmes instruments et la même configuration que ceux utilisés pour enregistrer le potentiel de membrane au repos et les réponses synaptiques des extenseurs abdominaux. Comme précédemment, utilisez une électrode intracellulaire remplie de chlorure de potassium à trois molaires.

Insérez l’électrode dans une fibre musculaire des muscles fléchisseurs superficiels, en faisant attention de ne pas pénétrer à travers le muscle. Consigner l’activité spontanée des RPEB. Notez les différentes tailles des EPSP et la présence éventuelle d’IPSP.

Prenez un petit pinceau et brossez soigneusement le long du bord de la cuticule dans le même segment contenant l’électrode d’enregistrement. Notez tout changement de fréquence ou de taille des EPSP dû à la stimulation si une réponse plus importante est observée. Cela indiquerait le recrutement de motoneurones supplémentaires répondant au changement dans l’activation des nerfs sensoriels.

Remplacez soigneusement la solution du bain salin par une solution contenant un neuromodulateur tel qu’une sérotonine micromolaire ou une solution saline bouillonnée de dioxyde de carbone. Répétez ensuite la stimulation au pinceau. Notez l’effet que le changement de solution de bain a sur l’activité enregistrée.

Changez la solution saline du bain pour qu’elle redevienne normale et observez que l’activité des fibres musculaires revient à la ligne de base. Cette figure montre les EPSP enregistrés dans une fibre musculaire fléchisseuse superficielle. Notez les différentes tailles des EPSP.

La prochaine étape de cette expérience utilise une électrode extracellulaire pour surveiller les potentiels d’action des motoneurones répondant à l’activité du circuit sensoriel du SNC au motoneurone. Commencez par fabriquer une électrode d’aspiration pour stimuler les nerfs sensoriels. Tirez un morceau de tube en plastique sur une flamme.

L’étape suivante consiste à couper le tube à la taille souhaitée. Pour ce faire, vous devrez regarder le nerf dans votre préparation pour juger du diamètre d’ouverture souhaité pour votre électrode d’aspiration. Selon la taille de l’écrevisse, la taille des faisceaux nerveux peut varier d’environ un millimètre à quelques millimètres de diamètre.

Coupez la section étirée du tube pour que l’ouverture de la pointe soit de la bonne taille pour maintenir le nerf. Si l’ouverture est trop grande, le nerf pourrait tomber. Si l’ouverture est trop petite, le nerf pourrait être endommagé par la pression de l’électrode.

Placez le tube en plastique sur l’extrémité d’une électrode en verre. La configuration de l’électrophysiologie et du logiciel est légèrement différente de la surveillance des réponses extracellulaires par rapport aux enregistrements intracellulaires mis en place. L’équipement, tel que spécifié dans l’article d’accompagnement, aspire la troisième voie qui innerve le muscle fléchisseur superficiel dans l’électrode d’aspiration.

Vous pouvez maintenant commencer à enregistrer les potentiels d’action. Cette voie comporte cinq motoneurones excitateurs et un motoneurone inhibiteur. Après avoir enregistré l’activité de base, stimulez la cuticule avec un pinceau pour observer le changement des potentiels d’action générés.

Ensuite, remplacez la solution du bain par des neuromodulateurs tels que la sérotonine comme dans l’expérience précédente, et notez tout changement de réponse. Des exercices supplémentaires sont donnés dans le texte d’accompagnement. Cet enregistrement montre les potentiels d’action enregistrés à partir de la troisième voie avant et pendant la stimulation de la cuticule avec un pinceau, comparez la fréquence des potentiels d’action avant le brossage à leur fréquence pendant la stimulation.

Cet enregistrement montre les potentiels d’action enregistrés à partir de la troisième voie dans une solution saline normale et dans une solution de sérotonine. Comparez la fréquence des potentiels d’action dans une solution saline normale à leur fréquence et à la sérotonine Comme nous venons de le voir. Le brossage augmente la fréquence de tir au-dessus de la ligne de fond.

L’activité a également démontré que la sérotonine augmente la fréquence de décharge par rapport à une solution saline normale. Cette figure montre que lorsque le brossage et la sérotonine sont combinés, il y a une augmentation encore plus importante de la fréquence des décharges. La comparaison des effets externes et théoriques de la concentration externe de potassium sur le potentiel membranaire au repos indique l’influence des ions sur le potentiel membranaire.

Nous vous avons également montré comment enregistrer les réponses ntiques aux jonctions neuromusculaires des muscles phasiques et toniques. Ces techniques peuvent être utilisées pour les laboratoires d’investigation des étudiants afin d’enseigner les concepts fondamentaux et la physiologie. Les techniques obtenues dans cet exercice de laboratoire peuvent être utilisées pour répondre à des questions liées à d’autres préparations de laboratoire, ainsi qu’à des applications physiologiques liées à la médecine et à la santé.