Modélisation des membranes biologiques avec des cartes de circuits et la mesure des signaux électriques dans les axones: Exercices de laboratoire étudiant

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment les membranes biologiques peuvent être comprises à l'aide de modèles électriques, et de démontrer les méthodes d'enregistrement des potentiels d'action provenant du cordon nerveux ventral de l'écrevisse. Cette démonstration utilise d'abord des composants d'un circuit sur une plaque d'essai afin de représenter les propriétés électriques des membranes. La deuxième étape de la procédure consiste à modifier la résistance et la capacité d'un circuit modèle pour observer les effets sur les tracés de tension.

La troisième étape de la procédure consiste à appliquer les concepts appris à partir d'un circuit modèle à une préparation nerveuse vivante. La dernière étape de la procédure est d'enregistrer les potentiels d'action composés et de comprendre les propriétés des périodes réfractaires seuil et de la transmission synaptique. En définitive, les résultats montrent comment l'analyse de modèles de circuits électriques des membranes biologiques et des propriétés des nerfs vivants peut constituer un outil pédagogique utile, comme le démontre la modification des composants d'un circuit modèle et la variation de la stimulation du nerf vivant.

Cette méthode peut fournir des éléments de compréhension sur la manière dont les membranes biologiques peuvent être interprétées à l’aide de modèles électriques. Elle peut également être appliquée à d'autres tissus, tels que le muscle Visual. La démonstration de cette méthode est essentielle, car la dissection du cordon nerveux ventral et la mise en place de l’enregistrement peuvent s’avérer difficiles au départ, et il est nécessaire de faire preuve de précaution afin d’éviter d’endommager les nerfs, et ainsi obtenir une préparation adéquate pour stimuler et enregistrer l’activité du cordon nerveux.

Dans la première partie de l'expérience, des résistances et des condensateurs sont utilisés pour simuler l'activité électrique de la membrane de la cellule nerveuse. Le circuit initial ne comporte que des résistances. Des condensateurs sont ajoutés à une étape ultérieure.

Les propriétés résistives passives de la membrane nerveuse sont représentées par le circuit illustré ici. La plaque d'essai est configurée avec des résistances en parallèle de 33 kilo ohms, représentant la résistance transversale de la membrane, et des résistances en série de 10 kilo ohms représentant la résistance intracellulaire. Ce circuit suppose que la résistance du fluide externe est négligeable par rapport aux résistances intracellulaire et transversale de la membrane.

Lorsque votre cellule modèle est terminée, reliez les fils de sortie du laboratoire d'alimentation à la maquette sur plaque d'essai. Le laboratoire d'alimentation génère le stimulus et dispose d'une sonde de mesure pour enregistrer la tension. Ensuite, connectez le laboratoire d'alimentation à l'ordinateur.

L'ordinateur sert à afficher les signaux électriques enregistrés à partir de la plaque d'essai. La prochaine étape consiste à configurer le logiciel de l'ordinateur qui contrôlera le stimulus envoyé par le power lab à la cellule nerveuse modélisée. Ouvrez le programme LabChart à partir du bureau.

Sélectionnez un nouveau fichier, sélectionnez configuration, puis paramètres du canal. Sélectionnez un canal à afficher, puis sélectionnez le panneau du stimulateur. Des impulsions longues de 1,5 volt sont requises.

Pour cette partie de l'expérience, réglez l'amplitude à un volt. Le laboratoire de puissance émettra une tension variant entre +0,5 et -0,5 volt, ce qui correspond à un stimulus maximal de un volt. Réglez la fréquence à 0,75 hertz et la durée de l'impulsion à une seconde.

Pour les paramètres du canal, sélectionnez le canal un à surveiller, cliquez sur l'amplificateur d'entrée et, dans la boîte de dialogue, cliquez sur le bouton différentiel et réglez la plage à cinq volts, puis sélectionnez OK. L'étape suivante consiste à appliquer un signal électrique au modèle de cellule nerveuse et à examiner l'atténuation du signal le long de la longueur du modèle. Appliquez une tension à une extrémité du circuit entre A et B en cliquant sur Démarrer sur l'ordinateur.

Mesurez la tension pour la première unité de longueur le long de l'axone modèle et surveillez-la sur l'ordinateur. Laissez la pointe rouge du sonde de mesure de tension fixe au point A sur la plaque d'essai, tout en déplaçant l'autre pointe à différents emplacements entre les résistances en série. Observez la chute de tension aux emplacements les plus éloignés.

Arrêtez maintenant l'enregistrement en appuyant sur stop sur l'ordinateur. Mesurez les différences de tension enregistrées sur les tracés stockés sur l'ordinateur en utilisant le curseur pour déplacer le tracé vers chaque impulsion enregistrée. Utilisez le curseur du marqueur M situé en bas à gauche pour marquer le bas du tracé et placez le curseur libre au sommet du tracé afin de mesurer la différence de tension.

Lisez la mesure de la différence de tension sur l'écran et notez-la dans votre cahier pour chaque emplacement de mesure le long du circuit. L'étape suivante consiste à calculer la constante de longueur pour la cellule modèle, utilisée pour décrire la décroissance exponentielle du signal en fonction de la distance. Reportez chaque valeur de différence de tension sur un graphique représentant la différence de potentiel en fonction de la distance par rapport à la source, où les résistances membranaires sont considérées comme une unité.

Outre votre graphique, déterminez la constante de longueur de ce circuit. La constante de longueur d'une fibre nerveuse est définie comme la distance à laquelle une différence de potentiel à travers la membrane diminue jusqu'à 37 % de sa valeur initiale au point d'origine. Afin de simuler plus précisément les propriétés passives de câble des fibres nerveuses et musculaires, la cellule nerveuse modélisée sera agrandie pour inclure des composants à la fois résistifs et capacitifs.

Non seulement existe-t-il une résistance membranaire transversale dans la membrane de la cellule nerveuse, mais il y a également une capacité membranaire superficielle, qui déforme le signal de la cellule nerveuse. Pour simuler cela, branchez en parallèle avec la membrane transversale des condensateurs de 10 microfarads. Les résistances se trouvent sur la platine breadboard de l'ordinateur.

Réglez le stimulateur sur une seconde, un volt, ce qui correspond à un réglage d'amplitude de 0,5 volt et à des impulsions de 0,75 hertz. Également en haut à droite du panneau, réglez la fréquence d'acquisition à 20 K par seconde. Ensuite, cliquez sur le canal un situé à droite de l'écran.

Cliquez sur l'amplificateur d'entrée dans la boîte. Cliquez sur le bouton différentiel et réglez la plage à cinq volts. Cliquez sur OK.

Pour enregistrer ces modifications, cliquez sur Démarrer afin de commencer la collecte de données. Mesurez les données aux mêmes points le long de la platine d'essai. Après la collecte des données, utilisez la fenêtre de zoom pour agrandir le temps de montée sur l'une des impulsions carrées.

Répétez le zoom au besoin pour étaler la courbe. Mesurez le temps nécessaire pour que le signal passe de la ligne de base au sommet de la courbe de tension, juste au moment où il s'aplatit.

Observez l'évolution temporelle du changement de potentiel et la distorsion des impulsions carrées. Notez également si la tension mesurée est supérieure à 0,2 volt en utilisant le curseur M et le curseur libre comme précédemment ; relevez la variation de tension et enregistrez les données dans votre cahier de laboratoire, en considérant que la tension seuil est de 0,2 volt. Mesurez le temps nécessaire pour que le potentiel atteigne le seuil à chaque résistance membranaire.

Tracez vos résultats en portant le temps en fonction de la distance et l'augmentation de l'épaisseur de la gaine de myéline provoque une diminution de la capacité membranaire. Simulez cela en remplaçant les condensateurs de 10 micro ferd sur la plaque d'essai par des condensateurs plus petits de 0,1 micro ferd. Répétez l'expérience précédente.

Remarquez le changement du temps nécessaire pour atteindre le seuil avec une résistance sélectionnée. Superposez les données obtenues avec les condensateurs de plus grande capacité sur le graphique précédent du temps en fonction de la distance. L'augmentation de l'épaisseur de la gaine de myéline permet aux signaux électriques de monter et de descendre plus rapidement dans une cellule nerveuse, augmentant ainsi la vitesse de conduction.

Dans la partie suivante de l'expérience, les propriétés électrochimiques des axones seront examinées dans le cordon nerveux ventral de l'écrevisse. Les propriétés de propagation passive du courant présentées dans les circuits modèles sont également observées dans les préparations vivantes. Toutefois, un potentiel d'action est nécessaire chaque fois qu'un signal doit être transmis sur une distance de quelques millimètres, car les propriétés électriques passives des cellules atténueraient les signaux sur cette distance.

Lorsque des signaux se propagent le long de la corde nerveuse ventrale de l'écrevisse à des vitesses de conduction différentes, les plus rapides seront observés en premier et les plus lents seront détectés légèrement plus tard. Certains de ces signaux s'additionneront lors de l'enregistrement, selon la population d'axones possédant des vitesses de conduction similaires. Ce signal électrique résultant de l'addition des multiples axones est appelé potentiel d'action composé.

La série suivante d'expériences porte sur l'enregistrement de potentiels d'action composés provenant des nerfs d'écrevisse afin d'obtenir le cordon nerveux ventral de l'écrevisse. Préparez d'abord les instruments de dissection pour la préparation nerveuse ainsi que les solutions salines. Placez l'écrevisse sur de la glace pendant environ cinq minutes pour l'anesthésier.

Une fois anesthésié, envelopper l'écrevisse dans une serviette en papier humide et la tenir dans une main, les pinces placées entre le pouce et l'index. À l'aide de l'autre main, pratiquer une incision avec les ciseaux à travers le rostre, entre les orbites oculaires. Couper vers le bas à partir de l'incision jusqu'à ce que la tête soit complètement détachée.

Retirez les pinces et les pattes marcheuses. Faites une incision à la base du thorex céphalique au-dessus de l'abdomen et détachez le thorex céphalique. Retirez la queue et les nageoires.

Effectuez une incision le long des deux côtés de la face ventrale de l'abdomen. Veillez à ne pas endommager les tissus profonds. Relevez la section libérée de l'exosquelette jusqu'à la base du panache caudal afin d'exposer le cordon nerveux ventral.

À l’aide du bord de la pince, retirer soigneusement la corde nerveuse ventrale par l’extrémité. Veiller à ne pas étirer ni écraser la corde nerveuse. Tous les nodules observés sur la corde nerveuse sont des ganglions d’écrevisse.

Disposez le cordon nerveux en travers des barreaux métalliques dans la chambre à nerf. Il est impératif de maintenir le cordon nerveux ventral humide. Pour ce faire, ajoutez suffisamment de solution saline de crevette à la chambre à nerf pour atteindre un niveau égal à celui des barres transversales métalliques.

Ensuite, pipetez suffisamment de solution saline de crevette pour que le niveau du liquide entre juste en contact avec le bas des barres. Une fois le cordon nerveux en place, fixez le câble du stimulateur avec les deux électrodes en forme de mini crochets à la chambre nerveuse. Reliez l'électrode rouge positive à l'une des boucles métalliques externes située près de l'extrémité du cordon nerveux et reliez l'électrode noire négative à la boucle métallique adjacente qui est également en contact avec le cordon nerveux.

Utilisez le manipulateur pour positionner l'électrode de succion près de l'extrémité du nerf opposée aux broches négative et positive. Aspirez délicatement l'extrémité du cordon nerveux ventral dans l'électrode d'enregistrement. Fixez l'électrode à la sonde du préamplificateur en connectant un fil de l'électrode de succion à l'entrée positive de la sonde et l'autre fil à l'entrée négative.

Peu importe quel fil est relié à quelle entrée. La sonde peut être mise à la terre de la cage de Faraday ou du bain salin à l’aide d’un fil de chlorure d’argent, ou bien être connectée à l’entrée de masse du dispositif d’amplification différentielle afin de réduire le bruit potentiel de 60 hertz. Fixez la sonde à l’amplificateur différentiel et reliez l’amplificateur au laboratoire d’alimentation.

Vérifiez que les paramètres de l'amplificateur RS figurent dans le tableau de l'article associé. Utilisez le câble USB pour connecter le PowerLab à l'ordinateur. Ouvrez le logiciel Scope sur le bureau de l'ordinateur, en haut à droite de l'écran.

Sélectionnez le canal deux et éteignez-le. Ajustez l'écran de manière à ce que seul le canal un soit affiché en faisant glisser la barre située au milieu vers le bas de l'écran. Vérifiez l'amplificateur d'entrée avec les paramètres indiqués dans l'article accompagnant.

Ensuite, dans le menu de configuration situé en haut de l'écran, sélectionnez le stimulateur et désactivez la stimulation isolée, puis réglez le délai à cinq millisecondes, la durée à une milliseconde, deux impulsions, un intervalle de 15 millisecondes, une plage de cinq volts et une amplitude de 0,5 volt. Pour commencer à stimuler le cordon nerveux ventral, cliquez sur le bouton Démarrer situé en bas à gauche de l'écran. Un potentiel d'action bien défini devrait apparaître dans la fenêtre de collecte des données de l'oscilloscope.

Esquissez la forme générale du potentiel d'action dans votre cahier de laboratoire. Diminuez lentement la tension à l'aide de l'onglet en haut à gauche de l'écran. Le potentiel d'action doit diminuer en amplitude jusqu'à ce que son profil d'onde caractéristique disparaisse.

La diminution de la tension réduit le nombre de neurones recrutés pour contribuer au potentiel d'action composé ; pour inverser progressivement cet effet, augmentez la tension. Lorsque davantage de neurones sont recrutés, l'amplitude de l'onde du potentiel d'action composé augmente. Cet exercice illustre le fait que les neurones individuels possèdent des seuils différents pour l'initiation de leurs potentiels d'action.

Lorsqu'une augmentation supplémentaire de la tension de stimulation n'entraîne pas d'augmentation du potentiel d'action composé, tous les neurones ont été recrutés et deux pics distincts doivent être visibles sur l'onde du potentiel d'action à l'écran de l'ordinateur. La partie suivante de l'expérience examine la période réfractaire des axones. Modifiez le délai entre les impulsions à l'aide de l'onglet situé dans le coin supérieur gauche de l'écran.

Raccourcissez progressivement le délai jusqu'à ce que le second potentiel d'action composé ne puisse plus être déclenché. La période réfractaire absolue est définie comme l'intervalle de temps entre les impulsions pour lequel un second potentiel d'action n'est plus obtenu. La période réfractaire relative est définie comme la durée comprise entre la fin de la période réfractaire absolue et le moment où l'application d'un second stimulus produit un second potentiel d'action d'amplitude maximale.

Vous pouvez désormais étudier les propriétés d'un inhibiteur des jonctions communicantes tel que l'heptanol. Les différences dans le potentiel d'action composé peuvent être comparées pour des réglages de stimulation identiques afin de déterminer quels signaux sont transmis par les jonctions communicantes le long du cordon nerveux ventral. Vous pourriez également utiliser une solution saline froide ou une solution saline chaude et mesurer les différences de vitesses de conduction des différentes entités qui composent le potentiel d'action composé.

Deux potentiels d'action composés enregistrés à partir du cordon nerveux ventral d'un écrevisse sont montrés ici. Cette figure illustre la période réfractaire relative, qui correspond à la période suivant un potentiel d'action composé complet, durant laquelle un second stimulus provoque un potentiel d'action composé plus faible. Cette figure montre les effets de l'utilisation de hept éthanol sur le potentiel d'action composé après cette procédure.

Les composants du circuit membranaire biologique peuvent être modifiés afin de répondre à d'autres questions, comme l'effet d'une densité modifiée de canaux de fuite dans la membrane ou le rôle des canaux activés par le voltage après leur développement. Ces techniques et procédures ouvrent la voie aux chercheurs en physiologie pour explorer la manière dont les cellules fonctionnent comme des circuits électriques et comment les jonctions communicantes fonctionnent dans les tissus vivants des animaux.