Name: Détermination de méthylation de lADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez comment déterminer la méthylation de l'ADN des gènes soumis à empreinte dans l'endosperme d'Arabidopsis. Cette méthode combine dissection et séquençage par bisulfite pour analyser les mécanismes d'empreinte génétique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient Mme Jennifer M. Lommel et Tara N. Rognan pour l&#39;entretien des plantes d&#39;Arabidopsis. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de Saint Louis University et National Institutes of Health subventions 1R15GM086846-01 et 3R15GM086846-01S1 à W. Xiao.

I. croisement génétique 1. Amputer le parent femelle Afin de distinguer les allèles maternels et paternels en utilisant le polymorphisme de séquence d'ADN, deux écotypes différents, par exemple-Britannique-0 (Col-0) et Ler, seront choisis en tant que parents féminin et masculin. Les plantes doivent être jeune et saine. On peut affaiblir le parent femelle en utilisant un microscope à dissection, grossissant visière, ou de l'œil nu. Localisez étape-12 fleurs (Smyth et al., 1990) et enlever les fleurs ou siliques ci-dessus et en dessous d'eux par clipsage de la base du pédoncule avec les ciseaux. Stériliser une pince en trempant la base de la pointe doucement dans un bécher d'éthanol à 95%, ce qui supprime tout les grains de pollen sur la pince et de tuer le pollen ainsi. Soulever doucement dehors les bourgeons floraux à l'aide des pinces, et retirez délicatement 4 sépales, 4 pétales, étamines et 6, en laissant le pistil nu et intact. Essayez d'éviter d'endommager le carpelles pendant ce processus. 2. Choisir le donneur de pollen et de réaliser la pollinisation Les donateurs meilleurs pollen sont anthesed fleurs ouvertes au stade 14 avec les pétales s'étendant à angle de 90 ° au pistil (Smyth et al., 1990), dans lequel beaucoup de pollen est mue. Prenez la fleur à la base et juste au-dessus du pédoncule, qui va provoquer la fleur de répandre ouvert. La poussière du stigmate du pistil préparé avec l'anthère. Après la pollinisation, la stigmatisation sera couvert avec le pollen jaune, qui peut être facilement observés sous un microscope. 3. Étiquetage de la croix Après la pollinisation tous les pistils émasculée sur une plante, nous marquons la croix avec une étiquette de bijoux et d'information des parents masculins et féminins et la date. Placez une participation dans le sol près de l'usine, utilisez une chaîne pour attacher la tige de l'inflorescence au bûcher, et couvrir les pistils pollinisées avec un sac en plastique. II. Isolement des tissus endosperme chez Arabidopsis 1. Préparation des matériaux Nous obtenons habituellement des matériaux nécessaires avant la récolte de l'endosperme et les tissus d'embryon: un réservoir d'azote liquide, azote liquide, un microscope à dissection, deux nouvelles paires de pointe fine pince (5 INOX TSF par Dumont biologie, Suisse.), Des lames de verre de microscope ( 3 "x 1" x 1.0 mm), une solution de pH 5,7 à 0,3 M de sorbitol et 5 mM de MES. 2. Collecte des siliques A 7 - ou 8-jour-après-pollinisation (DAP), les graines sont prêtes à être récoltées à la mi-à fin stade torpille de l'embryogenèse et disséquées pour l'endosperme et l'embryon. Parfois, cela peut prendre 90 à 10 DAP si les fleurs sont trop jeunes émasculés. 3. Isoler l'endosperme et l'embryon Comme les graines d'Arabidopsis sont minuscules, on utilise un microscope à dissection pour isoler l'albumen et l'embryon. Mettez une silique 8-DAP sous un microscope, utilisez une pince pour tenir le pédoncule silique et utilisez la pointe d'une autre paire de pinces pour ouvrir le slide silique dans la marge, où fusionnent deux carpelles. Utilisez une paire de pinces pour ramasser une graine sur des solutions pH 5,7 de 0,3 M de sorbitol et 5 mM MES, faire une petite coupure à l'extrémité micropyle à glisser l'embryon, presser la fin uncut pour faire sortir l'endosperme et l'endosperme séparer de tégument (Kinoshita et al., 2004). Mettez l'embryon et l'endosperme dans des microtubes séparés dans l'azote liquide. Continuer ainsi jusqu'à ce que nous accumulons embryon ou l'albumen de 10 à 15 siliques et stocker ensuite le tube dans un congélateur à -80 ° C. Dans certains cas, l'albumen ne doit pas être séparé de tégument, c'est à dire, on peut isoler l'ARN total de l'endosperme et le mélange de tégument pour l'analyse des empreintes génétiques. III. Séquençage bisulfite 1. Réactifs nécessaires Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) pour la préparation de l'ADN génomique, des enzymes de restriction, 3 M NaOH (fraîchement faite), 6,42 M d'urée / 4 de bisulfite de sodium M (2 métabisulfite de sodium M, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5 Poids Moléculaire: 190), 10 mM d'hydroquinone, un kit de purification d'ADN (DNA Promega Wizard système de nettoyage, Cat. # A7280), un tampon TE, 6,3 M de NaOH (fraîchement préparé), 10 M NH 4 OAc, 20 ug / uL ARNt, et de l'éthanol à 100% . 2. Détails sur le protocole de traitement au bisulfite <ol><li> Isoler l'endosperme ou l'ADN génomique en utilisant une procédure d'embryon CTAB (Rogers et Bendich, 1988). </li><li> Recueil de 100 ng - 2 pg d'ADN génomique dans 20 uL à 100 uL volume total des enzymes de restriction qui coupent l'extérieur de la région pour être analysés. Pour le promoteur MEA, nous utilisons Xhol, Ndel et PstI ou HindIII. </li><li> Dénaturer les enzymes de restriction par l'ébullition de l'ADN pour cinq minutes, puis étancher sur la glace. </li><li> Ajouter le volume 1 / 9 (2,2 pour 20 uL d'ADN digérés uL) de 3 M NaOH et incuber à 37 ° C pendant 15 minutes. </li><li> Transférer la solution à un tube de PCR 250 uL. </li><li> Dissoudre 7,5 g d'urée dans 10 ml d'eau distillée stérile; Ajouter lentement 7,6 g de métabisulfite de sodium pendant 1-2 heures et de chauffage permet habituellement dissoudre; Ajuster le pH à 5 avec NaOH fraîchement préparé 10 M; Ajouter l'eau distillée stérile à une finale volume à 20 ml. C'est 6,24 M d'urée / solution 4 M de bisulfite de sodium. </li><li> Ajouter 6,24 M d'urée / solution 4 M de bisulfite de sodium à une concentration finale de 5,36 M et 3,44 M, respectivement (Paulin et al., 1998). Par exemple, ajouter 208 ul de 6,42 M d'urée / solution 4 M de bisulfite de sodium à ce qui précède 22,2 uL d'ADN génomique dénaturé (Xiao et al., 2003). </li><li> Ajouter 10 mM d'hydroquinone à l'ADN à une concentration finale de 0,5 mM (12 uL de 20 uL de digestion). </li><li> Conduite traitement au bisulfite dans une machine à PCR: 30 cycles de 55 ° C pendant 15 minutes et 95 ° C pendant 30 secondes. </li><li> Dessaler l'ADN au bisulfite traitées en utilisant l'ADN Assistant Nettoyage du système de Promega et le suivi du protocole (Jacobsen et al., 2000). </li><li> Mesurez le volume exact de TE récupéré de la colonne après dessalage et ajouter 6,3 M NaOH à une concentration finale de 0,3 M. Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes. </li><li> Ajouter 10 M NH 4 OAc (pH 7,0) à une concentration finale de 3 M, 2 pl de 20 ug / uL ARNt, et 3 volumes d'éthanol 100%, puis mélanger. Centrifuger pendant 15 minutes à 14000 rpm. </li><li> Laver le culot une fois avec 70% d'éthanol, une centrifugeuse ne court, et éliminer l'éthanol supplémentaire. </li><li> Culot sec dans une speedvac pendant 5-10 minutes et remettre en suspension dans 25 à 100 pi de tampon TE selon le montant de départ de l'ADN. Le bisulfite de sodium-traitée ADN est maintenant prêt pour l'analyse PCR. </li></ol> 3. L'amplification par PCR <ol><li> Depuis cytosines non méthylées sont converties en uracile, il est difficile pour amplifier un fragment volumineux à l'aide de l'ADN au bisulfite traitée comme un modèle. Ainsi, nous avons l'habitude concevoir des amorces pour amplifier un produit pas plus de 500 pb. Pour la séquence du promoteur de 4 kb MEA, nous avons conçu de nombreux ensembles d'amorces et amplifié 14 fragments qui se chevauchent pour couvrir toute la région (Xiao et al., 2003). </li><li> Pour la séquence du haut-brin, dans la conception d'une amorce de l'avant, I) choisir un G (guanine) région riche afin d'avoir une température plus élevée de recuit sans supplément nucléotides de long dans les amorces; II) le changement C (cytosine) à Y ( pyrimidine) à CG et contextes GNC et changer le C restant à T (thymine). Dans la conception d'une amorce antisens, I) choisissez une région C-riche; II) le changement G à R (purines) au CG et contextes GNC et le changement du G restant à A (adénine). </li><li> Pour séquencer le bas-brin, à concevoir une amorce sens, I) choisissez une région C-riche; II) le changement G à R à CG et contextes GNC et le changement du G restant à A. Dans la conception d'une amorce antisens, I) choisissent une région riche en G; II) le changement C à Y (pyrimidine) à CG et contextes GNC et changer le C restant à T. </li><li> Nous utilisons habituellement 1-2 uL de la bisulfite de sodium-traitée ADN comme un modèle pour chaque amplification par PCR (Xiao et al., 2003). Le produit de PCR doit être analysé par électrophorèse sur gel pour confirmer la bonne taille du fragment, puis d'être purifiés sur gel et cloné dans le clonage TOPO TA pCR2.1 vecteur (Invitrogen) comme un insert. Une seule colonie est ramassé et mis en culture; ADN plasmidique extrait et envoyé pour le séquençage. </li></ol> 4. L'analyse des séquences Le principe du séquençage au bisulfite est que la cytosine non méthylé sera convertie en uracile due à la désamination hydrolytique par une forte concentration de bisulfite de sodium à pH 5,0, qui sera amplifié comme la thymine dans le produit PCR, tandis que la 5-méthyl cytosine ne sera pas modifié par le bisulfite de sodium et restent à la cytosine après amplification par PCR (Clark et al, 1994;. Frommer et al, 1992).. Après l'obtention du résultat de séquençage, on le compare avec le modèle brin spécifique qui est utilisé pour l'amplification par PCR. Si un résidu cytosine dans le modèle se lit comme une thymine dans le résultat de séquençage, il indique que la cytosine n'est pas méthylé. Si un résidu cytosine dans le modèle reste une cytosine dans le séquençage, cela signifie que la cytosine est méthylée. IV. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="Figure 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1 /"> Figure 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

Il est relativement facile de séparer embryon à partir de l&#39;endosperme et tégument, mais il est fastidieux de séparer l&#39;endosperme du tégument, en particulier pour les semences à un stade précoce ou à mi-torpilles de l&#39;embryogenèse. Depuis tégument ne contribue qu&#39;à une très petite quantité de tissu, pour certains gènes, par exemple, la MEA et FWA, nous n&#39;avons pas de séparer l&#39;endosperme du tégument. Cela signifie que nous pouvons isoler les ARN à partir d&#39;un mélange de tis...

Fournitures <ul><li> Microscope à dissection </li><li> Ciseaux </li><li> Pince pointe fine </li><li> Tag bijoux </li><li> Enjeux des végétaux </li><li> String ou les attaches </li><li> 4 &quot;X 2&quot; X 8 sacs en polyéthylène &quot; </li><li> 3 &quot;X 1&quot; X 1,0 mm Lames de microscope </li><li> Azote liquide </li><li> Conteneurs d&#39;azote liquide </li><li> Bloc de chaleur </li><li> Tubes PCR </li><li> Thermocycleur </li><li> Microtubes à centrifuger </li><li> Microcentrifugeuse </li><li> Installation électrophorèse sur gel </li><li> Arabidopsis thaliana-0-Britannique Plantes </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plantes </li></ul> Réactifs <ul><li> L&#39;éthanol à 70% </li><li> L&#39;éthanol à 95% </li><li> L&#39;éthanol à 100% </li><li> 0,3 M de sorbitol et 5 mM MES pH 5,7 </li><li> Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) </li><li> L&#39;éthanol à 100% </li><li> Cholorform </li><li> Les enzymes de restriction </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6,3 M de NaOH </li><li> 6,24 M d&#39;urée / 4 de bisulfite de sodium M </li><li> Distillée stérile H 2 O </li><li> 10 mM d&#39;hydroquinone </li><li> Assistant DNA Clean-Up System (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 pg / uL ARNt </li><li> Tampon TE </li><li> Le kit de clonage TOPO TA (Invitrogen) </li></ul>

détermination de méthylation de l&#39;adn des gènes soumis à empreinte dans les arabidopsis endosperme

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana est un organisme excellent modèle pour étudier les mécanismes épigénétiques. Une des raisons est le mutant nul de perte de fonction de l&#39;ADN méthyltransférases est viable, offrant ainsi un système à étudier comment la perte de méthylation de l&#39;ADN dans un génome influe sur la croissance et le développement. Impression se réfère à l&#39;expression différentielle des allèles maternels et paternels et joue un rôle important dans le développement de la reproduction dans les deux mammifères et les plantes. Méthylation de l&#39;ADN est essentielle pour déterminer si les allèles maternels ou paternels d&#39;un gène est exprimé ou imprimé au silence. Dans les plantes à fleurs, il ya un événement double fécondation de la reproduction: un spermatozoïde fertilise l&#39;ovule pour former l&#39;embryon et un spermatozoïde fusionne avec la seconde cellule centrale pour donner naissance à l&#39;albumen. Endosperme est le tissu où se produit l&#39;empreinte dans les plantes. MEDEA, un domaine SET gènes du groupe Polycomb et FWA, un facteur de transcription régulant la floraison, sont les deux premiers gènes soumis à empreinte montré dans l&#39;endosperme et de leur expression est contrôlée par méthylation de l&#39;ADN et la déméthylation de plantes. Afin de déterminer le statut de l&#39;empreinte d&#39;un gène et le modèle de méthylation dans l&#39;albumen, nous devons être en mesure d&#39;isoler l&#39;albumen premier. Depuis semence est petite chez Arabidopsis, il reste difficile d&#39;isoler l&#39;albumen Arabidopsis et examiner sa méthylation. Dans ce protocole vidéo, nous présentons la façon de mener un croisement génétique, afin d&#39;isoler albumen de graines, et de déterminer le statut de méthylation par séquençage au bisulfite.

L&#39;imprinting est un phénomène dans l&#39;usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l&#39;ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l&#39;empreinte. Isoler l&#39;endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans les<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Il peut être difficile. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler l&#39;albumen et de déterminer la méthylation par séquençage au bisulfite.

Détermination de méthylation de l&#39;ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

*Arabidopsis thaliana* est un excellent organisme modèle pour l'étude des mécanismes épigénétiques. L'une des raisons en est le mutant nul à perte de fonction de l'ADN...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer l'état de méthylation de l'ADN des gènes empreints dans l'endosperme. Cette opération s'effectue tout d'abord en émasculant la plante femelle. Celle-ci est ensuite pollinisée à l'aide du pollen du parent mâle.Ensuite, l'endosperme est disséqué à partir de la graine issue d'un croisement. La dernière étape de la procédure consiste à réaliser un séquençage au bisulfite de l'ADN de l'endosperme. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'état de méthylation de l'ADN de l'allèle maternel ou paternel d'un gène empreint, grâce au polymorphisme de séquençage de l'ADN entre différents écotypes et au séquençage au bisulfite.Bonjour, je suis le Dr. Yang Shaw du Département de biologie de l'Université de Saint-Louis. Bonjour, je suis Matthew Ray du laboratoire du Dr. J et du Département de biologie de l'Université de Saint-Louis. Je suis Diman Panu du laboratoire du Dr. J.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de disséquer un officier de rugby et de déterminer l'état de méthylation de l'ADN par séquençage au bisulfite. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'empreinte génomique régulée par la méthylation et la déméthylation de l'ADN. Commençons donc.Pour commencer cette procédure, choisissez deux écotypes différents d'Arabidopsis afin de les utiliser comme parents femelle et mâle, respectivement, pour distinguer les allèles maternels et paternels à l'aide de polymorphismes de séquence d'ADN. Ici, Columbia zero et Landsberg Erecta sont choisis comme parents femelle et mâle, respectivement. Veillez à sélectionner des plantes jeunes et en bonne santé.Émasculer la plante femelle à l'aide d'un microscope stéréoscopique. Repérer les fleurs au stade 12 et retirer toutes les fleurs ou LIC situées au-dessus et au-dessous en coupant la base du pédoncule avec des ciseaux. Stériliser la pince en immergeant délicatement la base de la pointe dans un bécher contenant de l'éthanol à 95 %.Cela éliminera tout grain de pollen sur la pince et tuera le pollen. Ouvrez délicatement les bourgeons floraux à l’aide d’une pince et retirez soigneusement quatre sépales, quatre pétales et six étamines, en laissant le pistil nu et intact. Essayez d’éviter d’endommager les carpelles durant cette opération.L'étape suivante consiste à choisir le donneur de pollen et à réaliser la pollinisation. Les meilleurs donneurs sont les fleurs ouvertes au stade 14, dont les pétales s'étendent selon un angle de 90 degrés par rapport au pistil, et qui libèrent une grande quantité de pollen. Saisissez la fleur à la base et juste au-dessus du pédoncule, ce qui provoquera l'ouverture de la fleur et la dispersion du pollen. Appliquez ensuite le stigmate du pistil préparé sur l'anthère.Après la pollinisation, le stigmate sera recouvert de pollen jaune, facilement observable au microscope. Après avoir pollinisé tous les pistils émasculés sur une plante, identifier le croisement à l’aide d’une étiquette de bijouterie. Indiquer la date ainsi que les informations concernant les parents femelle et mâle.Placer un tuteur dans le sol près de la plante. Utiliser une ficelle pour attacher la tige de la plante au tuteur et recouvrir les pistils pollinisés d'un sac en plastique. Sept ou huit jours après la pollinisation (DAP), les graines devraient être prêtes à être récoltées au stade moyen ou tardif de l'embryogenèse en forme de torpille et disséquées.Pour l'endosperme et l'embryon, placer un grain de salic à huit JAF sous le microscope stéréoscopique. À l'aide d'une paire de pinces, tenir la cellule EK P et utiliser la pointe d'une autre paire de pinces pour écarter la semelle à la marge, là où les deux carpelles fusionnent. Utiliser une paire de BPS pour prélever un grain et le déposer sur une lame en verre.Ensuite, effectuez une petite incision à l'extrémité du micro-tube pour en extraire l'embryon. Pressez l'extrémité non coupée afin d'expulser l'endosperme et séparez-le de l'enveloppe du grain. Puis, placez l'embryon et l'endosperme dans des micro-tubes séparés contenant de l'azote liquide.Continuez ainsi jusqu'à ce qu'un nombre suffisant d'embryons ou d'endospermes soit accumulé à partir de 10 à 15 CLICs. Ensuite, conservez les tubes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius avant le traitement au bisulfite. Isolez l'ADN génomique de l'endosperme ou de l'embryon à l'aide d'une procédure au bromure de triméthylammonium ou à base de CTAB.Une fois l'ADN génomique de l'endosperme isolé, digérer 100 nanogrammes dans une réaction au volume total de 20 microlitres à l'aide d'enzymes de restriction qui coupent en dehors de la région à analyser. Pour le promoteur ME, les enzymes de restriction XhoI, HindI et PSTI sont utilisées. Dénaturer les enzymes de restriction en faisant bouillir l'ADN pendant cinq minutes.Ensuite, arrêter la réaction sur de la glace. Ajouter un neuvième du volume ou 2,2 microlitres de soude à trois molarités et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l'incubation, transférer la solution dans un tube PCR de 250 microlitres.Ensuite, préparez une solution d'urée à 6,24 molaire. Une solution de sulfite de sodium à 4 molaire en dissolvant 7,5 grammes d'urée dans 10 millilitres d'eau distillée stérile, puis lentement 7,6 grammes de méta-sulfite de sodium sur une à deux heures, tout en chauffant et en agitant la solution. Une fois dissous, ajustez le pH à 5 à l'aide d'une solution fraîchement préparée d'hydroxyde de sodium à 10 molaire.Ajouter de l'eau distillée stérile jusqu'à un volume final de 20 millilitres. Transférer 208 microlitres de cette solution dans 22,2 microlitres d'ADN génomique d'endosperme dénaturé. Puis ajouter 12 microlitres d'hydroquinone fraîchement préparée à 10 millimolaire à l'ADN.Réalisez le traitement au bisulfite dans un thermocycleur avec 30 cycles à 55 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivis de 95 degrés Celsius pendant 30 secondes. Ensuite, désalez l'ADN traité au bisulfite à l'aide du système Wizard de purification de l'ADN de Promega. Conformément aux instructions du fabricant, mesurez le volume exact de tampon TE récupéré à partir de la colonne après la désalification.Ensuite, ajouter de l'hydroxyde de sodium 6,3 molaire pour obtenir une concentration finale de 0,3 molaire. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l'incubation, ajouter de l'acétate d'ammonium 10 molaire pour atteindre une concentration finale de 3 molaire, deux microlitres d'ARNt à 20 microgrammes par microlitre et trois volumes d'éthanol à 100 %.Mélangez l'échantillon et centrifugez pendant 15 minutes à 14 000 tr/min. Lavez le culot une fois avec de l'éthanol à 70 %, puis effectuez une courte centrifugation pour éliminer l'excès d'éthanol. Finalement, séchez le culot dans un évaporateur sous vide pendant cinq minutes et remettez-le en suspension dans 25 microlitres de tampon TE.L'ADN traité au bisulfite de sodium est désormais prêt pour l'analyse par PCR. Pour séquencer le promoteur Madea de quatre kilobases, concevoir plusieurs jeux d'amorces et amplifier 14 fragments chevauchants afin de couvrir toute la région. Commencer par concevoir une amorce sens pour séquencer le brin supérieur.Tout d'abord, choisissez une région riche en guanine afin d'obtenir une température d'hybridation plus élevée sans nucléotides excessivement longs dans les amorces. Ensuite, remplacez la cytosine par de la thymine dans les contextes CG et CNG. Puis, remplacez toute autre cytosine par de la thymine.Lors de la conception d'un amorçage reverse, choisissez une région riche en cytosine. Remplacez la guanine par une purine dans les contextes CG et CNG, et toute autre guanine par de l'adénine. Pour séquencer à nouveau le brin inférieur, commencez par concevoir un amorçage direct.Choisissez une région riche en cytosine et remplacez les guanines par des purines dans les contextes CG et CNG. Remplacez les autres guanines par de l'adénine. Lors de la conception de l'amorce reverse, choisissez une région riche en AINE.Transformer la cytosine en paridine dans les contextes CG et CNG, et convertir les cytosines restantes en thymine. Une fois les amorces conçues, préparer une réaction PCR en utilisant deux microlitres d'ADN traité au bisulfite de sodium comme matrice pour chaque amplification PCR. Faire tourner la réaction PCR et analyser le produit par électrophorèse sur gel afin de confirmer la taille correcte du fragment.Gel suivant. Purifiez le produit PCR et clonez-le dans le vecteur de clonage topo TA in vitro PCR 2.1. En tant qu'insert, séquençez des clones individuels. Le principe du séquençage par bisulfite est que la cytosine non méthylée sera convertie en uracile en raison de la déamination hydrolytique par une concentration élevée de bisulfite de sodium à pH 5,0.En revanche, la cytosine méthylée ne sera pas modifiée par le sulfite de sodium. L'uracile sera amplifié comme une thymine dans le produit de PCR, tandis que la cytosine méthylée restera une cytosine après l'amplification par PCR. Après obtention du résultat de séquençage, comparez-le avec le brin matrice spécifique utilisé pour l'amplification par PCR.Si un résidu de cytosine dans le brin matrice apparaît comme une thymine dans le résultat du séquençage, cela indique que la cytosine n'est pas méthylée. Si un résidu de cytosine dans le brin matrice reste une cytosine dans le résultat du séquençage, cela signifie que la cytosine est méthylée. L'état de méthylation de l'allèle MEA maternel dans la région située à moins 500 paires de bases du promoteur de MEA, pour cinq sites CpG méthylés dans les clones séquencés de Columbia, g Clarus croisé avec l'endosperme de RLD, est indiqué : les cytosines méthylées sont représentées par des cercles noirs pleins et les cytosines non méthylées par des cercles blancs vides. De même, l'état de méthylation de l'allèle maternel Madea de Columbia, Gladys croisé avec l'embryon de RLD, est indiqué.Nous venons de vous montrer comment isoler l'endosperme et réaliser un séquençage par sulfite lors de cette procédure. Il est important de se rappeler de suivre correctement le protocole. Voilà donc tout ce qu'il y a à savoir.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Un flux de travail simplifié pour étudier méthylation de l'ADN et des modifications d'expression des gènes lors de début de la vie de stress est montré. A partir de la séparation maternelle des souriceaux nouveau-nés et l'isolement des tissus cérébraux distincts, nous représentons un protocole à la fois isoler l'ADN et l'ARN à partir de poinçons de tissus cérébraux pour le séquençage du bisulfite de suite et analyse RT-PCR.

Analyse de la méthylation de l&#39;ADN Optimisé et d&#39;expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement...

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

Nous présentons la procédure pour assembler une literie de manteau essai de semences (ARA) de Arabidopsis thaliana graines. L'ARA s'est révélée être un outil puissant pour explorer génétiquement in vitro et la façon dont la germination des contrôles de l'endosperme de graines en dormance des graines et en réponse à des signaux lumineux. L'ARA est en principe applicable en vertu d'une situation où l'endosperme est soupçonné d'influencer la croissance embryonnaire.

Un tégument Literie dosage à explorer génétiquement<em&gt; In Vitro</em&gt; Comment la germination des contrôles endosperme des semences dans<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante pour l'identification des sites d'ADN d'Arabidopsis protéines de liaison in vivo. Cette procédure comprend la réticulation de la chromatine et la fragmentation, une immunoprécipitation avec des anticorps sélectifs contre la protéine d'intérêt, et l'analyse qPCR de l'ADN lié. Nous décrivons un test simple de ChIP optimisé pour les plantes d'Arabidopsis.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Nouvellement découvert des formes oxydées de la 5-méthylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) peut-être représenter des modifications d’ADN distinctes avec des rôles fonctionnels uniques. Un workflow semi quantitatif pour la visualisation de la répartition spatiale des oxi-mCs, profilage d’intensité de signal et colocalisation est décrit ici.

Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

L’essai méthylé d’immunoprécipitation d’ARN est une méthode anticorps-basée employée pour enrichir pour des fragments méthylés d’ARN. Couplé à un séquençage profond, il conduit à l’identification des transcriptions portant la modification m5C.

Essai méthylé d’immunoprécipation d’ARN pour étudier la modification m5C dans Arabidopsis

La présente étude décrit le flux de travail pour gérer les données de méthylation de l’ADN obtenues par les technologies de microréseaux. Le protocole illustre les étapes allant de la préparation de l’échantillon à l’analyse des données. Toutes les procédures sont décrites en détail et la vidéo montre les étapes importantes.

Préparation d’échantillons à l’analyse bioinformatique de la méthylation de l’ADN: stratégie d’association pour l’obésité et les études sur les traits connexes

Ce protocole décrit la préparation d’échantillons intacts de la couche de cellules de l’endosperme dans les graines d’Arabidopsis thaliana . La méthode ne nécessite que l’équipement de laboratoire courant, tel qu’une aiguille d’injection et des pinces de précision, et permet l’imagerie fluorescente haute résolution de cellules vivantes de cellules endospermiennes dans les graines en développement et matures.

Préparation de tissu intact pour l’analyse microscopique de la couche de cellules de l’endosperme dans des graines d’Arabidopsis en développement et matures

Découvrez comment déterminer la méthylation de l'ADN des gènes soumis à empreinte dans l'endosperme d'Arabidopsis. Cette méthode combine dissection et séquençage par bisulfite pour analyser les mécanismes d'empreinte génétique.

Détermination de méthylation de l'ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

Explorer plus de vidéos