Name: La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Apprenez à produire des transgènes chez C. elegans par recombinaison homologue avec le marqueur GalK. Cette méthode rapide préserve les éléments régulateurs natifs pour une expression précise.

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Les auteurs tiennent à remercier Lindsey Nash pour les aider à développer la technique. Ce travail a été financé par le NIH octroi AG028977 à Alf, une subvention de projet pilote de l&#39;Université de Pittsburgh OAIC (AG024827), et fonds d&#39;amorçage de l&#39;Université de Pittsburgh.

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<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
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<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
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<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
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<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
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</ol>

La génération des transgènes de fosmides offre l&#39;avantage de conserver l&#39;ensemble des éléments promoteur natif, les variants d&#39;épissage, et 3 &#39;UTR éléments réglementaires. Cela peut conduire à la construction d&#39;un transgène qui est plus représentatif de la tendance d&#39;expression maternelle, ou la construction d&#39;un transgène fonctionnel lorsque d&#39;autres approches échouent 5. Les transgènes qui en résulte peut mener une série de balises épitope incluant la GFP ou une étiquette TAP...

<table><tbody><tr><td>Kits FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Milieu MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>Solution de phosphate de potassium 0,132 M</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-désoxygalactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Polymérase Phusion de l'ADN</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>Base d'agar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

la production de c. elegans les transgènes via recombineering avec le galk marqueurs de sélection

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

La création d&#39;animaux transgéniques est largement utilisée en C. la recherche elegans y compris l&#39;utilisation de protéines de fusion GFP pour étudier la régulation et de profil d&#39;expression de gènes d&#39;intérêt ou de génération de purification d&#39;affinité en tandem (TAP) taggés versions de gènes spécifiques pour faciliter leur purification. Typiquement transgènes sont générés en plaçant un promoteur en amont d&#39;un gène rapporteur GFP ou de l&#39;ADNc d&#39;intérêt, et cela produit souvent un motif d&#39;expression représentant. Toutefois, des éléments critiques de la régulation des gènes, tels que les éléments de contrôle dans la région 3 &#39;non traduite ou promoteurs alternatifs, pourraient être manquées par cette approche. En outre seul un variant d&#39;épissage unique peut être généralement étudiés par ce moyen. En revanche, l&#39;utilisation de l&#39;ADN génomique ver porté par des clones d&#39;ADN fosmide inclut probablement la plupart sinon tous les éléments impliqués dans la régulation des gènes in vivo qui permet la plus grande capacité à capter le profil d&#39;expression authentique et le calendrier. Afin de faciliter la génération de transgènes en utilisant l&#39;ADN fosmide, nous décrivons un E. coli procédure basée sur recombineering d&#39;insérer la GFP, un TAP-tag, ou d&#39;autres séquences d&#39;intérêt dans n&#39;importe quel endroit dans le gène. La procédure utilise le gène galK comme marqueur de sélection pour les deux étapes de sélection positive et négative dans recombineering qui aboutit à l&#39;obtention de la modification souhaitée avec une grande efficacité. En outre, des plasmides contenant le gène galK flanqué par des bras d&#39;homologie à la GFP couramment utilisés et TAP gènes de fusion sont disponibles, qui réduisent le coût des oligos de 50% lors de la génération une protéine de fusion GFP ou TAP. Ces plasmides utiliser l&#39;origine de réplication R6K, qui exclut la nécessité d&#39;une purification complète de produits de PCR. Enfin, nous avons également démontrer une technique pour intégrer le marqueur unc-119 à la colonne vertébrale qui permet à l&#39;fosmide fosmide d&#39;être directement injectés ou bombardés en vers pour générer des animaux transgéniques. Cette vidéo montre les procédures impliquées dans la génération d&#39;un transgène par le biais recombineering utilisant cette méthode.

La capacité de produire des transgènes<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En utilisant l&#39;ADN génomique porté par fosmides est particulièrement intéressante car tous les éléments natifs réglementaires sont conservés. Décrite est une procédure simple et robuste pour la production de transgènes via recombineering avec le<em&gt; GalK</em&gt; Marqueur de sélection.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

La création d'animaux transgéniques est largement utilisée dans la recherche sur C. elegans, notamment par l'emploi de protéines de fusion GFP pour étudier la régulation et ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer des transgènes en utilisant l'ADN génomique de vers porté par un clone de bibliothèque SMID. L'utilisation de l'ADN génomique préserve tous les éléments de régulation natifs, tels que les activateurs situés dans les régions UTR trois primes. Ceci est réalisé en transférant le smid FO dans la souche de E. coli SW106 afin d'utiliser le système de recombinaison lambda red inductible.En second lieu, le gène GAL K est inséré à l'emplacement souhaité dans le FO smid, ce qui marque le site où la GFP ou la balise tap sera placée. Ensuite, le gène Gade est remplacé par la GFP ou une balise tap TAC par recombinaison homologue, suivie d'une sélection négative à l'aide de galactose désoxy pour créer le transgène modifié. Les résultats obtenus montrent que ces transgènes peuvent être créés rapidement et avec succès, comme en témoigne la vérification de l'insertion T par PCR de colonies.Bonjour, je m'appelle Love Ship. Je travaille au laboratoire Fisher à l'Université de Pittsburgh. Aujourd'hui, je démontre la technique permettant d'obtenir un transgène chez C. elegans.Pourquoi une recombinaison avec GK comme marqueur sélectionnable. Le

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