La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des transgènes à l’aide de l’ADN génomique du ver transporté dans un clone de banque SMID. L’utilisation de l’ADN génomique préserve tous les éléments de contrôle natifs tels que les amplificateurs dans trois régions UTR principales. Ceci est réalisé en déplaçant le FO smid dans la souche SW 1 0 6 E coli pour utiliser la machinerie de recombinaison rouge lambda inductible.

Dans un deuxième temps, le gène GAL K est inséré à l’endroit souhaité dans le smid FO, qui marque le site où la GFP ou l’étiquette de robinet sera placée. Ensuite, le gène Gade est remplacé par la GFP ou un TAC tap par recombinaison homologue, suivie d’une sélection négative à l’aide du désoxy galactose afin de créer le transgène modifié. Des résultats sont obtenus qui montrent que ces transgènes peuvent être créés rapidement et avec succès sur la base de la vérification de l’insertion de T par PCR de colonie.

Bonjour, je m’appelle Love Ship. Je travaille au Fisher Lab de l’Université de Pittsburgh. Aujourd’hui, je fais une démonstration de la technique de fabrication du transgène C elegant.

Pourquoi recombiner avec GK comme marqueur sélectionnable. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de création de transgènes de Cogan est que dans cette technique, nous utilisons l’ADN génomique du gène d’intérêt et sommes donc en mesure de couvrir tous les éléments critiques de la régulation des gènes, tels que les éléments de contrôle dans trois régions UTR principales, les transcrits d’épices alternatifs, les promoteurs alternatifs et les réponses distales qui pourraient être manquées dans les approches conventionnelles basées sur le clonage standard. Alors commençons.

Commandez le clone FO smid pour le gène d’intérêt ou GOI à partir du service de gènes en utilisant Worm Base comme guide. Lors de la sélection des clones, nous choisissons ceux qui ont le GOI au centre de la séquence. Les clones qui excluent les gènes voisins peuvent être préférables, mais peuvent être difficiles à cultiver.

Le clone SMID pour le GOI en LB contenant 12,5 microgrammes par millilitre de chloramphénicol, les smid sont envoyés dans la souche EPI 300 et peuvent être cultivés à 37 degrés Celsius. Ensuite, cultivez une culture nocturne de 1,5 millilitre de SMID à 37 degrés Celsius et préparez mini l’ADN du smid. À l’aide du kit de préparation Epicenter SMID, nous suivons le protocole alternatif décrit dans les instructions, qui consiste à ajouter le mélange plus court de Ribo.

L’utilisation d’un champ de spectrophotomètre est généralement très faible mais adéquate. Pour une électroporation réussie. Préparez des cellules SW 1 0 6 électro-compétentes en cultivant une culture nocturne de cinq millilitres dans un milieu LB à 32 degrés Celsius dans un tube à bouchon pression de 14 millilitres.

Le lendemain matin. Inoculez un millilitre de la culture dans 100 millilitres de lb dans une fiole de deux litres. Cultiver SW 1 0 6 bactéries jusqu’à un OD 600 de 0,6 à 0,8.

Ne pas choquer thermiquement. Granulez les cellules par centrifugation à 5 000 G pendant cinq minutes. Remettre le granulé en suspension par un léger tourbillon dans un millilitre de glycérol 10 % glacé.

Ajoutez ensuite 50 millilitres de glace froide, 10 % de glycérol. Répétez cette étape de lavage une fois. Enfin, granulez à nouveau le SW 1, 0, 6 par centrifugation et DEC ne peut pas tout, sauf environ 500 microlitres de chaque surnageant Resus.

Suspendez les granulés par vortex doux, congelez 100 microlitres Ali Watts dans de l’azote liquide ou sur de la glace sèche et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être transformés. Transformez l’ADN du fosson en cellules SW 1 0 6 électro-compétentes en électro-paradant les bactéries avec environ 50 nanogrammes d’ADN fos dans des cuvettes à 0,1 centimètre d’écart à l’aide d’un électro perter EOR 25 10 à 1 350 volts. Récupérez les bactéries dans un millilitre de LB pendant une heure à 32 degrés Celsius, mettez Eloqua sur des plaques LB avec du chloramphénicol et incubez à 32 degrés Celsius pendant la nuit.

Vérifiez la présence du gène d’intérêt à l’aide de la PCR de colonie en cultivant une culture de nuit de cinq millilitres dans LB avec 12,5 microgrammes par millilitre de chloramphénicol à 32 degrés Celsius. Ensuite, à 0,5 microlitre de la culture, à une réaction PCR standard avec les oligonucléotides flanquants et à augmenter l’incubation initiale à 95 degrés Celsius à cinq minutes pour trancher les bactéries avant la réaction. Enfin, préparez un stock de glycérol pour un stockage à long terme afin d’insérer le gène gal K dans le smid FO portant votre gène d’intérêt.

Tout d’abord, préparez des plaques de support minimal contenant 0,2 % de galactose. Voir la partie écrite de ce protocole pour la recette. Ensuite, amplifiez la cassette P mod quatre gal, k, g ou P mod quatre gal K GT.

Nous utilisons du gel fusion ou go tac. Purifier le produit PCR obtenu. Quantifiez le rendement sur un gel ou à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop.

Conservez le produit PCR à quatre degrés Celsius jusqu’au moment de l’emploi, inoculez cinq millilitres de et chloramphénicol avec SW 1 0 6 cellules contenant l’ADN Foss se développent pendant la nuit à 32 degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de culture de nuit à 100 millilitres de lb et de chloramphénicol. Dans une fiole de deux litres, croître jusqu’à une OD de 0,6 à 0,8.

Cela prend généralement trois à quatre heures pendant que la culture se développe. Réglez un bain-marie à 42 degrés Celsius pour vous réchauffer avec une fiole stérile de 250 millilitres dans le support. L’utilisation d’un bain-marie agité pour l’étape suivante est essentielle pour obtenir une efficacité élevée.

Ensuite, transférez 50 millilitres de la culture SW 1 0 6 dans le ballon de 250 millilitres et effectuez un choc thermique à 42 degrés Celsius et 100 tr/min pendant exactement 20 minutes dans le bain-marie agitant. Laissez les bactéries restantes à 32 degrés Celsius pour les utiliser comme contrôle induit. Refroidissez les bactéries induites et non induites sur de la glace pendant 10 minutes.

Transférez les échantillons dans deux tubes à centrifuger stériles et granulez à environ 5 000 G pendant cinq minutes. Videz tout le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de glycérol froid à 10 % par un léger vortex. Ajoutez encore 49 millilitres de glace froide, 10 % de glycérol.

Répétez ce lavage puis granulez une fois de plus. Retirez le surnageant en inversant les tubes et remettez la pastille en suspension dans la petite quantité restante d’Eloqua liquide dans des échantillons de 100 microlitres. Congelez sur de la glace sèche et conservez-le à moins 80 degrés Celsius le lendemain.

Electro parade, le SW 1 0 6 induits et non induits avec 150 nanogrammes du produit PCR préparé à l’aide de cuvettes à espace de 0,1 centimètre dans un électro-rabot einor de 25 tonnes. Réglé à 1 350 volts. Récupérez les bactéries dans un millilitre de LB dans un tube Falcon de 14 millilitres.

Incuber à 32 degrés Celsius pendant quatre heures et demie après l’incubation : granuler les bactéries à 13, 200 tr/min pendant 15 secondes et remettre en suspension dans un milieu M neuf. Veuillez vous référer à la partie écrite de ce protocole pour la recette. Répétez cette étape de lavage deux fois.

Pour éliminer tout milieu riche, granulez les cellules une fois de plus puis mettez-les en suspension dans un millilitre de M neuf avant de placer la dilution en série sur des vadrouilles. Incuber trois à cinq jours à 32 degrés Celsius dans un incubateur. Soyez patient pendant que les vrais positifs grandissent lentement, stiez une colonie sur la gélose de Macon pour purifier la colonie et vérifier qu’elle est GLK positive.

Les colonies doivent devenir rose vif. Choisissez une seule colonie et inculquez une culture de nuit de cinq millilitres de chloramphénicol incubée à 32 degrés Celsius. Confirmez l’insertion de la cage au bon endroit par PCR à l’aide des oligos flanquants.

Se reporter au tableau un de la partie écrite du présent protocole. Pour les séquences oligo, ajoutez 0,5 microlitre de la culture à une réaction PCR standard et augmentez l’incubation initiale à 95 degrés Celsius à cinq minutes pour éliminer les bactéries. Le produit de PCR doit être de taille supérieure en raison de la présence du gène GAL K.

Enfin, préparez le stock de glycérol pour le stockage. Préparez des plaques de média minimal contenant 0,2 % de désoxy galactose ou DOG et 0,2 % de glycérol. Voir la partie écrite de ce protocole pour la recette. La PCR.

Amplifiez les fragments de balise du PMO 4G FP PBS 1761 ou PBS 1479 en utilisant les mêmes oligos que ceux utilisés lors du premier tour ou en utilisant des oligos GFP plus courts ou des oligos spécifiques au taraudage. Si vous effectuez plusieurs constructions, il est particulièrement utile d’utiliser les oligonucléotides les plus courts, car le même produit PCR peut être utilisé pour toutes les constructions de gel. Purifier le produit de PCR et mesurer la concentration sur un gel ou à l’aide d’un spectrophotomètre générer des cellules W 1 0 6 compétentes induites et non induites portant le SMID avec le gène Gale K comme décrit précédemment, manger les cellules SW 1 0 6 induites et induites par l’urine avec environ 100 nanogrammes de produit de PCR à l’aide d’un intervalle de 0,1 centimètre Q vets dans un ateur EINOR 25 10 fixé à 1, 350 volts.

Récupérez dans un millilitre de VG dans un tube à pression de 14 millilitres et incubez dans un agitateur à 32 degrés Celsius pendant quatre heures et demie. Lavez et diluez les cellules dans M neuf comme indiqué précédemment. Placez les bactéries sur des vadrouilles, un milieu minimal contenant 0,2 % de chien et 0,2 % de glycérol, incubez les plaques à 32 degrés Celsius pendant trois jours pour confirmer la présence de l’insertion.

Utilisez quatre colonies pour inoculer cinq millilitres de cultures de nuit dans LB avec 12,5 microgrammes par millilitre. Chloramphénicol effectuer la PCR de colonie comme décrit précédemment. Nous utilisons à la fois les oligos spécifiques au robinet GFP plus courts et les oligos flanquants pour démontrer le bon insert et le bon site.

La GFP est d’environ 800 paires de bases. Le TAP est d’environ 550 paires de base et le gal KT est de 1,4. Les kilobases préparent enfin un stock de glycérol pour un stockage à long terme.

La modification de FO smed par recombinaison donne des résultats robustes et des taux de réussite supérieurs à 90 % dans l’étape de sélection négative sont régulièrement observés. De plus, ce protocole prend environ deux semaines, ce qui rend la préparation des transgènes assez rapide, montrant nos 48 colonies identifiées sur des plaques DOG et utilisées pour la PCR de colonie à l’aide du drapeau GFP Oligos, qui a amplifié l’insert GFP dans cette expérience. 47 des 48 colonies sont correctes et une colonie n’est pas correctement modifiée, 48 colonies identifiées sur des plaques DOG et utilisées pour la PCR des colonies à l’aide de l’indicateur GFP Oligos, qui a amplifié l’insert GFP dans cette expérience.

46 colonies sur 48 sont correctes et deux colonies ne sont pas correctement modifiées. Le point le plus important à garder à l’esprit lors de la réalisation de cette expérience est que la bactérie SW 1 0 6 doit être cultivée à 32 degrés Celsius et non à des températures plus élevées, car la croissance à une température plus élevée sélectionnera des mutants avec des mutations altérant la machinerie rouge Lambda. Alors bonne chance pour votre expérience.