Name: La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Apprenez à produire des transgènes chez C. elegans par recombinaison homologue avec le marqueur GalK. Cette méthode rapide préserve les éléments régulateurs natifs pour une expression précise.

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Les auteurs tiennent à remercier Lindsey Nash pour les aider à développer la technique. Ce travail a été financé par le NIH octroi AG028977 à Alf, une subvention de projet pilote de l&#39;Université de Pittsburgh OAIC (AG024827), et fonds d&#39;amorçage de l&#39;Université de Pittsburgh.

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</ol>

La génération des transgènes de fosmides offre l&#39;avantage de conserver l&#39;ensemble des éléments promoteur natif, les variants d&#39;épissage, et 3 &#39;UTR éléments réglementaires. Cela peut conduire à la construction d&#39;un transgène qui est plus représentatif de la tendance d&#39;expression maternelle, ou la construction d&#39;un transgène fonctionnel lorsque d&#39;autres approches échouent 5. Les transgènes qui en résulte peut mener une série de balises épitope incluant la GFP ou une étiquette TAP...

<table><tbody><tr><td>Kits FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Milieu MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>Solution de phosphate de potassium 0,132 M</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-désoxygalactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Polymérase Phusion de l'ADN</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>Base d'agar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

la production de c. elegans les transgènes via recombineering avec le galk marqueurs de sélection

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

La création d&#39;animaux transgéniques est largement utilisée en C. la recherche elegans y compris l&#39;utilisation de protéines de fusion GFP pour étudier la régulation et de profil d&#39;expression de gènes d&#39;intérêt ou de génération de purification d&#39;affinité en tandem (TAP) taggés versions de gènes spécifiques pour faciliter leur purification. Typiquement transgènes sont générés en plaçant un promoteur en amont d&#39;un gène rapporteur GFP ou de l&#39;ADNc d&#39;intérêt, et cela produit souvent un motif d&#39;expression représentant. Toutefois, des éléments critiques de la régulation des gènes, tels que les éléments de contrôle dans la région 3 &#39;non traduite ou promoteurs alternatifs, pourraient être manquées par cette approche. En outre seul un variant d&#39;épissage unique peut être généralement étudiés par ce moyen. En revanche, l&#39;utilisation de l&#39;ADN génomique ver porté par des clones d&#39;ADN fosmide inclut probablement la plupart sinon tous les éléments impliqués dans la régulation des gènes in vivo qui permet la plus grande capacité à capter le profil d&#39;expression authentique et le calendrier. Afin de faciliter la génération de transgènes en utilisant l&#39;ADN fosmide, nous décrivons un E. coli procédure basée sur recombineering d&#39;insérer la GFP, un TAP-tag, ou d&#39;autres séquences d&#39;intérêt dans n&#39;importe quel endroit dans le gène. La procédure utilise le gène galK comme marqueur de sélection pour les deux étapes de sélection positive et négative dans recombineering qui aboutit à l&#39;obtention de la modification souhaitée avec une grande efficacité. En outre, des plasmides contenant le gène galK flanqué par des bras d&#39;homologie à la GFP couramment utilisés et TAP gènes de fusion sont disponibles, qui réduisent le coût des oligos de 50% lors de la génération une protéine de fusion GFP ou TAP. Ces plasmides utiliser l&#39;origine de réplication R6K, qui exclut la nécessité d&#39;une purification complète de produits de PCR. Enfin, nous avons également démontrer une technique pour intégrer le marqueur unc-119 à la colonne vertébrale qui permet à l&#39;fosmide fosmide d&#39;être directement injectés ou bombardés en vers pour générer des animaux transgéniques. Cette vidéo montre les procédures impliquées dans la génération d&#39;un transgène par le biais recombineering utilisant cette méthode.

La capacité de produire des transgènes<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En utilisant l&#39;ADN génomique porté par fosmides est particulièrement intéressante car tous les éléments natifs réglementaires sont conservés. Décrite est une procédure simple et robuste pour la production de transgènes via recombineering avec le<em&gt; GalK</em&gt; Marqueur de sélection.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

La création d'animaux transgéniques est largement utilisée dans la recherche sur C. elegans, notamment par l'emploi de protéines de fusion GFP pour étudier la régulation et ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer des transgènes en utilisant l'ADN génomique de vers porté par un clone de bibliothèque SMID. L'utilisation de l'ADN génomique préserve tous les éléments de régulation natifs, tels que les activateurs situés dans les régions UTR trois primes. Ceci est réalisé en transférant le smid FO dans la souche de E. coli SW106 afin d'utiliser le système de recombinaison lambda red inductible.En second lieu, le gène GAL K est inséré à l'emplacement souhaité dans le FO smid, ce qui marque le site où la GFP ou la balise tap sera placée. Ensuite, le gène Gade est remplacé par la GFP ou une balise tap TAC par recombinaison homologue, suivie d'une sélection négative à l'aide de galactose désoxy pour créer le transgène modifié. Les résultats obtenus montrent que ces transgènes peuvent être créés rapidement et avec succès, comme en témoigne la vérification de l'insertion T par PCR de colonies.Bonjour, je m'appelle Love Ship. Je travaille au laboratoire Fisher à l'Université de Pittsburgh. Aujourd'hui, je démontre la technique permettant d'obtenir un transgène chez C. elegans.Pourquoi une recombinaison avec GK comme marqueur sélectionnable. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de création de transgènes Cogan est que nous utilisons dans cette technique l'ADN génomique du gène d'intérêt et sommes ainsi en mesure de couvrir tous les éléments essentiels de la régulation génique, tels que les éléments régulateurs dans la région UTR trois prime, les transcrits d'épissage alternatif, les promoteurs alternatifs et les régions distales, qui pourraient être omis dans les approches conventionnelles basées sur le clonage standard. Commençons donc.Commandez le clone smid FO pour le gène d'intérêt ou GOI auprès d'un service de gènes en utilisant Worm Base comme guide. Lors du choix des clones, nous sélectionnons ceux pour lesquels le GOI se trouve au centre de la séquence. Les clones qui excluent les gènes voisins pourraient être préférables, mais pourraient être difficiles à trouver en culture.Le clone SMID pour le GOI dans du LB contenant 12,5 microgrammes par millilitre de chloramphénicol, les smid sont envoyés dans la souche EPI 300 et peuvent être cultivés à 37 degrés Celsius. Ensuite, faire croître une culture de 1,5 millilitre pendant la nuit du SMID à 37 degrés Celsius et purifier l'ADN smid par mini-prep. À l'aide du kit de préparation SMID Epicenter, nous suivons le protocole alternatif décrit dans les instructions, qui consiste à ajouter le mélange Ribo shorter à une étape plus précoce. Déterminer la concentration en ADN FOSS à ce stade.L'utilisation d'un spectrophotomètre, le champ est généralement très faible mais adéquat. Pour une électroporation réussie, préparez des cellules électrocompétentes SW106 en cultivant une culture de cinq millilitres en milieu LB pendant la nuit à 32 degrés Celsius dans un tube de 14 millilitres à bouchon vissable.Le lendemain matin, inoculer un millilitre de la culture dans 100 millilitres de lb dans un flacon de deux litres. Faire croître les bactéries SW 1 0 6 jusqu'à une DO 600 comprise entre 0,6 et 0,8.Ne pas effectuer de choc thermique. Récupérer les cellules par centrifugation à 5 000 G pendant cinq minutes. Resuspendre le culot par vortexage doux dans un millilitre de glycérol à 10 % glacé.Ensuite, ajoutez 50 millilitres de glycérol à 10 % glacé. Répétez cette étape de lavage une fois. Finalement, récupérez les cellules SW 1 0 6 par une nouvelle centrifugation et retirez tout le surnageant sauf environ 500 microlitres de chaque échantillon pour la resuspension.Suspendez les culots par vortexage doux, puis congélez 100 microlitres d'Ali Watts dans de l'azote liquide ou sur de la glace sèche et conservez à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de la transformation. Transformez l'ADN fosmidique dans des cellules électrocompétentes SW106 en électroporant les bactéries avec environ 50 nanogrammes d'ADN fosmidique dans des cuvettes à entrefer de 0,1 centimètre, à l'aide d'un électroporateur EOR 25-10 à 1 350 volts. Récupérez les bactéries dans un millilitre de LB pendant une heure à 32 degrés Celsius, étalez Eloqua sur des géloses LB contenant du chloramphénicol et incubez à 32 degrés Celsius pendant la nuit.Vérifiez la présence du gène d'intérêt à l'aide d'une PCR sur colonies en cultivant un volume de cinq millilitres d'une culture de nuit dans du milieu LB contenant 12,5 microgrammes par millilitre de chloramphénicol à 32 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitre de la culture à une réaction PCR standard avec les amorces flanquantes et prolongez l'incubation initiale à 95 degrés Celsius à cinq minutes afin de lyser les bactéries avant la réaction. Enfin, préparez un stock de glycérol pour une conservation à long terme afin d'insérer le gène gal K dans le smid FO portant votre gène d'intérêt.Préparez d'abord des boîtes de milieu minimal MOPS contenant 0,2 % de galactose. Consultez la partie écrite de ce protocole pour la recette. Ensuite, amplifiez par PCR la cassette P mod quatre gal, k, g ou P mod quatre gal K GT.Nous utilisons un gel de fusion ou un gel go tac. Purifiez le produit PCR obtenu. Quantifiez le rendement sur un gel ou à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop.Conserver le produit de PCR à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Inoculer cinq millilitres de milieu LB contenant du chloramphénicol avec des cellules SW106 contenant l'ADN Foss. Faire croître la culture toute la nuit à 32 degrés Celsius. Ajouter un millilitre de la culture de nuit à 100 millilitres de milieu LB contenant du chloramphénicol. Dans un flacon de deux litres, faire croître la culture jusqu'à une DO de 0,6 à 0,8.Cela prend généralement de trois à quatre heures pendant la croissance de la culture. Réglez un bain-marie agité à 42 degrés Celsius pour le préchauffage, avec un flacon stérile de 250 millilitres dans le support. L'utilisation d'un bain-marie agité pour l'étape suivante est essentielle pour obtenir une haute efficacité.Transférez ensuite 50 millilitres de la culture SW 1 0 6 dans un flacon de 250 millilitres et soumettez-la à un choc thermique à 42 degrés Celsius et 100 tr/min pendant exactement 20 minutes dans un bain d'eau agité. Conservez les bactéries restantes à 32 degrés Celsius pour les utiliser comme témoin non induit. Refroidissez les bactéries induites et non induites sur de la glace pendant 10 minutes.Transférez les échantillons dans deux tubes stériles pour centrifugeuse et faites précipiter à environ 5 000 G pendant cinq minutes. Versez tout le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de glycérol à 10 % glacé par vortexage doux. Ajoutez 49 millilitres supplémentaires de glycérol à 10 % glacé.Répétez ce lavage, puis centrifugez à nouveau. Éliminez le surnageant en retournant les tubes et resuspendez le culot dans la petite quantité de liquide restant d’Eloqua en échantillons de 100 microlitres. Congelez sur de la glace sèche et conservez à moins 80 degrés Celsius le jour suivant.Électroporation : induire et non induire les cellules SW106 avec 150 nanogrammes du produit PCR préparé, en utilisant des cuvettes à entrefer de 0,1 centimètre dans un électroporateur Eppendorf 25T. Régler à 1 350 volts. Récupérer les bactéries dans un millilitre de milieu LB dans un tube Falcon de 14 millilitres.Incuber à 32 degrés Celsius pendant quatre heures et demie, puis après l'incubation, centrifuger les bactéries à 13 200 tr/min pendant 15 secondes et les resuspendre dans du milieu M neuf. Veuillez vous référer à la partie écrite de ce protocole pour la recette. Répéter cette étape de lavage deux fois.Pour éliminer tout milieu riche, faire une nouvelle centrifugation des cellules, puis les resuspendre dans un millilitre de milieu M9 avant de réaliser une dilution en série sur mops. Incuber le milieu minimal trois à cinq jours à 32 degrés Celsius dans un incubateur. Soyez patient car les vrais positifs croissent lentement ; étaler une colonie sur gélose Macon pour purifier la colonie et vérifier qu'elle est positive pour GLK.Les colonies doivent devenir rose vif. Prélever une colonie isolée et ensemencer une culture de cinq millilitres de LB supplémenté en chloramphénicol, puis incuber toute la nuit à 32 degrés Celsius. Confirmer l'insertion du groupement protecteur gal à l'emplacement correct par PCR en utilisant les oligonucléotides de bordure.Se référer au tableau un dans la partie écrite de ce protocole. Pour les séquences d'oligos, ajouter 0,5 microlitre de la culture à une réaction PCR standard et augmenter l'incubation initiale à 95 degrés Celsius à cinq minutes afin de lyser les bactéries. Le produit PCR doit présenter un décalage vers des tailles supérieures en raison de la présence du gène GAL K.Enfin, préparer une souche glycérolée pour le stockage. Préparer des plaques de milieu minimal MOPS contenant 0,2 % de désoxygalactose ou DOG et 0,2 % de glycérol. Voir la partie écrite de ce protocole pour la recette. PCR.Amplifiez les fragments marqueurs à partir du PMO 4G FP PBS 1761 ou du PBS 1479 en utilisant les mêmes oligonucléotides employés lors du premier cycle ou des oligonucléotides plus courts spécifiques du GFP ou de la protéine tap. Si vous construisez plusieurs vecteurs, il est particulièrement utile d'utiliser les oligonucléotides plus courts, car le même produit de PCR peut être utilisé pour tous les vecteurs. Purifiez le produit de PCR sur gel et mesurez sa concentration sur gel ou à l’aide d’un spectrophotomètre. Générez des cellules compétentes induites et non induites W 1 0 6 portant le SMID avec le gène Gale K comme décrit précédemment. Transformez les cellules SW 1 0 6 induites et non induites avec environ 100 nanogrammes de produit de PCR en utilisant des cuvettes Q vets à entrefer de 0,1 centimètre dans un électroporateur EINOR 25 10 réglé à 1 350 volts.Récupérer dans un millilitre de LV dans un tube de 14 millilitres à bouchon vissable et incuber dans un agitateur à 32 degrés Celsius pendant quatre heures et demie. Laver et diluer les cellules dans du milieu M9 comme indiqué précédemment. Ensemencer les bactéries sur des boîtes MOPS, un milieu minimal contenant 0,2 % de DOG et 0,2 % de glycérol, puis incuber les boîtes à 32 degrés Celsius pendant trois jours afin de confirmer la présence de l'insertion.Utilisez quatre colonies pour inoculer des cultures de 5 ml en milieu LB pendant la nuit, avec 12,5 microgrammes par millilitre de chloramphénicol. Réalisez une PCR sur colonie comme décrit précédemment. Nous utilisons à la fois les oligonucléotides spécifiques courts ciblant GFP et les oligonucléotides flanquants pour démontrer la présence de l'insert correct au bon emplacement.Le GFP mesure environ 800 paires de bases. Le TAP mesure environ 550 paires de bases et le gal KT fait 1,4 kilobases. Enfin, préparez un stock de glycérol pour une conservation à long terme.La modification du FO smed par recombinaison donne des résultats robustes et des taux de réussite supérieurs à 90 % sont couramment observés lors de l'étape de sélection négative. De plus, ce protocole prend environ deux semaines à réaliser, ce qui rend la préparation des transgènes relativement rapide, comme le montrent nos 48 colonies identifiées sur les plaques DOG et utilisées pour la PCR de colonies avec les amorces GFP marquées, qui ont amplifié l'insert GFP dans cette expérience. 47 des 48 colonies sont correctes et une colonie n'est pas correctement modifiée, comme le montrent les 48 colonies identifiées sur les plaques DOG et utilisées pour la PCR de colonies avec les amorces GFP marquées, qui ont amplifié l'insert GFP dans cette expérience.46 des 48 colonies sont correctes et deux colonies ne sont pas correctement modifiées. Le point le plus important à garder à l'esprit lors de la réalisation de cette expérience est que les bactéries SW106 doivent être cultivées à 32 degrés Celsius et non à des températures plus élevées, car une croissance à des températures plus élevées sélectionnerait des mutants dont les mutations altèrent le système Lambda red. Bonne chance pour votre expérience.

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Nous décrivons une méthode pour identifier des régulateurs sensibilisés postembryonnaires de l'expression des protéines et la localisation...

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

Systématiques et à grande échelle de synthèse génétiques écrans d'interaction gène-gène (ou épistasie) peut être utilisé pour explorer la redondance génétique et la voie de la diaphonie. Ici, nous décrivons un haut débit quantitatif synthétique de la technologie génétique de dépistage tableau, appelé ESGA que nous avons développé pour élucider les relations épistatiques et l'exploration des réseaux d'interactions...

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Ce protocole décrit une procédure rapide et peu consommatrice de matériaux pour l’intégration de réseaux extrachromosomiques transgéniques dans le génome de Caenorhabditis elegans en utilisant l’irradiation ultraviolette (UV). De plus, ce protocole est particulièrement bien adapté aux lignées transgéniques qui transmettent des réseaux extrachromosomiques à un rythme élevé.

Un protocole rapide pour l’intégration de puces extrachromosomiques à haut taux de transmission dans le génome de C. elegans

Les protéines contiennent souvent plusieurs domaines qui peuvent exercer différentes fonctions cellulaires. knock-out gène (KO) ne considèrent pas cette diversité fonctionnelle. Nous rapportons ici un échange de cassette à médiation recombinaison (CREM) approche structure-fonction dans les cellules à base de souches embryonnaires KO qui permet la dissection moléculaire de différents domaines fonctionnels ou variants d'une protéine.

Structure-fonction des études chez la souris à l&#39;aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d&#39;échange

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

Décrit ici est une méthode pour la suppression ciblée et sans marqueur de gène dans Chlamydia trachomatis utilisant la mutagénèse allélique d'échange allélique de cassette floxed, FLAEM.

Markerless Gene Deletion par Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Un flux de travail de microinjection CRISPR/Cas9 pour le marquage fluorescent endogène dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans afin d’obtenir des lignées de knock-in homozygotes pour une analyse in vivo de la localisation des protéines.

Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans

Application de l'électrophysiologie aux synapses accessible fournit une mesure quantifiable de l'activité synaptique, utiles dans l'analyse des mutants synaptique. Cet article décrit une méthode de dissection utilisée pour exposer la jonctions neuromusculaires (JNM)...

Dissection et d&#39;enregistrement de la jonction neuromusculaire C. Elegans

Apprenez à produire des transgènes chez C. elegans par recombinaison homologue avec le marqueur GalK. Cette méthode rapide préserve les éléments régulateurs natifs pour une expression précise.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

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