Name: Cellules entières denregistrement de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) Courants dans les lymphocytes T humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Découvrez l'enregistrement en patch clamp de courants CRAC dans les lymphocytes T humains. Cette méthode permet de mesurer l'activité des canaux calciques pour étudier la signalisation calcique et la fonction immunitaire.

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Nous sommes reconnaissants envers le Département de physiologie et biologie membranaire, Université de Californie à Davis pour nous fournir des installations et un excellent environnement pour les études des canaux ioniques.

1. Préparation de repos lymphocytes T humains <ol><li> Utiliser RosetteSep homme T Cocktail enrichissement cellulaire et de densité moyenne RosetteSep, purifier les cellules T à partir d'échantillons de sang humain selon les instructions du fabricant. La population cellulaire obtenue doit contenir 95% cellules T CD3 + repos. Nous purifions lymphocytes T humains à partir d'échantillons de sang périphérique prélevés sur des volontaires sains en conformité avec le protocole approuvé par le Conseil d'examen interne UC Davis. </li><li> Après isolement, resuspendre lymphocytes T à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / mL dans le milieu de culture cellulaire contenant RPMI-1640 avec de la glutamine et l'HEPES, complété avec 10% sérum de veau foetal, de 2% glutamax-I, 1% du RPMI 1640 la vitamine solution, une solution de RPMI 1640% d'acides aminés, le pyruvate de sodium à 1%, et 0,03% β-mercaptoéthanol. </li><li> Suspension cellulaire place dans des flacons de culture cellulaire et de maintenir à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 jusqu'à 24 h avant l'expérience. </li></ol> 2. Préparation de la chambre d'enregistrement <ol><li> Les éléments suivants sont nécessaires pour préparer des chambres d'enregistrement: a) de silicium joints toriques, b) rond, 25 mm lamelles nettoyé avec de l'éthanol 70% et distillé H 2 O, c) mélangé Sylgard184, préparé selon les instructions du fabricant, et d) deux 60 x 15 mm boîte de Pétri. </li><li> Placez ~ 0,5 ml de Sylgard184 mélangé dans un plat 60x15 mm Petri. </li><li> Trempez la partie inférieure de l'O-ring dans la pince Sylgard184 aide. </li><li> Retirer l'excès de Sylgard184 le bord de la O-ring en plaçant le joint torique sur une surface propre, comme une autre boîte de Pétri. </li><li> Placez l'anneau sur la lamelle et appuyez vers le bas. </li><li> Guérissez les Sylgard184 par le chauffage des chambres à 85 ° C pendant 40-60 min ou jusqu'à ce que le Sylgard184 est polymérisé. </li><li> Boutique des chambres d'enregistrement dans un conteneur sans poussière. </li></ol> 3. Préparation de pipettes Patch <ol><li> Le jour de l'expérience, tirez les pipettes avec un diamètre de l'extrémité ~ 2-um en utilisant capillaires en verre et un extracteur de pipette. Nous utilisons des tubes en borosilicate avec filament (OD: 1,5 mm et ID: 1,10 mm). Pipettes Stocker dans un endroit exempt de poussière. </li><li> Manteau pipette avec Sylgard184 ou revêtement CHIP R6101 Semiconductor protection, selon une procédure standard 9. </li><li> Doucement feu polir les pipettes avant l'expérience. </li></ol> 4. Préparation de configuration patch clamp <ol><li> Configurer et sauvegarder les macros pour la formation gigaseal dans le logiciel de contrôle de votre amplificateur de patch-clamp. Nous utilisons un amplificateur EPC-10 pris en charge par Windows XP et le logiciel d'impulsions pour l'acquisition de données. Nous avons fixé le "set-up", "sur la cellule", et "cellule entière" macros selon le manuel d'EPC-10 et les utiliser pour toutes les expériences. </li><li> Préparer des solutions de bain et des solutions pipette énumérés dans le tableau 1 avant l'expérience et les stocker à 4 ° C pendant 1 semaine. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Produits chimiques </td><td colspan="3"> Bain Solutions (mM) </td><td> Solutions pipette (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-unespartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Solutions pour la cellule entière CRAC enregistrements actuels. Tous les produits chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. <ol start="3"><li> Déterminer les potentiels de jonction liquide (LJ) entre la solution de la pipette de patch et chaque solution 10 de bain. Enregistrer la valeur LJ à l'endroit approprié à l'aide de votre logiciel d'acquisition. Par exemple, dans le programme d'impulsion insérer la valeur LJ en «LJ» de contrôle dans la "amplificateur" fenêtre. </li><li> Configurer et sauvegarder les protocoles de stimulation, comme le montre la figure 1, à l'endroit approprié de votre logiciel d'acquisition, avant les expériences. Dans le programme d'impulsion, nous avons mis le protocole d'acquisition de la «génération d'impulsion" fenêtre. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. . Protocole de stimulation rampe de tension de -120 à 100 mV de 50 ms dans la durée est appliqué toutes les 0,2 - 2 s (5 - 0,5 Hz). Potentiel de maintien (V h) entre les rampes est maintenue à 30 mV. </li></ol> 5. Cellules de montage sur la platine du microscope <ol><li> Enduire les chambres d'enregistrement avec la poly-L-lysine pour ~ 20 min et laver avec du H 2 O puis avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avant l'étalement des cellules. </li><li> Plate 500 pl de suspension cellulaire contenant 0.2 au 0.5 x10 6 cellules dans la chambre et incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Fixez la chambre d'enregistrement avec les cellules attachées à un support de chambre. Nous utilisons un porte-chambre de mesure, où la base supporte le bas de la lamelle, tandis que la partie supérieure légèrement en appui sur le haut de la lamelle. </li><li> Placez le porte-chambre sur la scène du microscope inversé. </li><li> Focus sur les cellules en lumière transmise. Nous utilisons un objectif 40X d'huile d'immersion. </li><li> Placer l'électrode de référence Ag / AgCl dans le bain. </li><li> Alignez les multibarrel, système de perfusion par gravité. La pointe du tube d'introduction devrait être placé à un angle de 45 ° à l'étroite lamelle au champ de vue. </li><li> Placez le tuyau d'aspiration en face de l'extrémité du tube entrées. </li><li> Perfuser la chambre avec un tampon phosphate salin (PBS) ou HBSS pour laver les milieux de culture cellulaire et les cellules lâchement. </li></ol> 6. CRAC canaliser les courants d'enregistrement <ol><li> Trouver une cellule qui est fermement attaché à la lamelle. Nous choisissent généralement une taille moyenne, de cellules rondes avec une surface extérieure lisse. </li><li> Perfuser la chambre d'enregistrement de Ca 2 + libre, 3 mM de Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 (Tableau 1) contenant de 0,5 à 1 thapsigargine pM pour 8-10 min pour bloquer la pompe SERCA. Nous effectuons cette démarche pour épuiser le magasin avant la formation gigaseal. </li><li> En utilisant une microloader Eppendorf et une pipette P-20 de déplacement, remplir la pipette de patch avec la solution pipette (tableau 1) et insérez la pipette de patch dans le porte-pipette sur la headstage amplificateur. Le Ca 2 + chélateur BAPTA est inclus dans la solution passive pipette pour épuiser les stocker et de réduire de Ca 2 +-dépendante l'inactivation du canal CRAC. </li><li> Appliquez une petite quantité de pression positive (~ 3 pouces de H 2 O) à l'intérieur de la pipette de patch avant d'entrer dans le bain. Nous utilisons une sur-mesure à la pression d'aspiration périphérique connecté à l'air comprimé et les lignes de vide pour créer une pression positive ou négative à l'intérieur d'une pipette de patch. </li><li> Basse de la pipette de patch dans le bain sous contrôle visuel via le microscope. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous devriez voir un courant circulant dans la pipette. Un changement étape comme dans l'amplitude du courant doit être induite par une impulsion de tension de faible amplitude (de test par impulsion) appliquée par la macro prédéfinie. À ce moment, vous devriez être en mesure de déterminer la valeur de la résistance pipette. La résistance de nos pipettes est généralement 5-6 MQ. </li><li> Corriger les «compenser» le potentiel généré entre la pipette et l'électrode de référence. </li><li> Sous contrôle visuel par le biais du microscope, amener la pointe de la pipette rapprocher de la cellule jusqu'à ce qu'elle touche la membrane cellulaire. </li><li> Appliquer une pression négative (20-40 pouces H 2 O) à l'intérieur de la pipette de patch. </li><li> Surveiller la formation gigaseal dans le "oscilloscope" fenêtre. Vous verrez l'amplitude du courant, induite par l'impulsion d'essai, diminue et la valeur de résistance augmente pipette&gt; 5 GQ. Habituellement gigaseal formes au sein d'une few secondes, mais cela peut prendre 1-2 min pour obtenir un gigaseal stable. </li><li> Compenser la capacitance pipette («C-Fast"). </li><li> Pause de la membrane de patch en appliquant une pression négative supplémentaires en utilisant une seringue de 20 cc. </li><li> Réglez le potentiel de maintien à +30 mV. Un potentiel de détention positif aide à prévenir les calcium-dépendante l'inactivation du canal CRAC. </li><li> Compenser la capacitance membranaire de la cellule («C-Lent»); enregistrer ou enregistrer la valeur de C-lent. </li><li> Vérifiez la valeur de la résistance d'accès "R s". Dans nos expériences, le s R est généralement de 7 à 20 MQ. </li><li> Commencez à appliquer une série de rampes de tension avec une fréquence de 0,5 Hz (figure 1) dans le Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1. Dans cette solution, le courant CRAC est négligeable par rapport à la "fuite" en cours en raison de la faible perméabilité des canaux CRAC pour Mg 2 +. Enregistrer et utiliser les traces actuelles enregistrées dans la solution de bain n ° 1 dans les analyses futures comme «fuite» des courants. L'amplitude absolue de la "fuite" courant à 100 mV doit être inférieure ou égale à 5 pA. Si la cellule est "fuite", arrêter l'expérience et de recommencer à l'aide d'une pipette nouveau patch et une nouvelle cellule. </li><li> Pour enregistrer Ca 2 + via les canaux CRAC (I Ca-CRAC), remplacer Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 avec 20 mM de 2 Ca solution de bain + contenant # 2 (Tableau 1) par commutation des vannes de perfusion. Cela permet de Ca 2 + au flux via les canaux CRAC et de produire un courant entrant. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous verrez le développement de rectifier intérieurement I Ca-CRAC (figure 2). L'amplitude du courant à des tensions négatives va continuer à augmenter pendant environ 1 min en raison de la Ca 2 +-dépendante de potentialisation de l'actuelle CRAC. </li><li> Augmenter la fréquence de stimulation avec des rampes de tension à 5 Hz, ce qui est nécessaire pour enregistrer le transitoire courant Na + via les canaux CRAC. </li><li> Remplacer le 20 mM de Ca 2 +-n ° 2 contenant une solution de bain avec Na +-cations divalents contenant une solution sans # 3 (tableau 1) par commutation des vannes de perfusion. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous verrez un développement transitoires de plus grande amplitude intérieurement rectifier courant Na + via les canaux CRAC (I Na-CRAC; figure 2). </li><li> On peut appliquer 20 mm 2 Ca solution de bain + contenant n ° 2 contenant de 1 à 5 uM La 3 + à la fin de l'expérience d'enregistrer la «fuite» actuel. Cependant, nous n'avons pas trouvé cette approche utile, car la «fuite» des changements en cours dans le temps et il peut devenir plus ou moins à la fin de l'expérience. Nous préférons prendre le courant enregistré dans le Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 au début de l'expérience comme une "fuite" en cours. </li><li> Enregistrer les traces enregistrées en cours d'analyse. </li></ol> 7. Analyse des données <ol><li> Récupérer les enregistrements sauvés en cours dans le logiciel d'analyse. Nous utilisons le programme d'impulsion pour analyse. </li><li> Mesurer les amplitudes actuelles au début et à la fin de rampes de tension. Nous généralement mesurer les amplitudes de courant à -100 mV et 100 mV à l'aide de paires de curseurs dans la "Oscilloscope" fenêtre du programme d'impulsion. </li><li> Exporter les valeurs des amplitudes de courant dans un programme graphique pour approfondir l'analyse et la présentation graphique. Nous utilisons des graphiques origine scientifique et logiciels d'analyse, la version 7. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. CRAC courants dans une cellule T humaine de repos. (A), évolution dans le temps des courants CRAC enregistrée dans la cellule entière voltage-clamp de configuration à -100 mV (cercles pleins) et 100 mV (cercles ouverts). Avant la formation gigaseal, la cellule a été pré-incubées pendant 10 min dans ~ Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 contenant 0,5 thapsigargine uM. Après le rodage, les solutions de bain ont été appliqués séquentiellement comme suit: Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 (0 + 3 Ca Mg), suivie par 20 mM de solution de Ca 2 + bain contenant # 2 (20 Ca), suivie par la solution de bain de cations divalents libres # 3 (DVF), suivie par solution du bain # 2 (20 Ca). La cellule a été stimulé par une série de rampes de tension comme le montre la figure 1. La fréquence de 5 Hz a été rampes en solution de bain # 3 (DVF) et 0,5 Hz dans tous les autres solutions. Notez le lent développement de I Ca-CRAC, après application de 20 mM de Ca 2 +-solution du bain contenant # 2 et le développement rapide aux transitoires du I Na-CRAC en solution de bain DVF # 3. (B), représentant les traces actuelles enregistrées au cours des rampes de tension en Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 («Fuite»), 20 mM de Ca 2 + solution contenant de bain # 2 (20 Ca), et la solution de bain # 3 (DVF). (C, D), courant-tension des relations de I Ca-CRAC (C) et j'ai Na-CRAC (D) obtenue en soustrayant "fuite" en cours à partir des courants enregistrés au cours des rampes de tension dans 20 mM de Ca 2 +-bain contenant Solution n ° 2 (20 Ca), et la solution de bain # 3 (DVF) montré dans le panneau (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

L&#39;exploration électrophysiologique des courants de repos CRAC lymphocytes T humains est une tâche difficile parce que le CRAC endogènes d&#39;amplitude en cours dans ces cellules est faible en raison de la taille des cellules de petite taille (diamètre de l&#39;reposant humaine de cellules T est dans la gamme de 5-8 um). Ici, nous présentons une procédure étape par étape pour enregistrer de manière fiable les courants de repos CRAC lymphocytes T humains isolés à partir des cellules mononucléées du sang périphérique....

<table><tbody><tr><td>Cocktail d'enrichissement en cellules T humaines RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de densité RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>Milieu RPMI 1640 avec glutamine/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (solution 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Solution vitaminée RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Solution d'acides aminés 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Trisphosphate d'inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Hydrobromure de poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de lanthane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'élastomère de silicium Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement protecteur pour semi-conducteurs HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table de laboratoire à isolation vibratoire haute performance série 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de clampage de membrane EPC 10 avec tête amplificatrice</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Olympus 1X71 avec objectif à immersion dans l'huile 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur sous Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d'analyse et de représentation graphique scientifique Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de pipettes pour patch</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté avec filament (D.E. : 1,5 mm et D.I. : 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microforge Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Joints toriques en silicone</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

cellules entières d&#39;enregistrement de calcium release-activated calcium (crac) courants dans les lymphocytes t humains

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Dans les lymphocytes T, l&#39;épuisement de Ca 2 + de la intracellulaire de Ca2 + magasin conduit à l&#39;activation des plasmalemmal Ca 2 + canaux, appelés calcium Release-Activated calcium (CRAC) des canaux. Canaux CRAC jouent un rôle important dans la régulation de la prolifération des cellules T et l&#39;expression des gènes. Anomalie de la fonction de canal CRAC dans les cellules T a été liée à une immunodéficience sévère combinée et auto-immunes 1, 2. Etudier la fonction du canal CRAC dans les lymphocytes T humains peuvent découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires régulant les réponses immunitaires normales et de démêler les causes des maladies liées à l&#39;humain. Enregistrements électrophysiologiques des courants membranaires fournissent l&#39;évaluation la plus précise des propriétés fonctionnelles de canal et de leur régulation. L&#39;évaluation électrophysiologique des courants des canaux CRAC dans les cellules T Jurkat, une ligne de la leucémie humaine des cellules T, a d&#39;abord été effectué plus de 20 ans il ya trois, cependant, les mesures actuelles dans le CRAC lymphocytes T humains normaux reste une tâche difficile. Les difficultés dans l&#39;enregistrement des courants de canal CRAC dans les cellules T normales sont aggravés par le fait que les dérivés du sang les lymphocytes T sont beaucoup plus petits en taille que les cellules T Jurkat et, par conséquent, les courants endogènes CRAC cellules entières sont très faibles en amplitude. Ici, nous donnons une procédure étape par étape que nous utilisent couramment pour enregistrer le Ca 2 + ou Na + courants via les canaux CRAC au repos des cellules T isolées du sang périphérique de volontaires sains. La méthode décrite ici a été adoptée par les procédures utilisées pour l&#39;enregistrement des courants CRAC dans les cellules T Jurkat et activé des cellules T 4-8.

Nous fournissons un protocole étape par étape pour la cellule entière d&#39;enregistrement de patch-clamp de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) des courants dans les zones périphériques mononucléées du sang de cellules dérivées de lymphocytes T humains.

Cellules entières d&#39;enregistrement de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) Courants dans les lymphocytes T humains

Dans les lymphocytes T, l'épuisement du Ca2+ provenant des stocks intracellulaires de Ca2+ entraîne l'activation de canaux calciques plasmalemmaux, appelés canaux calciques activés par l'épuisement des stocks...

Les canaux calciques activés par la libération de calcium, ou canaux CRAC, situés dans la membrane plasmique, jouent un rôle important dans la prolifération des lymphocytes T et dans la stimulation de l'expression génique. L'activation des récepteurs des lymphocytes T par un antigène conduit à la formation du messager secondaire, l'adénosine triphosphate, et à l'activation de la libération de calcium stocké via les récepteurs aux inositol trisphosphate. La diminution de la concentration en calcium dans le stockage entraîne l'activation des canaux CRAC et une augmentation consécutive de la concentration cytosolique en calcium. Des anomalies dans la fonction des canaux CRAC dans les lymphocytes T sont associées à plusieurs maladies humaines, notamment des troubles d'immunodéficience combinée sévère et des maladies auto-immunes.Ici, une méthode est présentée permettant l'enregistrement fiable et reproductible de courants endogènes de calcium et de sodium via des canaux de type « crack » dans les lymphocytes T humains. Premièrement, la FSA garin, un bloqueur de la pompe à calcium du réticulum sarcoplasmique-endoplasmique (Sarco), est appliquée dans une solution extracellulaire sans cal

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Le cloisonnement des protéines soit au sein de la membrane plasmique ou dans des endroits intracellulaires est un mécanisme de régulation qui peuvent grandement influencer les résultats de signalisation, d'où, à comprendre la signalisation, il est important d'étudier le comportement spatial et temporel des protéines impliquées. Nous décrivons ici un système de microscopie TIRF base pour étudier la transduction du signal dans les cellules T, mais est largement applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Cette vidéo analyse l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T dans les lymphocytes T. Les anticorps anti-CD3 activent les voies de signalisation des lymphocytes T, entraînant une augmentation des ions calcium intracellulaires qui se lient au colorant Indo-1. En cytométrie en flux, un changement de spectre de l’état sans calcium à l’état lié au calcium est corrélé à l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T.

Évaluation de l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T à l’aide d’un colorant indicateur de calcium

Nous décrivons l'isolement des myocytes auriculaires humains qui peuvent être utilisés pour intracellulaire de...

Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitoires et courants membranaires

Les procédures sont décrites pour effectuer des enregistrements simultanés du potentiel ou du courant de la membrane et des changements de concentration intracellulaire de calcium. Les neurones du noyau suprachiasmatique sont remplis de l’indicateur de calcium bis-fura-2 à l’aide d’une électrode de patch clamp dans la configuration de patch clamp de cellule entière.

Enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique

L’enregistrement des courants Ca2+ au niveau de la membrane frontale de libération présynaptique est essentiel à une compréhension précise de l’entrée de Ca2+ et de la libération des neurotransmetteurs. Nous présentons une dissociation aiguë de la moelle épinière de la lamproie qui produit des axones réticulospinaux isolés fonctionnels, permettant l’enregistrement directement à partir de la membrane frontale de libération des terminaisons présynaptiques individuelles.

Aiguë de dissociation de la lamproie réticulo axones pour permettre l&#39;enregistrement de la sortie de visage membrane des terminaux présynaptiques fonctionnels individuels

Nous présentons ici des techniques d’imagerie des événements Ca2+ médiés par IP3 locaux à l’aide de la microscopie à fluorescence dans des cellules de mammifères intactes chargées d’indicateurs Ca2+ ainsi qu’un algorithme qui automatise l’identification et l’analyse de ces événements.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Les modèles murins permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse. À cette fin, des cardiomyocytes de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp. Ici, une méthode pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires murins via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet des mesures simultanées des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L, est décrite.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Ici, les méthodes utilisées pour étudier l’effet fonctionnel des mutations RYR1 exprimées de manière endogène dans les lymphocytes B humains immortalisés par le virus d’Epstein Barr et les cellules satellites dérivées de la biopsie musculaire différenciées en myotubes sont décrites.

Caractérisation fonctionnelle des variantes de RYR1 humaines exprimées de manière endogène

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

Ici, nous fournissons un protocole complet pour résoudre les signaux locaux initiaux Ca2+ , connus sous le nom de microdomaines Ca2+ , dans les cellules T primaires murines et humaines à l’aide de la microscopie à fluorescence. Ce protocole constitue une ressource précieuse pour les chercheurs qui examinent les voies de signalisation Ca2+ au sein des cellules immunitaires et pour mieux comprendre leur fonction.

Imagerie des microdomaines Ca2+ initiaux dans les lymphocytes T primaires

Cet article présente une méthode de surveillance quantitative en temps réel des concentrations d’ions calcium (Ca2+) dans les cellules à l’aide de l’imagerie unicellulaire Ca2+ avec le colorant Fura-2/AM. Cette technique permet un chargement efficace du colorant et un calcul précis des niveaux de Ca2+ grâce aux rapports d’intensité de fluorescence, ce qui en fait une approche simple et rapide pour les applications de recherche.

Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Découvrez l'enregistrement en patch clamp de courants CRAC dans les lymphocytes T humains. Cette méthode permet de mesurer l'activité des canaux calciques pour étudier la signalisation calcique et la fonction immunitaire.

Cellules entières d'enregistrement de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) Courants dans les lymphocytes T humains

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