Name: Cellules entières denregistrement de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) Courants dans les lymphocytes T humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Découvrez l'enregistrement en patch clamp de courants CRAC dans les lymphocytes T humains. Cette méthode permet de mesurer l'activité des canaux calciques pour étudier la signalisation calcique et la fonction immunitaire.

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Nous sommes reconnaissants envers le Département de physiologie et biologie membranaire, Université de Californie à Davis pour nous fournir des installations et un excellent environnement pour les études des canaux ioniques.

1. Préparation de repos lymphocytes T humains <ol><li> Utiliser RosetteSep homme T Cocktail enrichissement cellulaire et de densité moyenne RosetteSep, purifier les cellules T à partir d'échantillons de sang humain selon les instructions du fabricant. La population cellulaire obtenue doit contenir 95% cellules T CD3 + repos. Nous purifions lymphocytes T humains à partir d'échantillons de sang périphérique prélevés sur des volontaires sains en conformité avec le protocole approuvé par le Conseil d'examen interne UC Davis. </li><li> Après isolement, resuspendre lymphocytes T à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / mL dans le milieu de culture cellulaire contenant RPMI-1640 avec de la glutamine et l'HEPES, complété avec 10% sérum de veau foetal, de 2% glutamax-I, 1% du RPMI 1640 la vitamine solution, une solution de RPMI 1640% d'acides aminés, le pyruvate de sodium à 1%, et 0,03% β-mercaptoéthanol. </li><li> Suspension cellulaire place dans des flacons de culture cellulaire et de maintenir à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 jusqu'à 24 h avant l'expérience. </li></ol> 2. Préparation de la chambre d'enregistrement <ol><li> Les éléments suivants sont nécessaires pour préparer des chambres d'enregistrement: a) de silicium joints toriques, b) rond, 25 mm lamelles nettoyé avec de l'éthanol 70% et distillé H 2 O, c) mélangé Sylgard184, préparé selon les instructions du fabricant, et d) deux 60 x 15 mm boîte de Pétri. </li><li> Placez ~ 0,5 ml de Sylgard184 mélangé dans un plat 60x15 mm Petri. </li><li> Trempez la partie inférieure de l'O-ring dans la pince Sylgard184 aide. </li><li> Retirer l'excès de Sylgard184 le bord de la O-ring en plaçant le joint torique sur une surface propre, comme une autre boîte de Pétri. </li><li> Placez l'anneau sur la lamelle et appuyez vers le bas. </li><li> Guérissez les Sylgard184 par le chauffage des chambres à 85 ° C pendant 40-60 min ou jusqu'à ce que le Sylgard184 est polymérisé. </li><li> Boutique des chambres d'enregistrement dans un conteneur sans poussière. </li></ol> 3. Préparation de pipettes Patch <ol><li> Le jour de l'expérience, tirez les pipettes avec un diamètre de l'extrémité ~ 2-um en utilisant capillaires en verre et un extracteur de pipette. Nous utilisons des tubes en borosilicate avec filament (OD: 1,5 mm et ID: 1,10 mm). Pipettes Stocker dans un endroit exempt de poussière. </li><li> Manteau pipette avec Sylgard184 ou revêtement CHIP R6101 Semiconductor protection, selon une procédure standard 9. </li><li> Doucement feu polir les pipettes avant l'expérience. </li></ol> 4. Préparation de configuration patch clamp <ol><li> Configurer et sauvegarder les macros pour la formation gigaseal dans le logiciel de contrôle de votre amplificateur de patch-clamp. Nous utilisons un amplificateur EPC-10 pris en charge par Windows XP et le logiciel d'impulsions pour l'acquisition de données. Nous avons fixé le "set-up", "sur la cellule", et "cellule entière" macros selon le manuel d'EPC-10 et les utiliser pour toutes les expériences. </li><li> Préparer des solutions de bain et des solutions pipette énumérés dans le tableau 1 avant l'expérience et les stocker à 4 ° C pendant 1 semaine. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Produits chimiques </td><td colspan="3"> Bain Solutions (mM) </td><td> Solutions pipette (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-unespartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Solutions pour la cellule entière CRAC enregistrements actuels. Tous les produits chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. <ol start="3"><li> Déterminer les potentiels de jonction liquide (LJ) entre la solution de la pipette de patch et chaque solution 10 de bain. Enregistrer la valeur LJ à l'endroit approprié à l'aide de votre logiciel d'acquisition. Par exemple, dans le programme d'impulsion insérer la valeur LJ en «LJ» de contrôle dans la "amplificateur" fenêtre. </li><li> Configurer et sauvegarder les protocoles de stimulation, comme le montre la figure 1, à l'endroit approprié de votre logiciel d'acquisition, avant les expériences. Dans le programme d'impulsion, nous avons mis le protocole d'acquisition de la «génération d'impulsion" fenêtre. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. . Protocole de stimulation rampe de tension de -120 à 100 mV de 50 ms dans la durée est appliqué toutes les 0,2 - 2 s (5 - 0,5 Hz). Potentiel de maintien (V h) entre les rampes est maintenue à 30 mV. </li></ol> 5. Cellules de montage sur la platine du microscope <ol><li> Enduire les chambres d'enregistrement avec la poly-L-lysine pour ~ 20 min et laver avec du H 2 O puis avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avant l'étalement des cellules. </li><li> Plate 500 pl de suspension cellulaire contenant 0.2 au 0.5 x10 6 cellules dans la chambre et incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Fixez la chambre d'enregistrement avec les cellules attachées à un support de chambre. Nous utilisons un porte-chambre de mesure, où la base supporte le bas de la lamelle, tandis que la partie supérieure légèrement en appui sur le haut de la lamelle. </li><li> Placez le porte-chambre sur la scène du microscope inversé. </li><li> Focus sur les cellules en lumière transmise. Nous utilisons un objectif 40X d'huile d'immersion. </li><li> Placer l'électrode de référence Ag / AgCl dans le bain. </li><li> Alignez les multibarrel, système de perfusion par gravité. La pointe du tube d'introduction devrait être placé à un angle de 45 ° à l'étroite lamelle au champ de vue. </li><li> Placez le tuyau d'aspiration en face de l'extrémité du tube entrées. </li><li> Perfuser la chambre avec un tampon phosphate salin (PBS) ou HBSS pour laver les milieux de culture cellulaire et les cellules lâchement. </li></ol> 6. CRAC canaliser les courants d'enregistrement <ol><li> Trouver une cellule qui est fermement attaché à la lamelle. Nous choisissent généralement une taille moyenne, de cellules rondes avec une surface extérieure lisse. </li><li> Perfuser la chambre d'enregistrement de Ca 2 + libre, 3 mM de Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 (Tableau 1) contenant de 0,5 à 1 thapsigargine pM pour 8-10 min pour bloquer la pompe SERCA. Nous effectuons cette démarche pour épuiser le magasin avant la formation gigaseal. </li><li> En utilisant une microloader Eppendorf et une pipette P-20 de déplacement, remplir la pipette de patch avec la solution pipette (tableau 1) et insérez la pipette de patch dans le porte-pipette sur la headstage amplificateur. Le Ca 2 + chélateur BAPTA est inclus dans la solution passive pipette pour épuiser les stocker et de réduire de Ca 2 +-dépendante l'inactivation du canal CRAC. </li><li> Appliquez une petite quantité de pression positive (~ 3 pouces de H 2 O) à l'intérieur de la pipette de patch avant d'entrer dans le bain. Nous utilisons une sur-mesure à la pression d'aspiration périphérique connecté à l'air comprimé et les lignes de vide pour créer une pression positive ou négative à l'intérieur d'une pipette de patch. </li><li> Basse de la pipette de patch dans le bain sous contrôle visuel via le microscope. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous devriez voir un courant circulant dans la pipette. Un changement étape comme dans l'amplitude du courant doit être induite par une impulsion de tension de faible amplitude (de test par impulsion) appliquée par la macro prédéfinie. À ce moment, vous devriez être en mesure de déterminer la valeur de la résistance pipette. La résistance de nos pipettes est généralement 5-6 MQ. </li><li> Corriger les «compenser» le potentiel généré entre la pipette et l'électrode de référence. </li><li> Sous contrôle visuel par le biais du microscope, amener la pointe de la pipette rapprocher de la cellule jusqu'à ce qu'elle touche la membrane cellulaire. </li><li> Appliquer une pression négative (20-40 pouces H 2 O) à l'intérieur de la pipette de patch. </li><li> Surveiller la formation gigaseal dans le "oscilloscope" fenêtre. Vous verrez l'amplitude du courant, induite par l'impulsion d'essai, diminue et la valeur de résistance augmente pipette&gt; 5 GQ. Habituellement gigaseal formes au sein d'une few secondes, mais cela peut prendre 1-2 min pour obtenir un gigaseal stable. </li><li> Compenser la capacitance pipette («C-Fast"). </li><li> Pause de la membrane de patch en appliquant une pression négative supplémentaires en utilisant une seringue de 20 cc. </li><li> Réglez le potentiel de maintien à +30 mV. Un potentiel de détention positif aide à prévenir les calcium-dépendante l'inactivation du canal CRAC. </li><li> Compenser la capacitance membranaire de la cellule («C-Lent»); enregistrer ou enregistrer la valeur de C-lent. </li><li> Vérifiez la valeur de la résistance d'accès "R s". Dans nos expériences, le s R est généralement de 7 à 20 MQ. </li><li> Commencez à appliquer une série de rampes de tension avec une fréquence de 0,5 Hz (figure 1) dans le Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1. Dans cette solution, le courant CRAC est négligeable par rapport à la "fuite" en cours en raison de la faible perméabilité des canaux CRAC pour Mg 2 +. Enregistrer et utiliser les traces actuelles enregistrées dans la solution de bain n ° 1 dans les analyses futures comme «fuite» des courants. L'amplitude absolue de la "fuite" courant à 100 mV doit être inférieure ou égale à 5 pA. Si la cellule est "fuite", arrêter l'expérience et de recommencer à l'aide d'une pipette nouveau patch et une nouvelle cellule. </li><li> Pour enregistrer Ca 2 + via les canaux CRAC (I Ca-CRAC), remplacer Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 avec 20 mM de 2 Ca solution de bain + contenant # 2 (Tableau 1) par commutation des vannes de perfusion. Cela permet de Ca 2 + au flux via les canaux CRAC et de produire un courant entrant. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous verrez le développement de rectifier intérieurement I Ca-CRAC (figure 2). L'amplitude du courant à des tensions négatives va continuer à augmenter pendant environ 1 min en raison de la Ca 2 +-dépendante de potentialisation de l'actuelle CRAC. </li><li> Augmenter la fréquence de stimulation avec des rampes de tension à 5 Hz, ce qui est nécessaire pour enregistrer le transitoire courant Na + via les canaux CRAC. </li><li> Remplacer le 20 mM de Ca 2 +-n ° 2 contenant une solution de bain avec Na +-cations divalents contenant une solution sans # 3 (tableau 1) par commutation des vannes de perfusion. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous verrez un développement transitoires de plus grande amplitude intérieurement rectifier courant Na + via les canaux CRAC (I Na-CRAC; figure 2). </li><li> On peut appliquer 20 mm 2 Ca solution de bain + contenant n ° 2 contenant de 1 à 5 uM La 3 + à la fin de l'expérience d'enregistrer la «fuite» actuel. Cependant, nous n'avons pas trouvé cette approche utile, car la «fuite» des changements en cours dans le temps et il peut devenir plus ou moins à la fin de l'expérience. Nous préférons prendre le courant enregistré dans le Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 au début de l'expérience comme une "fuite" en cours. </li><li> Enregistrer les traces enregistrées en cours d'analyse. </li></ol> 7. Analyse des données <ol><li> Récupérer les enregistrements sauvés en cours dans le logiciel d'analyse. Nous utilisons le programme d'impulsion pour analyse. </li><li> Mesurer les amplitudes actuelles au début et à la fin de rampes de tension. Nous généralement mesurer les amplitudes de courant à -100 mV et 100 mV à l'aide de paires de curseurs dans la "Oscilloscope" fenêtre du programme d'impulsion. </li><li> Exporter les valeurs des amplitudes de courant dans un programme graphique pour approfondir l'analyse et la présentation graphique. Nous utilisons des graphiques origine scientifique et logiciels d'analyse, la version 7. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. CRAC courants dans une cellule T humaine de repos. (A), évolution dans le temps des courants CRAC enregistrée dans la cellule entière voltage-clamp de configuration à -100 mV (cercles pleins) et 100 mV (cercles ouverts). Avant la formation gigaseal, la cellule a été pré-incubées pendant 10 min dans ~ Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 contenant 0,5 thapsigargine uM. Après le rodage, les solutions de bain ont été appliqués séquentiellement comme suit: Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 (0 + 3 Ca Mg), suivie par 20 mM de solution de Ca 2 + bain contenant # 2 (20 Ca), suivie par la solution de bain de cations divalents libres # 3 (DVF), suivie par solution du bain # 2 (20 Ca). La cellule a été stimulé par une série de rampes de tension comme le montre la figure 1. La fréquence de 5 Hz a été rampes en solution de bain # 3 (DVF) et 0,5 Hz dans tous les autres solutions. Notez le lent développement de I Ca-CRAC, après application de 20 mM de Ca 2 +-solution du bain contenant # 2 et le développement rapide aux transitoires du I Na-CRAC en solution de bain DVF # 3. (B), représentant les traces actuelles enregistrées au cours des rampes de tension en Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 («Fuite»), 20 mM de Ca 2 + solution contenant de bain # 2 (20 Ca), et la solution de bain # 3 (DVF). (C, D), courant-tension des relations de I Ca-CRAC (C) et j'ai Na-CRAC (D) obtenue en soustrayant "fuite" en cours à partir des courants enregistrés au cours des rampes de tension dans 20 mM de Ca 2 +-bain contenant Solution n ° 2 (20 Ca), et la solution de bain # 3 (DVF) montré dans le panneau (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

L&#39;exploration électrophysiologique des courants de repos CRAC lymphocytes T humains est une tâche difficile parce que le CRAC endogènes d&#39;amplitude en cours dans ces cellules est faible en raison de la taille des cellules de petite taille (diamètre de l&#39;reposant humaine de cellules T est dans la gamme de 5-8 um). Ici, nous présentons une procédure étape par étape pour enregistrer de manière fiable les courants de repos CRAC lymphocytes T humains isolés à partir des cellules mononucléées du sang périphérique....

<table><tbody><tr><td>Cocktail d'enrichissement en cellules T humaines RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de densité RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>Milieu RPMI 1640 avec glutamine/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (solution 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Solution vitaminée RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Solution d'acides aminés 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Trisphosphate d'inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Hydrobromure de poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de lanthane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'élastomère de silicium Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement protecteur pour semi-conducteurs HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table de laboratoire à isolation vibratoire haute performance série 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de clampage de membrane EPC 10 avec tête amplificatrice</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Olympus 1X71 avec objectif à immersion dans l'huile 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur sous Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d'analyse et de représentation graphique scientifique Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de pipettes pour patch</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté avec filament (D.E. : 1,5 mm et D.I. : 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microforge Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Joints toriques en silicone</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

cellules entières d&#39;enregistrement de calcium release-activated calcium (crac) courants dans les lymphocytes t humains

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Dans les lymphocytes T, l&#39;épuisement de Ca 2 + de la intracellulaire de Ca2 + magasin conduit à l&#39;activation des plasmalemmal Ca 2 + canaux, appelés calcium Release-Activated calcium (CRAC) des canaux. Canaux CRAC jouent un rôle important dans la régulation de la prolifération des cellules T et l&#39;expression des gènes. Anomalie de la fonction de canal CRAC dans les cellules T a été liée à une immunodéficience sévère combinée et auto-immunes 1, 2. Etudier la fonction du canal CRAC dans les lymphocytes T humains peuvent découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires régulant les réponses immunitaires normales et de démêler les causes des maladies liées à l&#39;humain. Enregistrements électrophysiologiques des courants membranaires fournissent l&#39;évaluation la plus précise des propriétés fonctionnelles de canal et de leur régulation. L&#39;évaluation électrophysiologique des courants des canaux CRAC dans les cellules T Jurkat, une ligne de la leucémie humaine des cellules T, a d&#39;abord été effectué plus de 20 ans il ya trois, cependant, les mesures actuelles dans le CRAC lymphocytes T humains normaux reste une tâche difficile. Les difficultés dans l&#39;enregistrement des courants de canal CRAC dans les cellules T normales sont aggravés par le fait que les dérivés du sang les lymphocytes T sont beaucoup plus petits en taille que les cellules T Jurkat et, par conséquent, les courants endogènes CRAC cellules entières sont très faibles en amplitude. Ici, nous donnons une procédure étape par étape que nous utilisent couramment pour enregistrer le Ca 2 + ou Na + courants via les canaux CRAC au repos des cellules T isolées du sang périphérique de volontaires sains. La méthode décrite ici a été adoptée par les procédures utilisées pour l&#39;enregistrement des courants CRAC dans les cellules T Jurkat et activé des cellules T 4-8.

Nous fournissons un protocole étape par étape pour la cellule entière d&#39;enregistrement de patch-clamp de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) des courants dans les zones périphériques mononucléées du sang de cellules dérivées de lymphocytes T humains.

Cellules entières d&#39;enregistrement de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) Courants dans les lymphocytes T humains

Dans les lymphocytes T, l'épuisement du Ca2+ provenant des stocks intracellulaires de Ca2+ entraîne l'activation de canaux calciques plasmalemmaux, appelés canaux calciques activés par l'épuisement des stocks...

Les canaux calciques activés par la libération de calcium, ou canaux CRAC, situés dans la membrane plasmique, jouent un rôle important dans la prolifération des lymphocytes T et dans la stimulation de l'expression génique. L'activation des récepteurs des lymphocytes T par un antigène conduit à la formation du messager secondaire, l'adénosine triphosphate, et à l'activation de la libération de calcium stocké via les récepteurs aux inositol trisphosphate. La diminution de la concentration en calcium dans le stockage entraîne l'activation des canaux CRAC et une augmentation consécutive de la concentration cytosolique en calcium. Des anomalies dans la fonction des canaux CRAC dans les lymphocytes T sont associées à plusieurs maladies humaines, notamment des troubles d'immunodéficience combinée sévère et des maladies auto-immunes.Ici, une méthode est présentée permettant l'enregistrement fiable et reproductible de courants endogènes de calcium et de sodium via des canaux de type « crack » dans les lymphocytes T humains. Premièrement, la FSA garin, un bloqueur de la pompe à calcium du réticulum sarcoplasmique-endoplasmique (Sarco), est appliquée dans une solution extracellulaire sans calcium contenant trois millimolar de magnésium afin de vider les stocks intracellulaires.Cette procédure ouvre les canaux CRAC, mais n'induit pas de courant CRAC en raison de la faible perméabilité des canaux CRAC au magnésium. Un enregistrement en clampage de voltage en configuration tout-cellulaire est ensuite établi sur une membrane de cellule T. La cellule est perfusée avec une solution intra-pipette contenant une concentration élevée du chélateur calcique PTa.Des solutions extracellulaires contenant du calcium ou dépourvues de cations divalents sont ensuite appliquées séquentiellement afin d'activer des courants mesurables de calcium et de sodium à travers les canaux crack. Les données obtenues illustrent le niveau d'expression fonctionnelle des canaux crack dans les lymphocytes T humains au repos. L'étude des courants membranaires via les canaux crack pourrait fournir des informations précieuses sur la régulation et les fonctions de ces canaux, et permettrait d'établir leur rôle dans les réponses immunitaires normales ainsi que dans les maladies immunologiques.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la petite taille des lymphocytes T humains et de l'amplitude faible des courants de fuite endogènes dans ces cellules. Les lymphocytes T humains CD3 positifs utilisés pour cette expérience ont été obtenus à partir d'un échantillon de sang périphérique prélevé sur un volontaire sain et isolés à l'aide d'un cocktail d'enrichissement des lymphocytes T humains TEP et d'un milieu de densité TEP. Conformément aux instructions du protocole écrit fourni, les cellules ont été maintenues dans un milieu de culture pour lymphocytes T à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone.Préparez les solutions suivantes : solution bain numéro un contenant trois millimolaire de magnésium et aucun calcium ; solution bain numéro deux, contenant 20 millimolaires de calcium ; solution bain numéro trois contenant 10 millimolaires de chélateur de calcium, H-E-D-T-A, et aucun ion divalent ; et solution pour pipette contenant 12 millimolaires de chélateur de calcium bta. Conservez les solutions à quatre degrés Celsius pendant une durée maximale d'une semaine. Le jour de l'expérience, tirez des pipettes ayant un diamètre d'embout d'environ deux micromètres à l'aide de capillaires en verre et d'un tireur de pipettes.Utilisez un tube en silice avec filament dont les spécifications sont indiquées ici et énumérées dans le texte accompagnant. Après l'étirage, les extrémités des pipettes sont recouvertes d'un revêtement protecteur semi-conducteur PEC R 61 0 1 et polies à la flamme. Conservez-les dans un endroit protégé de la poussière, par exemple un support pour pipettes.Ouvrez le logiciel de commande de l'amplificateur de patch clamp ici. Un amplificateur de patch clamp EPC 10 est contrôlé par le logiciel Pulse. Configurez et enregistrez le paramétrage sur les macros « on cell » et « whole cell » utilisées pour la formation du scellement gigaohm et l'établissement de la configuration en tout-cellule.Ensuite, dans le logiciel d'acquisition, configurez et enregistrez ici le protocole de stimulation afin d'enregistrer les courants de fissuration. Le protocole d'acquisition dans la fenêtre de génération d'impulsions est défini comme une rampe de tension allant de moins 120 à plus 100 millivolts pendant une durée de 50 millisecondes.Créez deux protocoles de stimulation avec des fréquences de stimulation en rampe de tension de 0,5 hertz et de cinq hertz, et enregistrez-les dans la fenêtre de génération d'impulsions sous les noms respectifs de rampe un et rampe deux. Pour préparer les cellules, déposez 500 microlitres de la suspension cellulaire contenant de 0,2 à 0,5 million de cellules dans une chambre d'enregistrement constituée d'un coverslip revêtu de polyolysine et d'un anneau en silicone fixé. Incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.Après l'incubation, fixez la chambre d'enregistrement dans un support de chambre. Ici, un support de chambre sur mesure est utilisé, dont la partie inférieure soutient la lame couvre-objet située au fond de la chambre, tandis que la partie supérieure appuie contre le dessus de la lame couvre-objet. Placez le support de chambre sur la platine du microscope inversé en utilisant un objectif à immersion huile de 40 x et une illumination en champ clair.Recherchez un champ de cellules et faites la mise au point. Placez l'électrode de référence au chlorure d'argent dans le bain. Ensuite, alignez un système de perfusion multicanaux par gravité en plaçant l'extrémité du tube d'entrée à 45 degrés par rapport à la lame, près du champ de vision ; le tube d'aspiration est inséré dans la partie supérieure du support de chambre.Faites tourner la partie supérieure du support de chambre jusqu'à ce que le tube de succion soit opposé au tube d'entrée afin d'effectuer le canal correct. Les enregistrements de courant commencent par l'ouverture du robinet du système de perfusion pour perfuser la chambre d'enregistrement avec une solution sans calcium. La solution de bain numéro un contenant 3 millimolaire de magnésium, supplémentée avec 0,5 à 1 micromolaire d'AP argon pendant huit à 10 minutes, permet de bloquer la pompe circa.Cette étape épuise le stockage de calcium. Ensuite, utilisez un micro-chargeur einor avec une pipette à déplacement d'air P 20. Pour remplir la pipette avec la solution de pipetage, insérez la pipette dans le support situé sur la platine de l'amplificateur ici.Un dispositif personnalisé de pression et d'aspiration est connecté à une source d'air comprimé et aux lignes de vide. Pour créer une pression positive ou négative dans une pipette de patch, appliquez une légère pression positive d'environ trois pouces d'eau à l'intérieur de la pipette en raccordant celle-ci à la sortie du dispositif de pression et d'aspiration au moyen d'un tube de connexion. Cliquez sur la touche de configuration dans la fenêtre du clampage de patch EPC 10 à l'écran de l'ordinateur.Pour exécuter la macro de configuration, recherchez une cellule ronde de taille moyenne possédant une surface externe lisse et fermement attachée à la lame. Abaissez ensuite l'électrode de patch dans le bain sous contrôle visuel au moyen du microscope dans la fenêtre de l'oscilloscope.Le courant traversant la pipette peut être observé après immersion de la pipette dans la solution bain. Une variation en escalier de l'amplitude du courant est provoquée par une impulsion de tension de cinq millivolts appliquée à la pipette par la macro de configuration. Le logiciel calcule automatiquement la résistance de la pipette et l'affiche dans la fenêtre de résistance membranaire.Sur l'écran de l'ordinateur, la résistance de la pipette est généralement comprise entre cinq et six mégohms. Cliquez sur la touche de commande automatique dans la fenêtre de l'amplificateur à l'écran de l'ordinateur pour corriger le potentiel de décalage généré entre la pipette et l'électrode de référence. Le courant de base passera à un niveau de courant nul.Utilisez le micromanipulateur pour amener l'extrémité de la pipette en contact avec la membrane cellulaire. Une fois le contact établi, l'amplitude du courant induit par l'impulsion test diminue. Appliquez une pression négative de 20 à 40 pouces d'eau sur la pipette de patch. Surveillez la formation du scellement gigaseal dans la fenêtre de l'oscilloscope. L'amplitude du courant induit par l'impulsion de test doit progressivement diminuer à mesure que la valeur de la résistance de la pipette augmente jusqu'à dépasser cinq gigaohms. En général, le contact gigaseal se forme rapidement, mais il peut également falloir une à deux minutes pour obtenir un scellement gigaseal stable.Une fois le scellement gigaseal obtenu, déconnectez le porte-pipette du dispositif d'aspiration sous pression en retirant le tube de raccordement de la sortie. Cliquez sur la touche de commande « onsell » à l'écran de l'ordinateur pour exécuter la macro « onsell », configurée préalablement à l'expérience. Selon le manuel de l'EPC 10, compensez la capacité de la pipette en cliquant sur la touche de commande automatique dans la fenêtre cfat.Dans la fenêtre de l'oscilloscope, le transitoire de courant disparaîtra et la valeur de la capacité de la pipette apparaîtra dans la fenêtre cfat pour rompre la membrane cellulaire. À l'intérieur de la pipette, reliez la pipette à une seringue de 20 centimètres cubes au moyen du tube de connexion et tirez doucement le piston afin d'appliquer une pression négative supplémentaire à la pipette. Lorsque la membrane cellulaire à l'intérieur de la pipette se rompt, deux transitoires de courant chargent la membrane cellulaire à un nouveau niveau de tension et apparaissent. Cliquez sur la touche de contrôle « cellule entière » à l'écran de l'ordinateur pour exécuter la macropréréglage en mode cellule entière.Ensuite, pour définir le potentiel de maintien, saisissez +30 millivolts dans la fenêtre V membrane ; un potentiel de maintien positif aide à prévenir l'activation du canal de fuite dépendant du calcium. Cliquez ensuite sur la touche auto contrôle dans la fenêtre C lente. Pour compenser la capacité cellulaire dans la fenêtre de l'oscilloscope, le transitoire de courant disparaîtra.Les valeurs de la capacité cellulaire et de la résistance en série apparaîtront respectivement dans les fenêtres C lente et R série. La résistance en série se situe généralement dans la plage de sept à vingt méga. Les valeurs de C lente, qui correspondent aux valeurs de la capacité cellulaire, sont généralement comprises entre 1,5 et 2,5 pico farad.Dans les lymphocytes T humains au repos, cliquez sur la touche de contrôle « ramp one » dans la fenêtre de l'oscilloscope pour appliquer une série de rampes de tension avec une fréquence de 0,5 hertz. Cela exécutera le protocole de stimulation généré et enregistré précédemment dans la fenêtre de l'oscilloscope. Les courants induits par les rampes de tension sont affichés. Enregistrez.Ces courants enregistrés dans la solution numéro un sans calcium contenant trois millimolars de magnésium. Dans cette solution, le courant CRAC est très faible en raison de la faible perméabilité des canaux CRAC pour le magnésium. Utilisez ces enregistrements dans les analyses futures comme courants de fuite.L'amplitude absolue de la fuite à moins 100 millivolts doit être égale ou inférieure à cinq picoampères. Si la cellule est perméable, arrêtez l'expérience et recommencez avec une nouvelle micropipette et une nouvelle cellule.Ensuite, pour enregistrer le courant calcique via les canaux CRAC, basculer les vannes de perfusion afin de remplacer la solution bain numéro un par la solution bain numéro deux contenant 20 millimolaire de calcium. Cela permet aux ions calcium de circuler à travers les canaux CRAC et de produire un courant entrant dans la fenêtre de l'oscilloscope. Un courant calcique rectifiant vers l'intérieur via les canaux CRAC développe une amplitude de courant à des potentiels négatifs et continue d'augmenter pendant environ une minute en raison de la potenciation dépendante du calcium du courant CRAC.Cliquez sur la touche de contrôle de rampe deux dans la fenêtre de l'oscilloscope pour exécuter un protocole de stimulation prédéfini, qui modifie la fréquence de stimulation par des rampes de tension avec une augmentation de cinq hertz. Cette augmentation de la fréquence de stimulation permet d'enregistrer le courant sodique maximal à travers les canaux CRAC, de nature transitoire. Ensuite, commutez à nouveau les vannes de perfusion pour remplacer la solution de bain numéro deux par la solution numéro trois sans cations divalents mais contenant du sodium, dans la fenêtre de l'oscilloscope. Un courant sodique entrant transitoire de plus grande amplitude, à rectification entrante, apparaît via les canaux CRAC.Une fois l'expérience terminée, fermez le fichier ; cela enregistre les tracés de courant enregistrés pour une analyse ultérieure. Pour analyser les données, récupérez les enregistrements de courant sauvegardés dans un logiciel d'analyse. Ici, le logiciel Pulse est utilisé pour l'analyse, à l'aide de paires de curseurs dans la fenêtre d'oscilloscope du programme Pulse. Mesurez les amplitudes de courant au début et à la fin des rampes de tension ici.Les amplitudes de courant sont mesurées à moins 100 millivolts et à plus 100 millivolts. Exportez les valeurs des amplitudes de courant vers un logiciel de graphisme, tel que le logiciel d'analyse et de graphisme scientifique Origin. Pour une analyse complémentaire et une présentation graphique, les courants crack ont été mesurés dans des lymphocytes T CD3 positifs au repos provenant d'un sujet humain en bonne santé, en utilisant la méthode décrite ici. Cette figure montre le cours temporel des courants crack enregistrés en configuration de blocage de tension en cellule entière à moins 100 millivolts, indiqués par les cercles pleins, et à plus 100 millivolts, indiqués par les cercles creux.Avant la formation du scellement giga, la cellule a été pré-incubée environ 10 minutes dans une solution bain numéro un sans calcium contenant 3 millimolaire de magnésium. Après l’établissement du scellement, une solution bain contenant 0,5 micromolaire d’orthogon a été appliquée. Les solutions ont été appliquées séquentiellement comme suit : solution bain numéro un sans calcium contenant 3 millimolaire de magnésium, suivie de la solution bain numéro deux contenant 20 millimolaire de calcium, suivie de la solution bain numéro trois sans cations divalents, puis à nouveau la solution bain numéro deux contenant 20 millimolaire de calcium. La cellule a été stimulée par une série de rampes de tension allant de −120 millivolts à +100 millivolts, comme indiqué ici.Des rampes de tension ont été appliquées toutes les 200 millisecondes, soit à une fréquence de cinq hertz, dans la solution de bat numéro trois sans cations divalents, et toutes les deux secondes, soit à une fréquence de 0,5 hertz, dans toutes les autres solutions. Remarquez le développement lent du courant calcique via les canaux de type crack après l'application de la solution de bat numéro deux contenant 20 millimolaire de calcium, et le développement rapide et transitoire du courant sodique via les canaux de type crack dans la solution de bat numéro trois sans cations divalents. Cette figure montre des tracés de courant représentatifs enregistrés pendant les rampes de tension en absence de calcium.Solution bain contenant 3 mM de magnésium, solution bain numéro un contenant 20 mM de calcium, et solution bain sans cations divalents. Numéro trois, les tracés des courants calcique et sodique au cours des rampes de tension individuelles peuvent être obtenus en soustrayant les courants enregistrés dans la solution bain sans calcium contenant 3 mM de magnésium, numéro un, des courants enregistrés dans la solution bain contenant 20 mM de calcium, numéro deux, et dans la solution bain sans cations divalents, numéro trois. Les tracés de courant obtenus, montrant des relations courant-tension typiques des courants calcique et sodique via les canaux CRAC, sont visibles ici.Une fois la maîtrise de cette technique acquise et toutes les étapes de la procédure correctement exécutées, on peut enregistrer des courants de canal de fissure de cinq à dix cellules par jour. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'enregistrer les courants de correction au repos dans les lymphocytes T humains. En suivant cette procédure, vous devriez également être capable d'enregistrer les courants corrects dans d'autres cellules du système immunitaire, telles que les lymphocytes T humains activés, les monocytes, les macrophages, ainsi que dans des lignées cellulaires. Électrophysiologique.L'enregistrement des courants ioniques dans les canaux de fuite au niveau des cellules du système immunitaire pourrait permettre aux chercheurs d'établir leur rôle dans l'homéostasie calcique des cellules immunitaires.

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Biologie

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