Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll

Les cellules immunitaires s’infiltrent dans le système nerveux central lors d’une infection, d’un traumatisme, d’une auto-immunité ou d’une neurodégénérescence. Bien que des approches histochimiques puissent être utilisées pour déterminer l’emplacement des cellules infiltrantes et pour analyser la pathologie associée, ces techniques sont limitées par le nombre d’anticorps pouvant être utilisés simultanément. Ici, une méthode d’isolement rapide de cellules mononucléées à partir de tissus du cerveau et de la moelle épinière est présentée dans laquelle le tissu disséqué est d’abord homogénéisé.

Ensuite, un gradient de perol est mis en place et après la centrifugation, les cellules mononucléées sont collectées à partir de l’interface. Enfin, les cellules sont rincées et colorées avec des anticorps Grâce à l’analyse par cytométrie en flux, les cellules hématogènes et la microglie de surveillance sont distinguées et leurs proportions relatives au cours des états pathologiques peuvent être déterminées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le gradient d’Aris ou dans une telle histochimie, est qu’elle prend moins de temps.

Cela vous permet de traiter plus de tissus en même temps. La démonstration de la configuration du gradient sera effectuée par un technicien de mon laboratoire Préparez les réactifs qui seront nécessaires pour ce protocole. En commençant par quatre millilitres de sirop isotonique d’origine appelé SIP par cerveau.

Pour ce faire, combinez neuf parties de perol avec une partie 10 fois HBSS sans calcium et magnésium mélangés par inversion. Ensuite, préparez 70 % par appel tout en mélangeant le SIP préparé avec une fois HBSS sans calcium ni magnésium. Ensuite, versez deux millilitres de 70 % par cole dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres pour recueillir les tissus.

Pour cette procédure, placez les cerveaux et les moelles épinières disséqués de toutes les souris étudiées dans des béchers contenant 10 millilitres de RPMI sur de la glace. Ensuite, transférez le tissu dans un homogénéisateur de duvet de sept ou 15 millilitres contenant trois millilitres d’une fois HBSS avec une taille lâche. Un pilon fabrique doucement une suspension cellulaire, puis passe à un pilon de taille B bien ajusté et dissocie davantage les tissus.

Une fois le tissu homogénéisé, ajoutez du RPMI ou une fois HBSS à un volume final de sept millilitres et procédez à la mise en place du gradient pour mettre en place le gradient percoco. Commencez par ajouter trois millilitres de SIP à la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de PERCOCO de 30 %Gardez à l’esprit que le perol doit être utilisé à température ambiante. S’il est utilisé à froid, les cellules ont tendance à s’agglutiner et la séparation cellulaire est moins efficace.

Ensuite, à l’aide de notre aide à la pipette pour régler le mode de gravité, superposez lentement la suspension de cellules de 10 millilitres sur le 70 % SIP. Évitez de mélanger les solutions à 70 % et à 30 %. Il s’agit de l’étape la plus critique de la procédure.

Une ligne plate très claire doit être visible à la jonction de 70 à 30 %. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car les solutions third et 70 % se mélangeront pendant la superposition. Étape suivante, compromettre l’interface Centrifugeuse 30 minutes de 500 Gs à 18 degrés Celsius.

Assurez-vous que la centrifugeuse s’arrêtera avec une pause minimale ou nulle afin que l’interface ne soit pas perturbée. Après avoir fait tourner les dégradés, une couche épaisse et visqueuse de débris doit s’accumuler au sommet du tube. La couche suivante est la couche jaunâtre de 30 % par couche centrale, qui contient parfois des débris.

Vient ensuite l’interface 70 à 30, qui doit avoir un halo blanc défini et contenir les cellules mononucléaires. Enfin, au fond du tube se trouve la couche transparente de 70 % de porol. Si aucune interface n’est observée, le rendement des cellules sera probablement très faible, ce qui rendra l’analyse extrêmement difficile.

Par conséquent, à ce stade, des suspensions de cellules fraîches pourraient être nécessaires pour réduire la contamination. Retirez délicatement la couche de débris du haut du tube et jetez-la. Ensuite, à l’aide d’une pipette en plastique, passez à travers les 30 % supérieurs par couche centrale et collectez deux à trois millilitres de l’interphase 70 30 et transférez-les dans un tube conique propre contenant huit millilitres d’une fois HBSS.

Mélanger les interfaces diluées plusieurs fois par inversion, puis centrifuger pendant sept minutes à 500 GS à 18 degrés Celsius. Après l’essorage, retirez le supena et remettez la pastille en suspension. Dans un millilitre de tampon de coloration cellulaire, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre et lavez-la une fois de plus.

À l’aide d’une micro-centrifugeuse à 10 000 GS pendant une minute à quatre degrés Celsius avant de procéder à la coloration des anticorps pour effectuer la coloration des anticorps, remettre les pastilles en suspension dans 50 microlitres d’anti-US CD 16, CD 32 purifié, dilué un à 200 dans un tampon de coloration cellulaire pour bloquer les sites de liaison FC. Comme pour toute procédure de coloration, il est impératif que tous les anticorps soient correctement titrés et incubés sur de la glace pendant 10 minutes. Pendant l’incubation, prélevez deux à cinq microlitres de cellules et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre.

Les tissus naïfs combinés du cerveau et de la moelle épinière devraient produire environ trois à cinq fois 10 à cinq cellules par souris. Les cerveaux enflammés auront un nombre variable de cellules inflammatoires en fonction du moment où elles sont collectées et du modèle de la maladie. Après l’incubation avec CD 16 et CD 32, ajoutez 50 microlitres de mélange d’anticorps spécifiques aux cellules immunitaires. Le mélange utilisé dans cet exemple contient des anticorps contre le CD 45, le CD 4 et le CD 19 incubés sur glace pendant 30 minutes.

Il est important de noter que chaque anticorps doit d’abord être titré. Pour évaluer la dilution optimale, utilisez des combinaisons de fluorochromes appropriées choisies en fonction des capacités du laser et des paramètres de filtre de votre débit particulier. Le cytomètre, après avoir coloré les cellules, les lave dans un tampon de coloration cellulaire en ajoutant un millilitre de tampon de coloration cellulaire et en les faisant tourner pendant une minute.

À 10 000 G après la rotation, jeter l’agent en décubitus dorsal, puis remettre en suspension les palettes dans 100 à 200 microlitres de tampon de coloration cellulaire pour une analyse cytométrique en flux immédiat pour une analyse ultérieure. Reus suspend les cellules dans du formaldéhyde à 2 % préparé dans du PBS et les stocke pendant la nuit à quatre degrés Celsius. On voit ici des cellules mononucléées obtenues et incubées avec un bloc FC, suivies d’anticorps anti-CD 45, CD quatre et CD 19.

Conformément au protocole démontré par cytométrie en flux, la coloration du CD 45 sépare bien les cellules hématogènes supérieures du CD 45, la microglie de surveillance DIM. Cette figure compare les cellules isolées d’un cerveau naïf et d’un cerveau enflammé d’une souris induites à développer une encéphalomyélite auto-immune expérimentale. CD 45 L’intensité d’une PC est représentée sur l’axe des Y où trois populations distinctes sont visualisées dans le cerveau naïf.

Très peu de cellules de CD 45 sont détectées. Généralement moins de 2 % de la population isolée totale. En comparaison, les cerveaux de souris atteintes d’EAE montrent un afflux massif de cellules sanguines recrutées dans le cerveau.

L’ajout d’autres marqueurs de surface cellulaire tels que CD 11 b, CD quatre, CD huit, etc., permet une caractérisation plus poussée de la population élevée de CD 45 Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les approches histologiques associées au phénotypage immunitaire par cytométrie en flux sont essentielles pour caractériser pleinement la composition des infiltrats inflammatoires du SNC.