Name: Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Apprenez à isoler rapidement les cellules mononucléées du cerveau et de la moelle épinière chez la souris en utilisant des gradients de Percoll discontinus. Cette méthode permet une analyse phénotypique détaillée par cytométrie en flux des populations immunitaires infiltrant le SNC.

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Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society (AT 3021-A1 / T pour AEC) et l&#39;Université du Texas à San Antonio.

Préparation des réactifs Préparez le bouillon isotonique Percoll (SIP), 4 ml par le cerveau, en mélangeant 9 volumes de Percoll avec une partie de HBSS 10X sans Ca + + et Mg + +. Préparer SIP à 70% en 1X HBSS sans Ca + + et Mg + +, 2 ml par le cerveau dispensés dans un tube de 15 ml en polypropylène coniques. Note: Il est recommandé que Percoll doit être utilisée à température ambiante, s'il est utilisé à froid, les cellules ont tendance à s'agglutiner et à la séparation des cellules est moins efficace. Collection de tissus et d'homogénéisation Anesthetize souris et perfuser à travers le ventricule gauche, avec glacée HBSS 1X. Disséquer le cerveau et la moelle épinière et de maintenir en RPMI sans rouge de phénol jusqu'à ce que toutes les souris sont sacrifiées. Placer les tissus en 7 ou 15 ml Dounce homogénéisateur contenant 3 ml de RPMI, doucement prendre une suspension de cellules avec un pilon lâches (Une taille) suivie par un pilon Tigh-montage (taille B) de continuer à dissocier les tissus. Compléter le volume de la suspension cellulaire à 7 ml avec du RPMI. Dégradé mis en place Ajouter 3 ml de SIP à la suspension cellulaire pour faire un SIP finale de 30% Lentement couche de la suspension cellulaire 10 ml au sommet de la SIP à 70%. C'est l'étape la plus critique de la procédure, utiliser une pipette de secours mis en mode gravité en évitant le mélange des 70% et 30% des solutions. Une ligne très claire plate devraient être visibles à la jonction de -30% à 70%. Centrifuger 30 min à 18 ° C. 500G Assurez-vous centrifugeuse s'arrête avec frein peu ou pas de telle sorte que l'interphase n'est pas perturbé. En utilisant une pipette de transfert, retirer délicatement la couche de débris provenant du haut du tube de 2,0 à 3,0 ml et recueillir de l'interphase 70% -30% dans un tube propre coniques contenant 8 ml de 1X HBSS. S'assurer que le Percoll contenant de l'interphase est dilué environ trois fois, mélanger à quelques reprises par inversion et centrifugre 7 min à 500G à 18 ° C. Resuspendre le culot dans 1 ml de tampon de coloration des cellules et le transférer dans un tube de 1,5 ml et laver une fois de plus l'aide d'une micro-centrifugeuse à 10.000 G 1 min à 4 ° C. Coloration des anticorps Granulés Remettre en suspension dans 50 pl de purifier antisouris CD16/CD32 dilué 1:200 dans un tampon de coloration des cellules pour bloquer les sites Fc contraignant. Incuber sur la glace pendant 10 min. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Ajouter 50 ul de mélange de cocktail d'anticorps et incuber sur de la glace pendant 30 min. Chaque anticorps doit d'abord être titré pour évaluer la dilution optimale. Utiliser les combinaisons fluorochrome choisi selon les capacités du laser et des paramètres de filtre de votre cytomètre en flux particulier. Laver les cellules dans un tampon de coloration des cellules, des pastilles resuspendre dans 100-200 ul de tampon de coloration des cellules et d'analyser immédiatement dans le cytomètre, ou bien les cellules peuvent être remises en suspension dans 2% de paraformaldéhyde (PFA) préparée dans du PBS et stockées pendant une nuit à 4 ° C . Les résultats représentatifs: Après filer les gradients, l'interphase 70% -30% devrait avoir un halo blanc défini, et la quantification des cellules récupérées à partir d'une souris naïve devrait donner 3-5 x10 5 cellules par souris (cerveau, plus de la moelle épinière). Enflammé du cerveau pourrait avoir un nombre allant de cellules inflammatoires en fonction de l'insulte du SNC ou modèle de la maladie (figure 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Isolement de cellules mononucléées, de naïf et EAE-cerveau à la maladie de pointe. Les cellules du cerveau suspensions ont été séparés plus discontinue de 70% / 30% des gradients de Percoll. Tachés cellules ont été incubées avec Fc-block suivi par des anticorps anti-CD45 pendant 30 min sur la glace. Les cellules ont été rincées dans un tampon de coloration des cellules, et fixé dans l'acquisition de PFA 2% avant dans un LSR-II. CD45 intensité est mesurée dans l'axe Y, où trois populations distinctes sont visualisés. Une caractérisation plus poussée du phénotype immunitaire des cellules CD45 Salut infiltrant est implémenté en utilisant des anticorps supplémentaires et ensuite analysés par cytométrie en flux.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

Les analyses des marqueurs de surface cellulaire dans les leucocytes dans les tissus du système nerveux central de souris normales et enflammée a été utilisé pendant plusieurs décennies 1-3. Protocoles d&#39;isolement sont basés dans la séparation de la microglie et des leucocytes par centrifugation 4 densité. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace d&#39;isoler les leucocytes SNC utilisant gradients de Percoll discontinu. Après isolement des cellules, la coloration avec des anticorps tel...

Homogénéisation des tissus et Dégradés <ul><li> Percoll (Amersham) </li><li> 10X Hanks Balanced Salt Solution, sans calcium et magnésium (Gibco) </li><li> Milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol (Gibco) </li><li> 7 ml ou 15 ml de tissus Dounce Meuleuses (VWR) </li></ul> La cytométrie en flux <ul><li> Tampon de coloration cellulaire (Biolegend) </li><li> Rat purifié anti-souris CD16/CD32 (Souris BD Fc Block), BD Pharmingen </li><li> Hémacytomètre (Fisher) </li><li> Anti-souris CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend </li><li> Phosphate 10X saline tamponnée, sans calcium ni magnésium (Thermo Scientific) </li><li> Paraformaldéhyde (Sigma Aldrich) </li><li> L&#39;analyse par cytométrie en flux effectuées avec un LSR II (BD Biosciences) </li></ul>

isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de percoll

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolement des cellules du système immunitaire qui infiltrent le système nerveux central (SNC) lors d&#39;une infection, un traumatisme, une auto-immunité ou de la neurodégénérescence, est souvent nécessaire pour définir leur phénotype et les fonctions effectrices. Des approches histochimiques sont instrumentales pour déterminer l&#39;emplacement des cellules infiltrant et d&#39;analyser le système nerveux central pathologie associée. Cependant, in situ histochimie et techniques en immunofluorescence sont limitées par le nombre d&#39;anticorps qui peuvent être utilisés à un moment unique pour caractériser les sous-types de cellules immunitaires dans un tissu particulier. Par conséquent, les approches histologiques en conjonction avec le système immunitaire de phénotypage en cytométrie en flux sont essentielles pour caractériser complètement la composition de l&#39;infiltration du SNC locales. Ce protocole est basé sur la séparation des suspensions cellulaires du SNC au cours gradients de Percoll discontinu. Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour l&#39;identification des différentes populations de cellules immunitaires dans un seul échantillon par cytométrie en flux.

Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour des analyses de cytométrie en flux.

Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll

L'isolation des cellules immunitaires qui infiltrent le système nerveux central (SNC) lors d'une infection, d'un traumatisme, d'une auto-immunité ou d'une neurodégénérescence est souvent requise...

Les cellules immunitaires pénètrent dans le système nerveux central lors d'une infection, d'un traumatisme, d'une maladie auto-immune ou d'une neurodégénérescence. Bien que les approches histochimiques permettent de déterminer la localisation des cellules infiltrantes et d'analyser la pathologie associée, ces techniques sont limitées par le nombre d'anticorps pouvant être utilisés simultanément. Une méthode de purification rapide de cellules mononucléées à partir de tissus cérébraux et médullaires est décrite ici, dans laquelle le tissu disséqué est d'abord homogénéisé.Ensuite, un gradient de Percoll est mis en place et, après centrifugation, les cellules mononucléées sont récupérées à l'interface. Enfin, les cellules sont lavées et marquées par des anticorps. Par analyse en cytométrie en flux, les cellules d'origine hématogène et les microglies de surveillance sont distinguées, et leurs proportions relatives au cours des états pathologiques peuvent être déterminées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le gradient Aris ou l'histochimie, est qu'elle est moins longue.Cela vous permet de traiter plus de tissus simultanément. Palino A, une technicienne de mon laboratoire, va démontrer la mise en place du gradient. Préparez les réactifs nécessaires pour ce protocole. Commencez avec quatre millilitres de Percoll isotonique stock, appelé SIP, par cerveau.Pour ce faire, mélangez neuf parts de perol avec une part de HBSS 10× sans calcium ni magnésium en retournant le tube. Ensuite, préparez 70 % de per call en mélangeant le SIP préparé avec du HBSS 1× sans calcium ni magnésium. Puis, distribuez deux millilitres de la solution à 70 % de per cole dans un tube conique polypropylène de 15 millilitres pour recueillir le tissu.Pour cette procédure, placer les cerveaux et moelles épinières disséqués de tous les souris d'étude dans des béchers contenant 10 millilitres de RPMI sur de la glace. Ensuite, transférer le tissu dans un homogénéisateur descendant de 7 ou 15 millilitres contenant 3 millilitres d'HBSS 1x avec un piston ajusté lâche. Homogénéiser délicatement pour obtenir une suspension cellulaire, puis passer à un piston de taille B ajusté étroitement, et poursuivre la dissociation des tissus.Une fois le tissu homogénéisé, ajouter du RPMI ou du HBSS 1x jusqu'à un volume final de sept millilitres, puis procéder à la préparation du gradient pour établir le gradient de percoco. Commencer par ajouter trois millilitres de SIP à la suspension cellulaire afin d'obtenir une concentration finale de PERCOCO de 30 %. Veiller à ce que le perol soit utilisé à température ambiante. S'il est utilisé froid, les cellules ont tendance à s'agglutiner et la séparation cellulaire est moins efficace.Ensuite, à l’aide de notre pipette munie d’un système de réglage en mode gravité, déposez lentement la suspension cellulaire de 10 millilitres au-dessus du SIP à 70 %. Évitez de mélanger les solutions à 70 % et à 30 %. Cette étape constitue la phase la plus critique du protocole.Une ligne plate très nette doit être visible au niveau de la jonction entre 70 et 30 %. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car les solutions à 3 % et à 70 % se mélangent lors de la superposition. Étape suivante, compromettant l'interface : centrifuger pendant 30 minutes à 500 G à 18 degrés Celsius.Veillez à ce que la centrifugeuse s'arrête avec un freinage minimal ou nul afin de ne pas perturber l'interface. Après la centrifugation des gradients, une couche épaisse et visqueuse de débris doit s'accumuler au sommet du tube. La couche suivante est la couche jaunâtre de 30 % de per core, qui contient parfois des débris.Viens ensuite l'interface 70 à 30, qui doit présenter un halo blanc bien défini et contient les cellules mononucléées. Enfin, au fond du tube, se trouve la couche claire de Percoll à 70 %. Si aucune interface n'est observée, le rendement en cellules sera probablement très faible, rendant toute analyse ultérieure extrêmement difficile.Par conséquent, à ce stade, des suspensions cellulaires fraîches peuvent être nécessaires pour réduire la contamination. Retirez soigneusement la couche de débris située au sommet du tube et jetez-la. Ensuite, à l’aide d’une pipette en plastique, traversez les 30 % supérieurs de la couche centrale et récupérez deux à trois millilitres de l’interphase 70-30, puis transférez-les dans un tube conique propre contenant huit millilitres d’HBSS à une fois.Mélangez plusieurs fois les interfaces diluées par retournement, puis centrifugez pendant sept minutes à 500 ×g à 18 degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez le surnageant et remettez en suspension le culot. Dans un millilitre de tampon de marquage des cellules, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre et lavez-la encore une fois.Utilisez une microcentrifugeuse à 10 000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius avant de procéder à la coloration par anticorps ; resuspendez les culots dans 50 microlitres d'anticorps purifié anti-US CD 16, CD 32, dilué au 1/200 dans un tampon de coloration cellulaire afin de bloquer les sites de fixation FC. Comme pour toute procédure de coloration, il est impératif que tous les anticorps soient correctement titrés ; incubez sur glace pendant 10 minutes. Pendant l'incubation, prélèvez deux à cinq microlitres de cellules et comptez-les à l'aide d'un hémocytomètre.Les tissus combinés de cerveau et de moelle épinière naïfs devraient fournir environ trois à cinq fois dix puissance cinq cellules par souris. Les cerveaux enflammés contiendront un nombre variable de cellules inflammatoires selon le point temporel de prélèvement et le modèle de maladie. Après l'incubation avec CD 16 et CD 32, ajouter 50 microlitres de mélange d'anticorps spécifiques des cellules immunitaires. Le mélange utilisé dans cet exemple contient des anticorps dirigés contre CD 45, CD 4 et CD 19 ; incuber sur glace pendant 30 minutes.Il est important de titrer chaque anticorps au préalable. Pour déterminer la dilution optimale, utilisez des combinaisons de fluorochromes adaptées en fonction des capacités des lasers et des réglages de filtres de votre cytomètre en flux particulier. Après avoir marqué les cellules, les laver dans le tampon de marquage des cellules en ajoutant un millilitre de tampon de marquage des cellules et en les centrifugeant pendant une minute.À 10 000 ×g après la centrifugation, éliminer le surnageant, puis resuspendre les culots dans 100 à 200 microlitres de tampon de marquage cellulaire pour une analyse cytométrique en flux immédiate ou ultérieure. Resuspendre ensuite les cellules dans du paraformaldéhyde à 2 % préparé dans du PBS et conserver une nuit à quatre degrés Celsius. On observe ici des cellules mononucléées obtenues et incubées avec un blocant FC, suivies d'anticorps anti-CD45, anti-CD4 et anti-CD19.Conformément au protocole démontré par cytométrie en flux, la coloration CD45 sépare nettement les cellules hématogènes CD45 élevées des microglies de surveillance CD45 faible intensité (DIM). Cette figure compare les cellules isolées à partir d’un cerveau naïf et d’un cerveau enflammé chez une souris induite à développer une encéphalomyélite auto-immune expérimentale. L’intensité du CD45 APC est indiquée sur l’axe des ordonnées, où trois populations distinctes sont visualisées dans le cerveau naïf.Très peu de cellules CD45 de forte expression sont détectées. Généralement moins de 2 % de la population totale isolée. En comparaison, les cerveaux de souris atteintes de la maladie EAE montrent un afflux massif de cellules sanguines recrutées vers le cerveau.L'ajout d'autres marqueurs de surface cellulaire, tels que CD11b, CD4, CD8, etc., permet une caractérisation plus poussée de la population CD45 élevée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les approches histologiques, combinées au phénotypage immunitaire par cytométrie en flux, sont essentielles pour caractériser pleinement la composition des infiltrats inflammatoires du SNC.

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