Name: Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Apprenez à isoler rapidement les cellules mononucléées du cerveau et de la moelle épinière chez la souris en utilisant des gradients de Percoll discontinus. Cette méthode permet une analyse phénotypique détaillée par cytométrie en flux des populations immunitaires infiltrant le SNC.

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Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society (AT 3021-A1 / T pour AEC) et l&#39;Université du Texas à San Antonio.

Préparation des réactifs Préparez le bouillon isotonique Percoll (SIP), 4 ml par le cerveau, en mélangeant 9 volumes de Percoll avec une partie de HBSS 10X sans Ca + + et Mg + +. Préparer SIP à 70% en 1X HBSS sans Ca + + et Mg + +, 2 ml par le cerveau dispensés dans un tube de 15 ml en polypropylène coniques. Note: Il est recommandé que Percoll doit être utilisée à température ambiante, s'il est utilisé à froid, les cellules ont tendance à s'agglutiner et à la séparation des cellules est moins efficace. Collection de tissus et d'homogénéisation Anesthetize souris et perfuser à travers le ventricule gauche, avec glacée HBSS 1X. Disséquer le cerveau et la moelle épinière et de maintenir en RPMI sans rouge de phénol jusqu'à ce que toutes les souris sont sacrifiées. Placer les tissus en 7 ou 15 ml Dounce homogénéisateur contenant 3 ml de RPMI, doucement prendre une suspension de cellules avec un pilon lâches (Une taille) suivie par un pilon Tigh-montage (taille B) de continuer à dissocier les tissus. Compléter le volume de la suspension cellulaire à 7 ml avec du RPMI. Dégradé mis en place Ajouter 3 ml de SIP à la suspension cellulaire pour faire un SIP finale de 30% Lentement couche de la suspension cellulaire 10 ml au sommet de la SIP à 70%. C'est l'étape la plus critique de la procédure, utiliser une pipette de secours mis en mode gravité en évitant le mélange des 70% et 30% des solutions. Une ligne très claire plate devraient être visibles à la jonction de -30% à 70%. Centrifuger 30 min à 18 ° C. 500G Assurez-vous centrifugeuse s'arrête avec frein peu ou pas de telle sorte que l'interphase n'est pas perturbé. En utilisant une pipette de transfert, retirer délicatement la couche de débris provenant du haut du tube de 2,0 à 3,0 ml et recueillir de l'interphase 70% -30% dans un tube propre coniques contenant 8 ml de 1X HBSS. S'assurer que le Percoll contenant de l'interphase est dilué environ trois fois, mélanger à quelques reprises par inversion et centrifugre 7 min à 500G à 18 ° C. Resuspendre le culot dans 1 ml de tampon de coloration des cellules et le transférer dans un tube de 1,5 ml et laver une fois de plus l'aide d'une micro-centrifugeuse à 10.000 G 1 min à 4 ° C. Coloration des anticorps Granulés Remettre en suspension dans 50 pl de purifier antisouris CD16/CD32 dilué 1:200 dans un tampon de coloration des cellules pour bloquer les sites Fc contraignant. Incuber sur la glace pendant 10 min. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Ajouter 50 ul de mélange de cocktail d'anticorps et incuber sur de la glace pendant 30 min. Chaque anticorps doit d'abord être titré pour évaluer la dilution optimale. Utiliser les combinaisons fluorochrome choisi selon les capacités du laser et des paramètres de filtre de votre cytomètre en flux particulier. Laver les cellules dans un tampon de coloration des cellules, des pastilles resuspendre dans 100-200 ul de tampon de coloration des cellules et d'analyser immédiatement dans le cytomètre, ou bien les cellules peuvent être remises en suspension dans 2% de paraformaldéhyde (PFA) préparée dans du PBS et stockées pendant une nuit à 4 ° C . Les résultats représentatifs: Après filer les gradients, l'interphase 70% -30% devrait avoir un halo blanc défini, et la quantification des cellules récupérées à partir d'une souris naïve devrait donner 3-5 x10 5 cellules par souris (cerveau, plus de la moelle épinière). Enflammé du cerveau pourrait avoir un nombre allant de cellules inflammatoires en fonction de l'insulte du SNC ou modèle de la maladie (figure 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Isolement de cellules mononucléées, de naïf et EAE-cerveau à la maladie de pointe. Les cellules du cerveau suspensions ont été séparés plus discontinue de 70% / 30% des gradients de Percoll. Tachés cellules ont été incubées avec Fc-block suivi par des anticorps anti-CD45 pendant 30 min sur la glace. Les cellules ont été rincées dans un tampon de coloration des cellules, et fixé dans l'acquisition de PFA 2% avant dans un LSR-II. CD45 intensité est mesurée dans l'axe Y, où trois populations distinctes sont visualisés. Une caractérisation plus poussée du phénotype immunitaire des cellules CD45 Salut infiltrant est implémenté en utilisant des anticorps supplémentaires et ensuite analysés par cytométrie en flux.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

Les analyses des marqueurs de surface cellulaire dans les leucocytes dans les tissus du système nerveux central de souris normales et enflammée a été utilisé pendant plusieurs décennies 1-3. Protocoles d&#39;isolement sont basés dans la séparation de la microglie et des leucocytes par centrifugation 4 densité. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace d&#39;isoler les leucocytes SNC utilisant gradients de Percoll discontinu. Après isolement des cellules, la coloration avec des anticorps tel...

Homogénéisation des tissus et Dégradés <ul><li> Percoll (Amersham) </li><li> 10X Hanks Balanced Salt Solution, sans calcium et magnésium (Gibco) </li><li> Milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol (Gibco) </li><li> 7 ml ou 15 ml de tissus Dounce Meuleuses (VWR) </li></ul> La cytométrie en flux <ul><li> Tampon de coloration cellulaire (Biolegend) </li><li> Rat purifié anti-souris CD16/CD32 (Souris BD Fc Block), BD Pharmingen </li><li> Hémacytomètre (Fisher) </li><li> Anti-souris CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend </li><li> Phosphate 10X saline tamponnée, sans calcium ni magnésium (Thermo Scientific) </li><li> Paraformaldéhyde (Sigma Aldrich) </li><li> L&#39;analyse par cytométrie en flux effectuées avec un LSR II (BD Biosciences) </li></ul>

isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de percoll

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolement des cellules du système immunitaire qui infiltrent le système nerveux central (SNC) lors d&#39;une infection, un traumatisme, une auto-immunité ou de la neurodégénérescence, est souvent nécessaire pour définir leur phénotype et les fonctions effectrices. Des approches histochimiques sont instrumentales pour déterminer l&#39;emplacement des cellules infiltrant et d&#39;analyser le système nerveux central pathologie associée. Cependant, in situ histochimie et techniques en immunofluorescence sont limitées par le nombre d&#39;anticorps qui peuvent être utilisés à un moment unique pour caractériser les sous-types de cellules immunitaires dans un tissu particulier. Par conséquent, les approches histologiques en conjonction avec le système immunitaire de phénotypage en cytométrie en flux sont essentielles pour caractériser complètement la composition de l&#39;infiltration du SNC locales. Ce protocole est basé sur la séparation des suspensions cellulaires du SNC au cours gradients de Percoll discontinu. Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour l&#39;identification des différentes populations de cellules immunitaires dans un seul échantillon par cytométrie en flux.

Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour des analyses de cytométrie en flux.

Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll

L'isolation des cellules immunitaires qui infiltrent le système nerveux central (SNC) lors d'une infection, d'un traumatisme, d'une auto-immunité ou d'une neurodégénérescence est souvent requise...

Les cellules immunitaires pénètrent dans le système nerveux central lors d'une infection, d'un traumatisme, d'une maladie auto-immune ou d'une neurodégénérescence. Bien que les approches histochimiques permettent de déterminer la localisation des cellules infiltrantes et d'analyser la pathologie associée, ces techniques sont limitées par le nombre d'anticorps pouvant être utilisés simultanément. Une méthode de purification rapide de cellules mononucléées à partir de tissus cérébraux et médullaires est décrite ici, dans laquelle le tissu disséqué est d'abord homogénéisé.Ensuite, un gradient de Percoll est mis en place et, après centrifugation, les cellules mononucléées sont récupérées à l'interface. Enfin, les cellules sont lavées et marquées par des anticorps. Par analyse en cytométrie en flux, les cellules d'origine hématogène et les microglies de surveillance sont distinguées, et leurs proportions relatives au cours des états pathologiques peuvent être déterminées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le gradient Aris ou l'histochimie, est qu'elle est moins longue.Cela vous permet de traiter plus de tissus simultanément. Palino

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Immunologie et infection

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Isolement de cellules mononucléées du système nerveux central de rats avec EAE

Nous présentons ici une méthode pour isoler et cultiver des cellules granulaires du cervelet et les neurones neurones progénitrices granulaires du cervelet de souris postnatale.

Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones

Une méthode rapide pour obtenir leucocytes infiltrants du cerveau murin est décrite. Cette méthode utilise un gradient de Percoll continue et gradient de Ficoll discontinu pour sélectionner et purifier la couche leuco-enrichi. Leucocytes isolés peuvent alors être caractérisées par des mesures de cytométrie en flux.

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Dans cette vidéo, nous effectuons l’isolement de cellules mononucléées du cerveau d’une souris à l’aide de la centrifugation par gradient de densité. La suspension isolée de cellules mononucléées peut être utilisée pour une analyse plus poussée en aval.

Isolement de cellules mononucléées à partir du cerveau de souris : une technique de centrifugation à gradient de densité pour isoler les cellules mononucléées résidentes du cerveau

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Isolement des neurones de la moelle épinière : une procédure de gradient de densité pour isoler les neurones de la moelle épinière néonatale pour les études in vitro

La vidéo démontre l’isolement de cellules mononucléées du sang périphérique infiltrant la tumeur à partir d’un cerveau de souris en utilisant la dissociation mécanique et la digestion enzymatique. Ceci est suivi d’une centrifugation à gradient de densité pour collecter les cellules immunitaires pour une analyse plus approfondie.

Isolement de cellules immunitaires infiltrant la tumeur d’un cerveau murin

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Préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir de tissu cérébral murin

Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules gliales primaires mixtes à partir de tissus de moelle épinière de souris adultes. Le protocole implique une digestion enzymatique du tissu, suivie de l’élimination des membranes cellulaires brisées et des débris de myéline pour obtenir une population unicellulaire. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu optimisé pour la croissance de cellules gliales mixtes.

Etablissement de cultures primaires de cellules gliales mixtes à partir d’une moelle épinière de souris

Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules cérébrales et des cellules immunitaires infiltrées des tissus cérébraux ischémiques de souris par digestion enzymatique, suivie de l’élimination des débris cellulaires et de la myéline par centrifugation à gradient de densité, afin d’étudier les réponses inflammatoires dans la recherche sur les accidents vasculaires cérébraux.

Obtention de suspensions cellulaires à partir de tissus cérébraux de souris ischémiques

Cet article présente deux protocoles optimisés pour l’examen des cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques du système nerveux central, y compris le cerveau, la moelle épinière et les méninges. Chacun de ces protocoles permet de déterminer la fonction et la composition des cellules occupant ces compartiments dans des conditions d’équilibre et inflammatoires.

Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

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