Surveillance des cellules immunitaires trafic fluorescent Rods Prion heures après l'infection par voie intrapéritonéale

L'objectif principal de cette procédure est de surveiller l'absorption et le trafic des prions par les cellules immunitaires quelques heures après l'infection. Commencez par purifier et marquer aux fluorochromes des agrégats de prions en forme de bâtonnets provenant de cerveau infecté, puis inoculez ces bâtonnets de prions dans la cavité péritonéale de souris. Après deux heures, prélèvez les cellules du péritoine, de la rate ainsi que des ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques. Enfin, soumettez les cellules récupérées à une coloration avec des marqueurs phénotypiques immunitaires et analysez-les pour détecter la rétention de Prion (PreOn).

Par exemple, les résultats de cytométrie en flux peuvent être utilisés pour montrer que les bâtonnets prioniques sont principalement retenus et transportés par les macrophages et les cellules dendritiques, secondairement par les monocytes et tertiairement par les lymphocytes B. Ce système expérimental vise à éclairer la nature des réservoirs de prions et les cibles thérapeutiques potentielles en répondant à des questions clés telles que : quelles cellules capturent les PreOn immédiatement après l'infection ? Où les acheminent-elles et à quelle vitesse y parviennent-elles ?

Pour démontrer cette procédure, Crystal, Mt. And Brady Michael, étudiants diplômés de mon laboratoire, recueilleront les protéines PreOn. Homogénéisez 100 milligrammes de tissu cérébral infecté par PreOn dans 900 millilitres de tampon d'homogénéisation glacé pendant une minute à vitesse maximale dans un mélangeur commercial, puis placez immédiatement sur de la glace pendant deux minutes. Répétez ce processus trois fois afin d'augmenter le rendement en protéines.

Centrifuger l'homogénat pendant 10 minutes à 3000 G et à quatre degrés Celsius. Retirer et conserver le surnageant sur glace. Resuspendre le culot dans un litre de hp et répéter les étapes d'homogénéisation et de centrifugation.

Maintenant, rassemblez le surnageant et centrifugez pendant 60 minutes à 100 000 ×g et à 0 °C. Éliminez le surnageant. Resuspendez le culot dans 100 millilitres de TBST.

Estimer la concentration en protéines par le dosage de Bradford et ajuster le volume à cinq milligrammes par millilitre de protéine dans du TBST. Refroidir sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger à nouveau pendant 30 minutes à 100 000 ×g et à zéro degré Celsius.

Jetez le SNA et lavez le culot d'abord avec 50 millilitres de TBST. Ensuite, resuspendez le culot obtenu dans 100 millilitres de TBS 1X contenant 1 % de sarcosyl et un cocktail d'inhibiteurs de protéases, puis agitez pendant 120 minutes à 37 degrés Celsius. Pour réaliser un gradient de saccharose, déposez l'échantillon sur 900 millilitres de saccharose à 320 millimolaire et centrifugez pendant 60 minutes.

À 100 000 ×g et 10 degrés Celsius. Jetez le surnageant et re-suspendez le culot dans 10 millilitres de chlorure de sodium 2,3 M, 5 % Sarco seal. Soniquez ensuite l'échantillon cinq fois pendant 40 secondes à 70 % de la puissance maximale, à des intervalles d'une minute.

Éluer un millilitre d'échantillon dans des tubes Eppendorf et centrifuger pendant 15 minutes à 13 000 ×g et 4 °C. Laver les culots deux fois avec du TBS et conserver les stocks à −70 °C. Conjuguer un tube de bâtonnets PreOn purifiés en utilisant un flacon de fluorochrome DITE 649 selon le protocole du fabricant.

Enfin, remplacer le tampon de marquage par du PBS par centrifugation à travers des colonnes filtrantes. Conserver en aliquotes de 20 microlitres à moins 70 degrés Celsius, à l’abri de la lumière, jusqu’à l’utilisation. Cette section comprend l’inoculation intrapéritonéale, les prions, ainsi que la récupération de cellules provenant du péritoine, des ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques et de la rate, immédiatement avant l’utilisation du prion fluorescent en boucle D.

Saisir le rongeur par le pelage du cou à l’aide du pouce et de l’index dans une solution tamponnée au phosphate (PBS) contenant des souris de souche scruff. Tourner délicatement la souris vers vous et immobiliser la queue avec votre auriculaire. Placer la souris en supination, en élevant le tronc postérieur au-dessus de la tête et en la tenant légèrement la tête en bas.

À l’aide d’une seringue à insuline de calibre 30, injecter 100 microlitres de bâtonnets fluorescents pion, à un centimètre latéral de la ligne médiane et entre un et deux centimètres en avant de l’articulation ilio-sacrée. Introduire l’aiguille d’un centimètre à travers la peau en la dirigeant à 45 degrés vers la ligne médiane. Pour les souris témoins, utiliser une dilution de billes fluorescentes au 1/50 ou du PBS seul. Selon le plan expérimental, incuber les souris pendant la durée prévue avant de commencer les analyses.

Endormir les souris conformément aux protocoles approuvés par le comité de soins et d'utilisation des animaux. Injecter 10 millilitres de PBS dans la cavité péritonéale à l'aide d'une seringue de 12 millilitres et d'une aiguille de 25 gauge. Balancer doucement la souris dans le sens longitudinal pendant une minute pour poursuivre la dissection de la souris.

Mouiller complètement la face ventrale du pelage de la souris avec de l'éthanol à 70 %. Soulever la peau au niveau de la ligne médiane, juste sous la cage thoracique, à l’aide de pinces, puis pratiquer une petite incision dans la peau avec des ciseaux. Réaliser une incision cutanée de trois à cinq centimètres de long dans les deux sens, vers la tête et vers la queue.

Deux incisions de deux centimètres à partir de la ligne médiane vers la périphérie à chaque extrémité, puis écarter et épingler la peau pour mettre à jour les cavités péritonéale et thoracique. Récupérer la suspension cellulaire du péritoine à l’aide de la même seringue et d’une aiguille de calibre 16. Placer l’exsudat dans un tube conique de 15 millilitres et le conserver sur de la glace.

Couper soigneusement la membrane mince et translucide entourant le péritoine et rabattre le thorax pour mettre au jour le médiastin. Repérer ensuite deux à quatre ganglions lymphatiques médiastinaux et les retirer ; ils se situent légèrement en position dorsale et latérale par rapport au thymus, en proximité médiale de l'artère brachio-céphalique, près de la face ventrale de la trachée. Puis, repérer et retirer jusqu'à six ganglions lymphatiques mésentériques intégrés dans le tissu blanc et mou du mésentère, qui fixe les intestins à la paroi abdominale postérieure.

Conserver les ganglions lymphatiques dans un millilitre de milieu PMI 1640 sur de la glace jusqu'à la fin de la dissection. Enfin, localiser et retirer la rate. Un organe allongé de couleur rouge foncé situé juste en position latérale par rapport à la ligne médiane et en position dorsale par rapport aux intestins, du côté gauche de la souris.

À l’aide du piston d’une seringue d’un millilitre, macérer et presser les ganglions lymphatiques à travers un tamis de 40 microns dans trois millilitres de PBS dans une boîte de Pétri en plastique. Rincer le tamis avec deux millilitres supplémentaires de PBS et transférer la suspension cellulaire totale de cinq millilitres dans un tube conique de 15 millilitres. Rincer également la boîte de Pétri avec cinq millilitres supplémentaires de PBS et transférer le liquide dans le même tube.

Centrifuger l'échantillon pendant cinq minutes à 250 ×g. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire. Transférer les cellules isolées dans un tube EOR de 1,5 millilitre à l'aide d'un millilitre de tampon fax.

Typiquement, ce protocole de coloration peut être utilisé pour identifier les sous-populations de cellules immunitaires, en utilisant des anticorps fluorescents dirigés contre des marqueurs de surface bien caractérisés des cellules immunitaires afin de diluer tous les anticorps dans du tampon fax. Juste avant utilisation, compter les cellules et aliquoter 10 puissance six cellules dans des tubes einor, centrifuger pour former un culot cellulaire, puis laver le culot deux fois avec un millilitre de tampon fax afin de bloquer les récepteurs FC endogènes.

Incuber les cellules dans 100 microlitres de deux nanogrammes par millilitre de rat anti-US CD 1632 pendant 20 minutes sur le culot glacé et laver les cellules avec du tampon fax. Ensuite, ajouter 100 microlitres d'un nanogramme par millilitre d'anticorps fluorescent approprié, ou d'anticorps, à chaque échantillon et incuber sur glace. Pendant une heure, ajouter 100 microlitres de tampon fax seul aux cellules témoins, pelleter et laver les cellules deux fois avec du tampon fax.

Resuspendre les cellules dans un millilitre de tampon act, puis incuber sur glace pendant une minute. Pour lyser le culot des globules rouges et laver les cellules, resuspendre les cellules dans un millilitre de tampon fax. Analyser les échantillons en cytométrie en flux, généralement avec des lasers d'excitation à 405, 488 et 633 nanomètres, et de cinq à dix détecteurs de fluorescence en émission.

Le prion brut, un homogénat cérébral infecté, est fortement enrichi en prions. Le processus de purification implique l'utilisation d'un détergent, la solubilisation et une ultracentrifugation de l'homogénat cérébral d'un élan de l'espèce E. Le produit obtenu est une protéase.

L'analyse FACS résistante au potassium de populations cellulaires spécifiques démontre que les cellules présentatrices d'antigènes migrent vers le péritoine en deux heures et conservent les microbilles fluorescentes et les bâtonnets de prions. Les cellules provenant de souris inoculées avec des microbilles et des prions présentaient une fluorescence importante, en particulier sur les monocytes, les cellules dendritiques et les macrophages.

Des monocytes PreOn, des cellules dendritiques et des macrophages ont également été retrouvés dans les ganglions lymphatiques médiastinaux. Deux heures après l'inoculation, aucune perle ni aucun bâtonnet PreOn n'ont été détectés dans les ganglions lymphatiques mésentériques. Dans cette expérience, la vidéo a illustré plusieurs protocoles permettant de purifier des bâtonnets de prions agrégés à partir de cerveau infecté, d'effectuer des injections intrapéritonéales, d'identifier et d'isoler correctement les ganglions lymphatiques, puis enfin d'isoler et de colorer les cellules immunitaires.