Jumelés Recordings Patch Clamp du motoneurone et de muscle ciblé squelettiques chez le poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir simultanément des enregistrements électrophysiologiques du potentiel d'action d'un motoneurone et de la réponse synaptique associée dans le muscle cible. Cela est réalisé en premier lieu en retirant la peau du côté dorsal du poisson. La deuxième étape de la procédure consiste à exposer la moelle épinière en éliminant toutes les cellules musculaires dorsales sus-jacentes.

La troisième étape de la procédure consiste à exposer le muscle rapide cible en retirant la couche supérieure du muscle lent. La dernière étape de la procédure est de réaliser un blocage en courant du neurone primaire coddle ou du neurone cap et un blocage en tension du muscle squelettique cible. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant les réponses synaptiques dans le muscle associées à la décharge des potentiels d'action des motoneurones, grâce à un blocage simultané en courant du motoneurone et en tension du muscle cible.

LaVar Super Fish offrait une combinaison d'avantages, facilitant l'enregistrement apparié entre le motoneurone et le muscle squelettique ; la petite taille du muscle permet un bon contrôle de tension, et les caractéristiques stéréotypées du motoneurone cap permettent une identification facile et un accès aisé à vi. À présent, je vais détailler les procédures nécessaires pour établir l'enregistrement en configuration de patch sur le neurone et le muscle. Avant de commencer la procédure, préparez cinq solutions clés : la solution de bain, la solution de bain avec Trica, la solution de bain avec IDE, la solution interne pour neurone et la solution interne pour muscle.

Ensuite, prélevez un poisson-zèbre larvaire unique âgé de 72 à 96 heures et placez-le dans une solution de bain contenant de la trica. Dans l'minute suivant l'exposition à l'anesthésique, le poisson ne réagira plus au toucher. Placez le poisson sur une boîte en plastique et, à l'aide d'un microscope stéréo, sectionnez la tête à l'aide d'un rasoir à double tranchant.

Transférez le poisson dans une chambre d'enregistrement en verre recouverte de sard et remplie de solution bass. Créez un lambeau de peau près de l'extrémité rostrale du poisson à l'aide d'une épingle, ce qui permettra une prise adéquate pour une paire de pinces fines. Retirez la peau recouvrante en la pinçant près de l'épingle rostrale à l'aide d'une paire de pinces fines.

Décortiquer lentement dans le sens du coddle pour enlever la peau. Traiter le poisson avec trois millilitres de solution de bain avec le formule IDE pendant trois à cinq minutes afin de bloquer les contractions musculaires qui pourraient interférer avec les enregistrements. Rincer cinq fois avec la solution de bain normale.

Retirer une partie de la couche superficielle du muscle sur cinq à six segments en grattant délicatement avec le côté d'une aiguille en tungstène. Transférer le poisson vers un microscope droit placé dans une cage de Faraday afin de protéger contre les bruits électriques. Le microscope est équipé d'un objectif fixe à longue distance de travail, de 40 x, et d'un zoom compris entre 0,5 et 4 x.

Le microscope est monté sur une platine motorisée de translation XY. Afin de déplacer la préparation entre le nerf et le muscle en fort grossissement, l'utilisation d'optiques de contraste interférentiel différentiel permet de visualiser les neurones à un zoom de 0,5 x. Utilisez une pipette à large orifice de 15 microns pour retirer le muscle superficiel et exposer la moelle épinière.

Une pression négative est appliquée à l’aide d’une seringue jetable de trois cm³ et les cellules musculaires sont retirées une par une. Cette procédure est répétée sur cinq à six segments dorsaux de muscle squelettique. La même pipette large est également utilisée pour retirer les deux couches supérieures du muscle ventral afin d’obtenir le muscle squelettique rapide cible.

Cela termine la préparation pour les enregistrements appariés et le zoom du microscope est augmenté à environ 1,6 x. Les segments propres sont analysés pour localiser les neurones cap. Chaque segment HEMI de la moelle épinière contient un grand motoneurone cap d'un diamètre de 10 micromètres.

Ce soma en forme de goutte est situé superficiellement sous la moelle épinière, près de l'extrémité la plus distale de la limite segmentaire. Un neurone cap est sélectionné pour l'enregistrement, et le champ musculaire ventral cible du segment coddle associé est scanné pour vérifier son intégrité. Deux électrodes de patch sont positionnées pour l'enregistrement, une pour le neurone et une seconde pour le muscle.

L'électrode supérieure présente un affinement peu prononcé pour la pénétration de la dure-mère spinale résistante et une ouverture au bout d'environ deux micromètres. L'électrode inférieure présente un affinement plus marqué pour l'enregistrement en régime de clampage de tension à faible résistance du muscle squelettique. Positionnez l'électrode neuronale selon un angle d'environ 30 degrés pour pénétrer la dure-mère spinale.

Avancez l'électrode d'environ un demi-segment en direction rostrale par rapport au neurone capuchon sélectionné à l'aide d'un manipulateur axial tout en appliquant une pression positive douce et continue d'environ 60 millimètres de mercure. Lorsque l'électrode traverse la dure-mère, le neurone capuchon peut être déplacé par la perfusion provenant de l'électrode, ce qui nécessite un réajustement de la mise au point. Lorsque l'électrode touche le SOMA du neurone capuchon, la pression positive est relâchée, ce qui entraîne généralement la formation immédiate d'un scellement gigaohm.

Toutefois, dans certains cas où le scellement ne se forme pas, il est nécessaire d'appliquer une légère pression négative. Après la formation du scellement, le potentiel de l'électrode est ajusté à moins 80 millivolts et l'application d'une pression négative rompt la membrane cellulaire. Le neurone capsulaire se caractérise par une résistance d'entrée de 140 à 180 mégaohms et un potentiel d'action qui dépasse +40 millivolts.

Cela est testé en injectant des paliers de dépolarisation croissants progressivement en régime de potentiel fixé jusqu'à l'obtention du potentiel d'action. Ensuite, on déplace le microscope vers le muscle ventral à l'aide du translateur motorisé XY. En fort grossissement, une cellule musculaire rapide est choisie dans le champ cible.

L'électrode musculaire est avancée vers la cellule musculaire cible sous pression positive, qui, lorsqu'elle est relâchée, forme un scellement gigaseal ; le potentiel de l'électrode est ajusté à moins 50 millivolts pour inactiver les canaux sodiques. Puis, sous aspiration douce, la membrane cellulaire est rompue. Une chute de la résistance à 100 à 200 mégohms et l'apparition soudaine de grands transitoires capacitifs indiquent l'entrée en phase de test pour la paire.

L'enregistrement du motoneurone est réalisé en injectant des courants de plus en plus intenses jusqu'à ce qu'un potentiel d'action soit déclenché. À ce stade, un courant de plaque motrice devrait être déclenché dans le muscle. Une stimulation continue du motoneurone à un hertz entraîne des courants de plaque motrice sans échec. Lorsque la fréquence du stimulus augmente jusqu'à 100 hertz, les courants de plaque motrice présentent des fluctuations d'amplitude et subissent une déplétion fonctionnelle dans les 10 secondes suivant la stimulation.

Typiquement, l'enregistrement des neurones est stable pendant jusqu'à une heure, mais les cellules musculaires se détériorent, ce qui se traduit par une augmentation de la résistance en série. Dans ce cas, l'expérience est soit arrêtée, soit une autre cellule musculaire est soumise à un enregistrement en patch-clamp. Tous les enregistrements doivent être terminés dans l'heure.

Une fois qu'une paire est maîtrisée, l'enregistrement peut être effectué en une à une heure et demie. Il est également possible d'obtenir une ou deux paires supplémentaires dans les segments voisins. Une journée typique d'enregistrement produira deux à trois paires.

Les enregistrements jumelés de motoneurones et de muscles squelettiques offrent une occasion unique d'explorer les mécanismes fondamentaux de la transmission neuromusculaire. Lorsqu'ils sont utilisés conjointement avec des lignées de poissons mutants de la motilité, ils permettent de localiser précisément l'origine du dysfonctionnement neuromusculaire et d'obtenir de nouvelles perspectives sur les mécanismes sous-jacents à des maladies humaines telles que le syndrome métastatique.