In vivo et in vitro de l'adaptateur-clathrine Interaction

Au cours de l’endocytose médiée par la clathrine, un réseau polyédrique de clathrine est lié à des protéines membranaires ou à des lipides via des protéines adaptatives de liaison à la clathrine telles que SL one, SL one se lie à la clathrine via sa variante clathrine box ou VCB. Dans cette vidéo, trois méthodes sont utilisées pour l’analyse des interactions SLA one de la clathrine. Tout d’abord, les cellules de levure exprimant des mutants natifs natifs et mutants VCB marqués à la GFP SLA one sont imagées à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif.

Des films en accéléré sont ensuite analysés pour déterminer l’effet de la mutation sur la cinétique de l’endocytose. Deuxièmement, des extraits cytosoliques de levure sont préparés à partir de cellules de type sauvage comme source de clathrine et des tests de traction de la protéine de fusion G-S-T-V-C-B sont effectués pour examiner l’interaction de la clathrine VCB in vitro. Troisièmement, les extraits totaux sont préparés à partir de cellules de levure exprimant des mutants natifs et VCB.

Des précipitations de SLA one et de coun sont effectuées pour examiner la mutation effective sur l’affinité de la liaison de la clathrine de SLA one in vivo. En fin de compte, les données obtenues montrent que la mutation du VCB retarde l’endocytose et que la liaison de SLA one à la clathrine est perdue. Chez ces mutants, bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la dynamique de l’adaptateur de cliquetis dans l’endocytose.

Il peut également être appliqué à d’autres interactions protéiques dans les vésicules de la voie sécrétoire. En général, les individus savaient que cette méthode aurait du mal car le photoblanchiment peut produire le signal fluorescent à partir de l’expression plus faible des protéines marquées à partir d’un locus endogène. Parce que ce protocole combine l’analyse d’images avec des études biochimiques des interactions physiques, il s’agit d’une approche très puissante pour étudier les mécanismes qui contrôlent l’endocytose Pour étudier les interactions de l’adaptateur de clathrine pendant l’endocytose, des souches de levure sont générées qui expriment des versions natives et mutantes de la protéine adapto de clathrine SL une première Une étiquette GFP est ajoutée à la SL une extrémité C par recombinaison homologue.

Ensuite, une souche de levure intermédiaire est générée en perturbant le gène SLA un de manière sélective à l’aide d’un fragment contenant le gène RA trois avec des séquences flanquantes spécifiques de SL un pour régénérer un gène fonctionnel pour l’expression du SL un mutant à partir du locus chromosomique. URA 3 est remplacé par un fragment SL 1 contenant le motif de liaison à la clathrine ou VCB dans lequel des mutations ponctuelles ont été incorporées dans VCB. Les souches de levure résultantes sont ensuite utilisées pour l’analyse microscopique de la dynamique SLA un.

Sur les sites endocytaires, une approche similaire est utilisée pour introduire la mutation VCB dans des souches SLA one non marquées telles que TVY 6 1 14, qui conviennent aux expériences biochimiques : commencez par cultiver la souche de levure SLA one GFP et la souche mutante SLA one : SLA one, A-A-A-G-F-P dans quatre millilitres de milieu SD supplémenté à 30 degrés Celsius dans un rotateur dans l’obscurité. Une fois que la levure a atteint une DO de 600 de 0,1 à 0,4, transférez un millilitre de chaque culture dans un microtube de centrifugation et tournez à 4 000 G pendant une minute à température ambiante après l’essorage, jetez environ 950 microlitres de cellules de suspension de SUP natant dans le liquide restant, qui devrait être d’environ 50 microlitres. Déposez trois microlitres de suspension cellulaire sur une lame de microscopie et couvrez-la d’une lamelle en verre.

Protégez l’échantillon de la lumière sur un disque rotatif sur le microscope focal. Montez la glissière sur un objectif à immersion dans l’huile 100x. Localisez le bon plan focal à l’aide d’un éclairage en champ clair ou d’un laser de 488 nanomètres avec les filtres appropriés pour exciter et détecter la GFP Capturez des images en accéléré de SLA un GFP et SLA un A-A-A-G-F-P dans des cellules avec un temps d’exposition de 500 millisecondes à un intervalle d’une image par seconde pendant 150 secondes.

GFP marquée Punte apparaîtra sur la surface interne de la membrane plasmique. Persistez pendant plusieurs secondes et déplacez-vous vers le centre de la cellule car le signal disparaît rapidement, indiquant le démontage de la couche. À l’aide du logiciel, sélectionnez une partie d’une image en accéléré d’un type sauvage SLA un GFP dans lequel on voit apparaître des taches.

Restez quelques secondes et disparaissez. Recadrez cette section de l’image pour chaque image des images en accéléré. Ensuite, utilisez le logiciel pour générer un graphique de carillon représentant cette section dans chaque image de la 152e image en accéléré en alignant les images le long d’un axe correspondant au temps écoulé ici, ceci est démontré à l’aide d’Adobe Photoshop.

Calculez le temps d’arrêt de chaque point en comptant manuellement le nombre d’images en accéléré dans lesquelles il est présent. Dans le graphique du carillon, notez les résultats dans une feuille de calcul. Notez que chaque point doit s’incurver vers l’intérieur de la cellule au fur et à mesure qu’il disparaît.

Endocytose réfléchissante et démontage du pelage. Analysez cinq points par cellule pour environ 40 cellules. Répétez ensuite ce processus avec SLA one A-A-A-G-F-P pour obtenir des extraits cytosoliques de levure à utiliser dans les tests d’affinité protéique GST.

Commencez par préparer trois litres de la souche de levure appropriée selon les instructions du texte d’accompagnement. Remettez le granulé en suspension dans trois à cinq millilitres d’eau stérile et tapotez-le de haut en bas jusqu’à ce que le granulé soit complètement remis en suspension. Ensuite, versez environ 150 millilitres d’azote liquide dans un bécher en plastique de 250 millilitres. Flash.

Congelez la levure en l’ajoutant goutte à goutte dans l’azote liquide selon un motif circulaire. Pour éviter l’agglutination, ne laissez pas les granulés décongeler Ajoutez plus d’azote liquide Si nécessaire, versez de l’azote liquide dans un récipient mélangeur en acier inoxydable pour le refroidir. Laissez l’azote liquide s’évaporer presque complètement.

Ajoutez ensuite les granulés de levure congelés. Fermez le mélangeur avec un bouchon en caoutchouc froid et broyez les granulés de levure pendant 10 secondes. Retournez trois à quatre fois pour mélanger le contenu et répétez l’étape de broyage deux fois le sol.

La levure congelée aura un entonnoir de refroidissement d’apparence poudreuse avec un tube conique de 50 millilitres avec de l’azote liquide. À l’aide de l’entonnoir froid, transférez la levure moulue dans le tube. La levure moulue congelée peut être conservée à moins 80 degrés Celsius ou utilisée immédiatement.

Pour obtenir un extrait cytosolique, peser trois grammes de levure TV Y 6 1 4 moulue congelée dans un tube conique de 15 millilitres et suspendre dans trois millilitres à température ambiante. Tamponnez un bouchon cocktail d’inhibiteur de protéase contenant et retournez le tube plusieurs fois jusqu’à ce que le contenu soit complètement décongelé. Placez-le sur de la glace.

Ultracentrifugez l’extrait à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes à 300 000 G.Après l’essorage, utilisez du perpet pour transférer soigneusement l’extrait de supinate ou cytosolique dans un tube conique sur de la glace. Coupez l’extrémité d’un embout de 200 microlitres, puis utilisez-le pour ajouter 100 microlitres d’une suspension de sphero à 50 % de glutathion dans le tampon A à l’extrait cytosolique. Placez le tube sur un rotateur à quatre degrés Celsius après que l’échantillon ait tourné pendant 15 minutes.

Faites tourner les billes par centrifugation à quatre degrés Celsius pendant deux minutes à 1000 G.Transférez le snat, qui est l’extrait cytosolique dans un tube frais de réserve de 50 microlitres pour l’échantillon de contrôle d’entrée. La congélation n’est pas recommandée à ce stade. Gardez l’extrait sur de la glace en tout temps et poursuivez l’expérience.

Pour effectuer des tests d’affinité de protéine de fusion GST, ajoutez un millilitre de PBS 30 microlitres d’une suspension Sphero à 50 % de glutathion dans le tampon A et 50 microgrammes de G-S-T-G-S-T-V-C-B dialysé ou de G-S-T-V-C-B mutant dans des tubes de fuge marqués. Rotation de la température ambiante pendant 30 minutes pour permettre la liaison. Lavez les billes deux fois avec du PBS et une fois avec un tampon centrifuge.

10 secondes à 5 000 g après chaque lavage, puis ajoutez un millilitre d’extrait cytosolique de levure. Placez le tube sur un rotateur à quatre degrés Celsius après que l’échantillon ait tourné pendant une heure. Faites tourner les billes par centrifugation à quatre degrés Celsius pendant 10 secondes À 5 000 G.Lavez les billes trois fois avec le tampon A contenant 0,1 % de tritton X 101 temps avec le tampon A après chaque lavage centrifuge à quatre degrés Celsius pendant 10 secondes.

À 5 000 G après le dernier tour. Utilisez l’embout de chargement du gel pour retirer autant de liquide que possible. À ce stade, les échantillons peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius.

Pour continuer plus tard, ajoutez 15 millilitres de tampon d’échantillon deux fois Lamb lee dans chaque tube. Placez les échantillons sur un bloc de chaleur et incubez à 96 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons pendant 10 secondes à 5 000 G pour amener l’échantillon au fond du tube.

Analyser les échantillons par immuno-transfert à l’aide d’un anticorps contre la chaîne lourde de la clathrine afin d’obtenir des extraits cellulaires totaux pour les expériences de co-précipitation. Préparez des échantillons de levures moulues congelées comme auparavant, en utilisant la souche TVY six 14 exprimant le type sauvage SL one, la souche SL one A A a portant une mutation L-L-D-L-Q à A-A-A-L-Q dans TY six 14. Contexte et une souche SL un delta portant une délétion du gène SL un tel que GPY 3 1 3 0 way.

Deux grammes de levure moulue congelée dans des tubes coniques et reus. Suspendez-les dans deux millilitres de tampon à température ambiante, un cocktail contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase et un bouchon de 2 % de triton X 100 et retournez le tube plusieurs fois jusqu’à ce qu’il soit complètement décongelé, puis incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Mélange périodique par inversion.

Transférez le matériau dans des microtubes à centrifuger et faites-le tourner à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes à 16 000. G soigneusement sans déranger la pastille. Transférez l’extrait de cellules sup, natant ou total dans un tube conique sur de la glace.

À l’aide d’une pipette, ajoutez 100 microlitres de 50 % de protéines, une boue de sphero dans un tampon, une rotation à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, faites tourner les billes par centrifugation à quatre degrés Celsius pendant deux minutes à 1000 G et transférez le surnageant S dans un tube frais. Réserver 50 microlitres d’extrait pour le contrôle des intrants Pour effectuer des dosages de co-immunoprécipitation.

Ajoutez un millilitre de PBS 30 microlitres de 50 % de protéines. Une bouillie de sphero dans le tampon A et deux microgrammes d’un anti sla de lapin. Un anticorps contre les microtubes à centrifuger marqués.

Tourner à température ambiante pendant 30 minutes. Lavez les perles deux fois avec du PBS et une fois avec un tampon. A contenant 1 % de tonnes X 100.

Ajouter un millilitre de l’extrait de levure total. SLA un, SLA un A A A et SLA un delta. Tournez pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Faites tourner pendant 10 secondes à 5 000 G pour granuler les perles après l’essorage. Jetez le SUP natant et lavez rapidement les billes trois fois avec le tampon A contenant 0,1 % de Tritan X 101 fois avec le tampon. Faites tourner les billes une fois de plus et, à l’aide d’un embout de chargement de gel, retirez autant de liquide que possible.

À ce stade, les échantillons peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius. Pour continuer plus tard, ajoutez 15 microlitres de tampon d’échantillon à deux fois dans chaque tube. Incuber à 96 degrés Celsius pendant cinq minutes et tourner pendant 10 secondes à 5 000 G.Analysez les échantillons par immuno-transfert à l’aide d’un anticorps contre la chaîne lourde de la clathrine. Ici.

Les résultats d’imagerie de cellules vivantes de type sauvage et de SL mutant sont comparés à gauche. Une seule cellule de levure est représentée avec SLA une région endocytaire positive à la périphérie de la cellule indiquée en vert. L’aire entre les lignes blanches correspond à la région à partir de laquelle les krafts représentés sur le brillant ont été générés.

Notez que les sites endocytaires chez le mutant persistent significativement plus longtemps, environ 80 secondes que le type sauvage, environ 30 secondes indiquant un défaut dans la formation du pelage. L’interaction physique entre la clathrine et la boîte de clathrine variante sla one a été évaluée par GST Fusion Protein. Essais d’affinité, GST fusionné à SLA un fragment AA 7 98 à 8 1 3 contenant la séquence L-L-D-L-Q.

Le mutant A-A-A-L-Q correspondant ou GST seul a été lié au glutathion, à des billes de sérothérapie et incubé avec un extrait cytosolique de cellules de levure de type sauvage. Les protéines associées ont été évoquées et analysées par immuno-transfert pour la chaîne lourde de la clathrine, comme on le voit ici. La clathrine se lie au mutant G-S-T-V-C-B pour ne pas être GST ou G-S-T-V-C-B, ce qui suggère qu’une variante intacte de la boîte de clathrine est nécessaire pour que SLA one se lie à la clathrine.

Lors de cette procédure, il est important de travailler toujours près de la flamme pour éviter la contamination de vos cultures GS Suite à cette procédure. Le marquage d’autres protéines fluorescentes telles que les RFP peut être effectué pour examiner la colocalisation de différentes protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier les interactions protéiques à l’aide de techniques d’imagerie cellulaire biochimique et fluorescente.