Name: La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés dacide nucléique modifiés Oligonucléotides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez la mutagenèse dirigée de gènes cibles dans les cellules de moustiques Anopheles par transfection d'oligonucléotides modifiés. Cette méthode permet d'étudier la fonction des gènes de l'immunité innée.

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Nous tenons à remercier Abbie Spinner au Centre National Primate Research en Californie, pour son aide à la cytométrie de flux. Cette étude a été soutenue par un financement de l&#39;Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 et AI078183.

<ol><li> Avant de commencer le protocole, il est important de déterminer que les cellules de moustiques utilisés dans l'expérience sont en bonne santé et au confluent ~ 80% si adhérentes (Figure 1). Cellules envahies ou insalubres se traduira par une efficacité de transfection faible et donnera des résultats inconsistants. </li><li> Warm up ensemble des médias avant d'utiliser dans un bain 28 ° C eau pendant 30 mn. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 cellules ont besoin de E5 moyennes: MEM, w Earle / glutamine, la chaleur de 5% FCS inactivé, 0,2% de D-glucose, 1% de pénicilline-antibiotique streptomycine et 1% non-acides aminés essentiels. </li><li> A. gambiae cellules SUA5B nécessitent moyennes S2: Schneider drosophile moyenne, chauffer 5% de FCS inactivé, et 1% de pénicilline-streptomycine antibiotiques </li></ol></li><li> Décongeler et stocker tous les matériaux réactifs de transfection, les plasmides, et des oligonucléotides sur la glace. </li><li> Toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile. </li><li> Pour les cellules adhérentes (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) Aspirer vieux médias sans perturber les cellules, ajouter un volume équivalent de milieux frais qui a été chauffé à 28 ° C, puis rincer les cellules du bas de la flacon à l'aide d'une pipette. </li><li> La concentration des cellules devraient être déterminés et ajustés à une concentration finale de 1x10 6 cellules / ml. Les cellules peuvent être conservés à température ambiante pendant la préparation de matériaux réactifs de transfection. </li><li> Ajouter 1 mL de cellules de moustique (1x10 6 cellules / ml) dans chaque puits d'une plaque de 6 puits. Mettre en place une plaque pour chaque condition expérimentale (voir ci-dessous). Tableau I est un schéma de pipetage pour un transfection général. Tableau II énonce cinq conditions à tester pour la mutagénèse réussie d'un seul nucléotide à l'aide spécifique au BFP LNA-ons. Les deux premiers, et pGFP pBFP, sont des contrôles positifs et négatifs, respectivement. Le reste sont des conditions expérimentales de pBFPs avec des concentrations croissantes de BFP spécifiques LNA-ons. Dans les étapes 8 à 12, ajouter des volumes appropriés de réactif en conséquence pour chaque état. </li><li> Transfert d'ADN plasmidique à un stérile de 1,5 ml microtube et ajouter le volume approprié de tampon CE. <ol class="lalpha"><li> Pour 1 uL d'ADN plasmidique (1 ug / uL), ajouter 99 ul de tampon CE. </li><li> Pour une pGFP ul (1 pg / uL), ajouter 99 ul de tampon CE. </li><li> Pour une pBFP ul (1 pg / uL), ajouter 99 ul de tampon CE. </li><li> Pour une pBFP ul (1 pg / uL) et 1 ul ON (pg / pl), ajouter 98 ul de tampon CE. </li><li> Pour une pBFP ul (1 pg / uL) et 5 pi ON (1 pg / uL), ajouter 94 ul de tampon CE. </li><li> Pour une pBFP ul (1 pg / uL) et 10 uL ON (1 pg / uL), ajouter 89 ul de tampon CE. </li></ol></li><li> Ajouter ensuite lentement Enhancer pour 1 pg d'ADN utilisés. <ol class="lalpha"><li> Pour 1 uL d'ADN plasmidique, ajouter 8 uL Enhancer. </li><li> Pour une pGFP ul, ajouter 8 uL Enhancer. </li><li> Pour une pBFP ul, ajouter 8 uL Enhancer. </li><li> Pour une pBFP ul et 1 ul ON, ajouter 16 uL Enhancer. </li><li> Pour une pBFP uL et 5 pi ON, ajouter 48 uL Enhancer. </li><li> Pour une pBFP uL et 10 uL ON, ajoutez 88 uL Enhancer. </li></ol></li><li> Vortex ADN / tampon / Enhancer mélange pendant 1 sec et assurez-vous que toute la solution est au fond du tube. Puis incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter le réactif Effectene par 1 ug d'ADN plasmidique et le vortex pendant 10 sec. Vérifiez que toute la solution se trouve au fond du tube et incuber à température ambiante pendant 10 min. <ol class="lalpha"><li> Pour 1 uL d'ADN plasmidique, ajouter 10 uL Effectene (tableau I). </li><li> Pour une pGFP ul, ajouter 10 uL Effectene (tableau II). </li><li> Pour une pBFP ul, ajouter 10 uL Effectene (tableau II). </li><li> Pour une pBFP ul et 1 ul ON, ajouter 20 uL Effectene (tableau II). </li><li> Pour une pBFP uL et 5 pi ON, ajouter 60 uL Effectene (tableau II). </li><li> Pour une pBFP uL et 10 uL ON, ajouter 110 uL Effectene (tableau II). </li></ol></li><li> Apportez chaque tube pour un volume final de 1000 en ajoutant les médias uL réchauffé goutte à goutte au mélange ADN / tampon / Enhancer / Effectene. L'ADN peut précipiter à ce point si le support est ajouté trop rapidement. Mélanger doucement par aspiration et refoulement 3-4 fois. <ol class="lalpha"><li> Pour 1 uL d'ADN plasmidique, ajouter des médias 882 uL (tableau I). </li><li> Pour une pGFP ul, ajoutez les médias uL 882 (tableau II). </li><li> Pour une pBFP ul, ajoutez les médias uL 882 (tableau II). </li><li> Pour une pBFP ul et 1 ul ON, ajoutez 864 uL des médias (tableau II). </li><li> Pour une pBFP uL et 5 pi ON, ajoutez 792 uL des médias (tableau II). </li><li> Pour une pBFP uL et 10 uL ON, ajoutez les médias 702 uL (tableau II). </li></ol></li><li> Suivant ajouter lentement 1 ml de l'ADN appropriée / Enhancer / Effectene mélange à chaque puits une goutte à la fois. </li><li> Swirl doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules et le mélange de transfection. Incubate cellules dans des conditions normales de croissance. </li><li> Un jour après transfection, doucement aspirer à des médias et lentement le remplacer par un volume équivalent de médias fraîchement réchauffé. Il est important de ne pas perturber les couches de cellules au fond du puits quand vous le faites. </li><li> Deux jours après transfection examiner les cellules transfectées avec contrôle positif pGFP sous microscope à fluorescence pour déterminer l'efficacité de transfection (figure 2). </li><li> Cellules SUA5B se développent très rapidement et seront envahies par la végétation. Quatre jours après la transfection de ces cellules minces en aspirant le vieux médias et en ajoutant lentement un volume équivalent de médias fraîchement réchauffé. </li><li> Après l'ajout de nouveaux médias pour les puits, détachez toutes les cellules du fond de chaque puits par pipetage de haut en bas, jetez la moitié du volume (1 ml) du mélange de cellules et ajouter 1 mL de Fresh Media réchauffé à porter le volume final de 2 mL. </li><li> Vérifiez cellules quotidiennement pour s'assurer qu'ils sont sains et ne pas envahis, mince comme nécessaire. </li><li> Permettre aux cellules de se développer dans des conditions normales pendant cinq à sept jours après la transfection, avant de les recueillir pour l'analyse. </li><li> Moins cinq à sept jours après la transfection, de recueillir les cellules par aspiration hors du vieux médias dans tous les puits et en ajoutant 1 ml de solution stérile température ambiante PBS dans chaque puits. </li><li> Détachez les cellules du fond du puits par aspiration et refoulement et le transfert mélange de cellules à 5 mL tubes pression casquette et analyser immédiatement les cellules par cytométrie en flux. </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. A. sains non transfectées stephensi MSQ43 (A) et A. gambiae SUA5B (B) des cellules à environ 80% de confluence. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. A. stephensi MSQ43 (A) et A. gambiae SUA5B (B) des cellules transfectées avec le contrôle positif GFP plasmide exprimant. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Cytométrie en flux de données confirmant la conversion du BFP à la GFP par mutagénèse d'une transfection unique à la suite de nucléotides avec BFP spécifique verrouillé acides nucléiques oligonucleotides modifiés (LNA-ons). Cellules SUA5B été transfectées avec un plasmide exprimant la GFP (pGFP) comme contrôle positif, avec un plasmide exprimant BFP (pBFP) comme contrôle négatif, ou avec pBFP et des concentrations croissantes de BFP spécifiques LNA-ons. Stratégie de Gating (A) pour les données de cytométrie en flux montrant de gauche à droite: diffusion vers l'avant par rapport secondaires de cellules vivantes, iodure de propidium (PI) des cellules négatives et cellules GFP-positives cinq jours après la transfection. (B) Graphique du pourcentage de cellules GFP-positives montré dans (A) la transfection suivants avec pBFP et des concentrations croissantes de LNA-ons. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau I. conditions de transfection. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tableau 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 2"> Tableau II. Conditions de transfection utilisé dans la figure 1.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Nous présentons ici une méthode in vitro et des preuves pour la conversion ciblée d&#39;un seul nucléotide dans un gène cible épisomique après transfection de LNA-Ons dans A. stephensi et A. cellules gambiae. Conversion génique LNA-SUR-médiation nécessite l&#39;induction d&#39;un site spécifique de réponse réparation de l&#39;ADN; nos données indiquent que les cellules de moustique peut soutenir ce mécanisme de mutagenèse dirigée. Bien que la méthode présentée ici est basée s...

<table><tbody><tr><td>Réactif de transfection Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide témoin GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide BFP (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Don du Dr Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>ON-LNA </td><td></td><td></td><td>Don du Dr Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Milieu MEM, Earle&amp;rsquo;s avec glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose à 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

la transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en fermés d&#39;acide nucléique modifiés oligonucléotides

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Parasites du genre Plasmodium, l&#39;agent causal de la malaria, sont transmis par les piqûres de moustiques anophèles infectés résultant dans plus de 250 millions de nouvelles infections chaque année. Malgré des décennies de recherche, il n&#39;ya toujours pas de vaccin contre le paludisme, en soulignant la nécessité de stratégies de contrôle roman. Une approche novatrice est l&#39;utilisation de moustiques génétiquement modifiés pour lutter efficacement contre la transmission du parasite du paludisme. Altérations délibérées des voies de signalisation cellulaire chez le moustique, en passant par mutagenèse ciblée, ont été trouvés pour réguler le développement du parasite 1. De ces études, nous pouvons commencer à identifier les gènes cibles potentiels pour la transformation. Mutagenèse ciblée a toujours compté sur la recombinaison homologue entre un gène cible et une molécule d&#39;ADN à grande. Cependant, la construction et l&#39;utilisation de ces molécules d&#39;ADN complexes pour la production de lignées de cellules transformées de façon stable est coûteux, fastidieux et souvent inefficace. Par conséquent, une stratégie utilisant des acides nucléiques verrouillés-oligonucleotides modifiés (LNA-ons) fournit une alternative utile pour l&#39;introduction artificielle seule substitutions nucléotidiques dans épisomiques et chromosomiques cibles gène d&#39;ADN (revue en 2). LNA-SUR-médiée mutagenèse ciblée a été utilisée pour introduire des mutations ponctuelles dans des gènes d&#39;intérêt dans les cellules cultivées à la fois de la levure et de souris 3,4. Nous montrons ici que LNA-Ons peut être utilisé pour introduire un changement d&#39;un seul nucléotide dans une cible transfectées épisomique qui se traduit par un interrupteur du bleu de protéines (BFP) l&#39;expression fluorescentes pour la protéine verte (GFP) l&#39;expression fluorescentes dans les deux Anopheles gambiae et Anopheles stephensi cellules . Cette conversion démontre pour la première fois que la mutagenèse efficace de gènes cibles dans les cellules de moustique peut être médiée par LNA-ons et suggère que cette technique peut être applicable à la mutagenèse des cibles chromosomiques in vitro et in vivo.

Oligonucléotides peuvent être utilisés pour le site spécifiquement le remplacer par un seul nucléotide des gènes cibles transfectées dans les deux<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Et<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Cellules.

La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés d&#39;acide nucléique modifiés Oligonucléotides

Les parasites Plasmodium, agents pathogènes du paludisme, sont transmis par les piqûres de moustiques Anopheles infectés, entraînant plus de 250 millions de nouveaux...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une nouvelle stratégie de mutagenèse dirigée dans des cellules de moustiques présentant des anomalies. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des cellules cultivées saines en vue de la transfection. Les cellules sont ensuite transfectées avec les ADN de contrôle et de test appropriés par l'ajout de réactifs de transfection.L'étape suivante de la procédure consiste à surveiller les cellules témoins pour la fluorescence et à réduire la densité des cellules expérimentales. Enfin, les fréquences de conversion génique peuvent être déterminées dans les cellules expérimentales par cytométrie en flux cinq à sept jours après la transfection. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une mutagenèse dirigée d'une cible génique épisomale par réparation de l'ADN induite par un oligonucléotide d'acide nucléique verrouillé.Bonjour, je suis le Dr Nazy Pacor du laboratoire du Dr Shirley Lockhart du Département de microbiologie médicale et d'immunologie de l'Université de Californie à Davis. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une nouvelle procédure de mutagenèse dirigée sur des cellules de moustiques anomalies. Nous utilisons cette procédure pour étudier la fonction des gènes impliqués dans la réponse immunitaire innée des moustiques par mutagenèse dirigée.Commençons donc. Avant de commencer le protocole, procurez-vous des cellules de moustique saines et présentant une confluence d'environ 80 %. Si les cellules sont adhérentes, surconfluentes ou non saines, cela entraînera une faible efficacité de transfection et donnera des résultats inconstants.Ce protocole est démontré avec des cellules B ananais Gambier SUA cinq. Toutefois, les cellules Ananais ensi MS Q4 trois peuvent également être utilisées. Commencez la préparation de la transfection en réchauffant le milieu S deux dans un bain d'eau à 28 degrés Celsius pendant 30 minutes.Tous les réactifs de transfection, plasmides et oligonucléotides doivent être gardés sur glace. En utilisant une technique stérile dans une hotte de culture cellulaire, aspirez le milieu ancien sans perturber les cellules, puis remplacez-le par un volume équivalent de milieu frais préchauffé et rincez les cellules du fond du flacon. À l’aide d’une pipette, la concentration des cellules doit ensuite être déterminée et ajustée à une concentration finale de 1 × 10⁶ cellules par millilitre.Une fois la concentration finale ajustée, ajoutez un millilitre de cellules de moustique dans chaque puits d'une plaque de six. Alors que les cellules en plaque peuvent être conservées à température ambiante pendant la préparation des réactifs de transfection, transférez l'ADN plasmidique de transfert dans des tubes stériles de microcentrifugeuse. Ici, un plasmide exprimant la protéine fluorescente verte est utilisé comme témoin positif et un plasmide exprimant la protéine fluorescente bleue est utilisé comme témoin négatif.L'ADN témoin contient également le plasmide exprimant la BFP, mais avec des concentrations croissantes d'acide nucléique bloqué (LNA) spécifique de la BFP, d'oligonucléotides modifiés ou d'oligonucléotides LNA. Une fois l'ADN aliquoté, ajouter 99 microlitres de tampon kage et EC pour chaque microgramme d'ADN plasmatique et d'oligonucléotides LNA. Puis ajouter lentement 8 microlitres d'activateur par microgramme d'ADN utilisé, et vortexer le mélange d'ADN, de tampon et d'activateur.Pendant une seconde, faire une courte centrifugation pour rassembler la solution au fond des tubes, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter 10 microlitres de réactif d'effet par microgramme d'ADN plasmatique et mélanger au vortex pendant 10 secondes. Effectuer une brève centrifugation pour rassembler la solution au fond des tubes, puis incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après l'incubation, porter le volume final de chaque tube à 1000 microlitres en ajoutant lentement du milieu frais préchauffé au mélange d'ADN avec l'agent renforçant le tampon. L'ADN peut précipiter à ce stade si le milieu est ajouté trop rapidement ; mélanger délicatement en pipetant trois ou quatre fois vers le haut et vers le bas.Enfin, ajoutez lentement un millilitre du mélange d'adjuvant d'ADN approprié dans chaque puits contenant les cellules, une goutte à la fois. Agitez doucement la plaque afin d'assurer une répartition uniforme des cellules et du mélange de transfection.Incubez les cellules dans des conditions de croissance normales un jour après la transfection, aspirez délicatement le milieu des cellules et remplacez-le lentement par un volume équivalent de milieu frais préchauffé. Prenez soin de ne pas perturber les couches cellulaires au fond des puits. Deux jours après la transfection, examinez les cellules témoins positives transfectées avec un plasmide exprimant la GFP au microscope à fluorescence afin de déterminer l'efficacité de la transfection.Quatre jours après la transfection s uua, cinq cellules B doivent être repiquées car elles se développent très rapidement et risquent de devenir surconfluentes. Pour ce faire, aspirez le milieu ancien des cellules et ajoutez lentement un volume équivalent de milieu frais préchauffé. Après avoir ajouté le nouveau milieu dans les puits, détachez toutes les cellules du fond de chaque puits en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas, jetez la moitié du volume du mélange cellulaire, puis ajoutez un millilitre de milieu frais préchauffé afin que le volume final atteigne deux millilitres.Vérifiez les cellules quotidiennement pour vous assurer qu'elles sont saines et pas surconfluentes. Éclaircissez-les si nécessaire. Incubez les cellules dans des conditions normales pendant cinq à sept jours après la transfection avant de les récolter pour analyse.Cinq à sept jours après la transfection, récupérez les cellules en aspirant le milieu ancien et en ajoutant un millilitre de PBS stérile à température ambiante à chaque puits. Détachez les cellules du fond de chaque puits en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Enfin, transférez le mélange cellulaire dans des tubes de cinq millilitres à bouchon vissé et analysez immédiatement les cellules par cytométrie en flux.Un œil de défense. Des cellules MS Q4 trois et une lignée UA cinq B ont été transfectées avec un plasmide exprimant GFP utilisé comme contrôle positif. Les cellules sont observées en microscopie optique et en microscopie de fluorescence, ainsi que sous forme d’image. Les données de cytométrie en flux confirment la conversion de BFP en GFP par mutagénèse d’un seul nucléotide après transfection avec l’oligonucléotide bloqué (LNA) spécifique à BFP. Des cellules UA cinq B exprimant BFP ont été transfectées avec un plasmide exprimant GFP comme contrôle positif, avec un plasmide exprimant BFP comme contrôle négatif, ou avec un plasmide exprimant BFP et des concentrations croissantes de LNA spécifique à BFP.La stratégie de tri pour les données de cytométrie en flux montre la diffusion avant par rapport à la diffusion latérale des cellules vivantes, des cellules négatives au propidium iodure et des cellules positives pour la GFP cinq jours après la transfection. Le pourcentage de cellules positives pour la GFP après transfection avec un plasmide exprimant la BFP et des concentrations croissantes de LNAO NS peut être observé ici sous forme graphique, confirmant la conversion de la BFP en GFP par les L aos. Nous venons de vous présenter une nouvelle procédure de mutagenèse dirigée sur des sites d'anomalies dans des cellules de moustique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien vérifier que vos cellules sont saines et à la densité appropriée avant la transfection.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l'utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d'ARN qui sont ingérés par les larves.

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

interférence ARN (ARNi) est un outil extrêmement précieux pour découvrir la fonction des gènes. Cependant, la capacité de cibler des gènes à l’aide de l’ARNi au cours des stades préadultes est limitée chez le principal vecteur du paludisme humain, Anopheles gambiae. Nous décrivons un protocole ARNi pour réduire la fonction des gènes par injection directe pendant le développement de la nymphe.

ARNi Trigger Livraison en<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; pupes

Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.

Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisé pour caractériser la fonction des gènes dans les organismes non modèles. Ce protocole décrit comment générer des lignées knock-out de Culex pipiens,de la préparation de mélanges d’injection à l’obtention et à l’injection d’embryons de moustiques, ainsi que la façon d’élever, de croiser et de dépister les moustiques injectés et leur progéniture pour les mutations souhaitées.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Le système bipartite GAL4-UAS est un outil polyvalent pour la modification de l’expression des gènes de manière spatio-temporelle contrôlée qui permet une analyse génétique fonctionnelle chez Anopheles gambiae. Les procédures décrites pour l’utilisation de ce système sont une stratégie de clonage semi-standardisée, le sexage et le dépistage des pupes pour les marqueurs de protéines fluorescentes et la fixation des embryons.

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Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Les protocoles présentés ici illustrent trois autres façons d’évaluer la performance des moustiques génétiquement modifiés destinés à la lutte antivectorielle dans des essais en laboratoire sur de petites cages. Chaque protocole est adapté à la modification spécifique de la souche de moustique (forçage génétique ou non) et aux types de paramètres mesurés.

Essais en laboratoire en petite cage de moustiques anophélines génétiquement modifiés

Cet article détaille un protocole d’identification rapide des indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution.

Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti

L’administration orale d’ARNd produit par des bactéries, une méthode d’administration de l’interférence ARN (ARNi) couramment utilisée chez Caenorhabditis elegans, a été appliquée avec succès ici aux moustiques adultes. Notre méthode permet des études robustes de génétique inverse et des études de vecteurs bloquant la transmission sans l’utilisation de l’injection.

Administration efficace d’interférence ARN orale (ARNi) aux moustiques anophèles gambiens adultes

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’édition du génome par micro-injection embryonnaire chez le moustique A. aegypti à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9.

Édition du génome du moustique de la fièvre jaune Aedes aegypti à l’aide de CRISPR-Cas9

Découvrez la mutagenèse dirigée de gènes cibles dans les cellules de moustiques Anopheles par transfection d'oligonucléotides modifiés. Cette méthode permet d'étudier la fonction des gènes de l'immunité innée.

La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés dacide nucléique modifiés Oligonucléotides (Vidéo) | JoVE Journal

La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés d'acide nucléique modifiés Oligonucléotides

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