Les peptides de la bibliothèque de Phage Display modulent l'expression génétique dans les cellules mésenchymateuses et potentialiser l'ostéogenèse dans des défauts osseux Unicortical

L’objectif global de cette expérience est d’identifier des séquences qui potentialisent la différenciation des cellules mésenchymateuses et favorisent la réparation osseuse. La première étape consiste à isoler par biop le phage qui se lie à l’os. Procédez à l’identification des séquences peptidiques qui se lient aux cellules mésenchymateuses, et déterminez également les changements ultérieurs dans l’expression des gènes.

Réaliser des expériences pour déterminer comment les séquences peptidiques peuvent être délivrées à l’os à des fins de régénération. Comme dernière étape, examiner la réparation osseuse histologiquement prise ensemble, les résultats peuvent offrir des informations importantes sur les mécanismes de différenciation cellulaire in vitro et de réparation osseuse in vivo. Les avantages de l’utilisation de la technique de biop panning avec une bibliothèque d’affichage de phages sont que nous avons pu identifier des peptides qui ciblent l’os et peuvent être utilisés pour stimuler la différenciation des cellules mésenchymateuses et potentialiser la réparation osseuse.

En fin de compte, ces séquences peptidiques peuvent être utiles dans les modalités thérapeutiques de réparation osseuse et pour le traitement de la perte osseuse telle que l’ostéopénie et l’ostéoporose. Sur la base d’une étude où ULA et Pascal ont montré que le biop panning peut être utilisé pour isoler des séquences peptidiques qui ciblent les vaisseaux sanguins, nous avons choisi d’adapter cette méthode pour interroger les mécanismes dans l’os. Pour la procédure de biop panning in vivo, perfusé 10 fois 10 à la 10e plaque exécutant les unités de la bibliothèque de peptides d’affichage de phages N-E-B-P-H-D 12 à travers le cœur d’une souris de la valve C âgée de 10 semaines.

Après environ cinq minutes, euthanasiez la souris, exposez et disséquez les fémurs, coupez les extrémités et retirez la moelle osseuse. Rincez 10 fois le fémur gauche à l’intérieur et à l’extérieur avec du PBS. Ajoutez ensuite l’os à ER 2 5 3 7 bactéries.

Afin d’éliminer le phage non lié, utilisez du lait écrémé en poudre à 2 % dans une seringue avec une aiguille de calibre 21 pour rincer 10 fois le canal intermédiaire du fémur droit. Maintenant, éluez le phage lié du canal intermédiaire avec un tampon glycine d’acide chlorhydrique. pH 2,2 neutralisé avec un peu de temps.

Pour amplifier le phage, ajoutez l’EIT à la bactérie RE 2 5 3 7 et cultivez pendant 4,5 heures. Transférez soigneusement les surnageants dans des tubes frais et précipitez le phage trois fois par l’ajout de polyéthylène glycol. Avec une solution de chlorure de sodium, incubez les tubes pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Enfin, remettre le granulé en suspension dans du TBS avec 0,02 % d’azoture de sodium. Plaquez le phage sur des plaques pour déterminer les unités formant la plaque des IET amplifiés. Répétez quatre fois la procédure de bio-panoramique in vivo pour le phage éludé et le phage non élué.

Amplifier les phages regroupés dans des cultures bactériennes. Purifier et quantifier la séquence d’ADN, l’ADN final du phage, à l’aide de l’amorce 98 fournie avec le kit d’affichage des phages. Il est important de calculer la fréquence de représentation de la séquence d’ADN des phages.

Maintenant, synthétisez des peptides en incorporant une graine de séquence glycine glycine glycine sine et amplifiez les cellules D. Une lignée cellulaire stromale de moelle osseuse multipotentielle de souris clonée qui a été développée dans notre laboratoire à 90 % de confluence. La trypsine est les cellules et la centrifugeuse à granuler et à compter pour les cellules de plaque de coloration peptidique sur les lames de puits de chambre recouvertes de gélatine et la culture pendant 24 heures.

Lavez les cellules avec du PBS et fixez-les avec du paraldéhyde à 4 % pendant 30 minutes. Effectuez maintenant des incubations bloquantes avec de la glycine suivies de BSA Aden et BBSA. Solutions de blocage de la biotine.

Ajouter 100 micromolaires de peptides L sept et R un biotinylés. Procédez au lavage des cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Ajouter une dilution de un à 1000 de LOR, de décapage, de couvercle et de feuille d’aluminium et incuber dans un tiroir sombre pendant 30 minutes.

Lavez les cellules et montez les capots avec un support de montage de bouclier vectoriel. Analysez maintenant les lames au microscope fluorescent 24 heures avant l’opération. Faites tremper les cylindres de mousse de gel.

Transférez les cylindres de mousse de gel avec 20 peptides micromolaires L sept ou R un ou tampon PBS sans peptide vers stérile 12. Bien cultiver les plats et réfrigérer toute la nuit à quatre degrés Celsius au moment de la chirurgie. Placez le composite de téléphone en gel sur de la glace jusqu’à utilisation.

À l’aide d’une meule pneumatique sous irrigation saline, créez un grand défaut unicortical oblong de trois millimètres de largeur sur huit millimètres de longueur. Traitez le défaut osseux avec des mousses de gel préparées en insérant tous les échafaudages implantés à l’aide d’un léger tapotement. Euthanasiez les rats et prélevez le tibia à des moments définis, vérifiez soigneusement le défaut osseux et fixez le tibia récolté dans du formol tamponné à 10 % neutre pour la coupe en paraffine.

Enfin, colorez toutes les sections de tissu avec de l’éosine d’hématine pour marquer la matrice ostéo. L’isothiocyanate de fluorescéine marqué à Aden permet la détection microscopique de la liaison des peptides sur des cellules cultivées in vitro. Ici, les peptides se lient aux cellules mésenchymateuses en culture pour déterminer l’effet ostéogénique des peptides sur les cellules.

Les cellules mésenchymateuses in vitro en culture peuvent être traitées avec des peptides d’essai pour déterminer les changements dans la morphologie cellulaire. Par exemple, au quatrième jour, les cellules commencent à s’agréger et les agrégats grossissent avec le temps pour former des nodules. Il est intéressant de noter que la section osseuse a été colorée par autofluorescence h et e sous la lumière UV.

Ce plus grand contraste entre les tissus osseux et non osseux facilite les analyses, quantifie la présence d’os dans les coupes pour déterminer la réparation osseuse dans les défauts traités avec du gelfoam plus peptide. Par rapport à la mousse de gel seule, les défauts qui ont été remplis de peptide plus ont montré la plus grande quantité de réparation corticale avec le temps lors de la tentative de cette procédure. Il est important d’être extrêmement méthodique dans votre saisie de données en raison du grand nombre d’échantillons qui s’accumuleront invariablement au fil du temps jusqu’à ce que vous ayez sélectionné le groupe final de peptides.

Le développement du biopanoramique in vivo en tant que technique d’identification des peptides qui ciblent les os signifie que nous disposons maintenant de médicaments potentiels qui pourraient être utilisés comme thérapie pour la réparation osseuse et la perte osseuse. L’un des mécanismes qui sous-tend la réparation osseuse est également impliqué dans la perte osseuse. Comprendre ces mécanismes plus en détail et disposer d’outils qui pourraient être utilisés pour le traitement de troubles tels que les fractures tardives et l’ostéoporose aidera à améliorer les thérapies qui peuvent être conçues pour les soins de santé.