Name: Protocole pour la production dun croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Apprenez à produire des croisements génétiques du parasite du paludisme Plasmodium yoelii chez les rongeurs. Cette méthode permet de générer des progénitures recombinantes pour étudier la résistance aux médicaments et la transmissibilité.

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Nous remercions les Drs Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Paré et Tovi Lehman pour une lecture critique des manuscrits. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros de la Division de la recherche intra-muros, l&#39;Institut national des allergies et maladies infectieuses, National Institutes of Health, et par le Programme national de recherche de base 973 de la Chine, # 2007CB513103. Nous remercions le NIAID intra-muros éditeur de Brenda Marshall Rae pour l&#39;assistance.

Techniques d'asepsie doivent être appliquées à tous les matériaux qui seront administrés dans des animaux pour éviter l'introduction involontaire d'agents infectieux exogènes dans des souris qui peuvent confondre les résultats expérimentaux. 1. L'infection de souris de laboratoire avec des parasites du paludisme au stade sanguin <ol><li> A température ambiante, le dégel deux flacons contenant les parasites du sang congelé stade de la malaria à franchir. Dans cet exemple, deux souches de rongeur parasite du paludisme Plasmodium yoelii sont utilisés yoelii et Plasmodium yoelii nigeriensis. </li><li> Fit une seringue avec une jauge de 22 à 30 (G) l'aiguille et d'élaborer des 400 ul de stériles, des produits pharmaceutiques de qualité PBS (pH 7,4). </li><li> En utilisant la même seringue, tirer jusqu'à 100 uL de sang infectés décongelés; inverser la seringue de haut en bas jusqu'à ce que le contenu est mélangés de façon homogène. (Facultatif: une pipette peut être utilisé pour transférer du PBS et du sang infecté dans un tube de collecte avant d'être transférés dans une seringue pour injection). </li><li> Injecter 200 ul de parasite contenant une solution directement dans le péritoine d'une souris. Lorsque vous avez terminé, jeter la seringue dans une poubelle les objets tranchants. (Voir aussi Matières supplémentaires pour l'entretien des souris de laboratoire). En général, la taille standard de l'inoculum est entre 100-500 ul, selon les niveaux d'infections parasitaires dans les documents originaux congelés. </li><li> Injecter les deux souches de parasites d'être franchi dans deux souris chacun. Les souris deviennent positifs au microscope 3 à 5 jours après les injections. Lorsque parasitémies atteindre entre 1-5%, passez à l'étape suivante. </li></ol> 2. Infection Clone mixte de Souris <ol><li> Avant l'infection clone mixtes, collecter sang de la queue des deux souris donneuses infectées par les souches de parasites différents pour l'examen microscopique par colorées au Giemsa des frottis sanguins minces (Fig. 3), et pour la mesure de la densité des globules rouges (voir Matériaux supplémentaires pour les procédures détaillées) . </li><li> Calculer le volume d'un sérum physiologique (1,5% p / v citrate trisodique dihydraté, 0,85% de chlorure de sodium p / v) et le sang de souris nécessaire pour produire un mélange d'inoculum, en utilisant la parasitémie et le rouge du sang des mesures de densité cellulaire obtenue plus tôt. </li><li> Ajuster la solution parasite à une concentration finale d'un million de globules rouges infectés par 100 ul. </li><li> Combinez le sang infecté par les deux bailleurs de fonds dans un rapport 1:1 pour obtenir un inoculum mixte-clone. Lorsque les deux clones parentaux diffèrent du taux de croissance, d'ajuster les proportions d'un. Croissance rapide des parents à un clone à croissance plus lente des parents à 1:2 ou 1:5 </li><li> Injecter 100 ml de l'échantillon mélangé dans le péritoine de chaque souris pour être infecté. (Voir aussi étape 3.9 pour déterminer le nombre de souris pour être injecté) </li><li> En utilisant cette méthode, infecter deux souris chacun avec les souches seul des parents. Les infections seul clone permettra de déterminer la transmission réussie des deux souches parentales. </li></ol> 3. Les moustiques alimentation <ol><li> Préparer trois cages contenant 300 à 500 adultes (hommes et femmes) Anopheles stephensi moustiques chacun, l'âge émergence 5-7 jours après à partir de pupes. Les conteneurs sont recouverts de grillage sécurisé par un plastique ou un couvercle en métal. Deux cages sont à l'alimentation sur les clones parentaux, la cage troisième est pour la préparation d'un croisement génétique. </li><li> À partir quatre jours après l'infection mixte-clone, préparer colorés au Giemsa minces frottis de sang de la queue de souris infectées. </li><li> Examiner les frottis au microscope à balayage par au moins 50 champs microscopiques à un grossissement de 1000x et déterminer si gamétocytes mâles et femelles sont présents. </li><li> Gamétocytes mâles et femelles sont reconnaissables en raison de la présence de gros granules et de grandes vacuoles (fig. 3). Gamétocytes mâles et femelles ont le cytoplasme rose et bleu, respectivement. Si gamétocytes sont présents, suivre l'étape 3.6. </li><li> Si gamétocytes sont absents, garder un suivi quotidien jusqu'à ce qu'ils apparaissent. Si gamétocytes sont présents, continuent l'étape suivante. </li><li> Injecter 50 ul de cocktail de médicaments anesthésiques contenant 33 mg / ml de kétamine et de 3 mg / ml de xylazine dans le péritoine d'une souris pour anesthésier chaque souris infectées (par 20 gramme de poids corporel de la souris). Dose finale de kétamine et de xylazine est de 82,5 et 7,5 mg / kg, respectivement. </li><li> Placez la souris à l'envers sur le dessus d'une cage contenant les adultes que les moustiques Anopheles stephensi ont été privés de l'approvisionnement en sucre pendant 24 heures et permettre aux moustiques de se nourrir pendant 30 minutes sans interruption. </li><li> Maintenir les moustiques dans un insectarium dans des conditions standard (température est maintenue entre 24-26 ° C, voir également des méthodes supplémentaires pour l'entretien du laboratoire de moustiques). </li><li> Utilisez une souris infectée par tous les 50-100 moustiques femelles. Euthanasier les souris immédiatement par dislocation cervicale après la tétée alors que les souris sont encore sous anesthésie. </li></ol> 4. Midg Mosquito dissectionuts et des oocystes de comptage <ol><li> Neuf jours après la tétée, les moustiques seront examinés pour des oocystes dans l'intestin moyen des insectes. La présence d'oocystes dans les moustiques qui se nourrissent sur un seul clone souris infectées indique que les gamétocytes des deux souches parentales sont infectieuses. </li><li> Pour disséquer un intestin des moustiques, l'utilisation d'un aspirateur relié à un petit récipient pour recueillir 5 à 10 moustiques infectés de la cage. </li><li> L'utilisation du gaz CO 2, anesthésier les moustiques et les transférer dans un plat en verre de Pétri sur la glace. Séparée et jetez les moustiques mâles. Les antennes des mâles sont nettement plus touffu en comparaison avec les femelles. </li><li> Remplir deux seringues avec du PBS et les adapter aux calibre 26 demi-pouce (G ½) des aiguilles. Caution de 100 ul de PBS à partir d'une seringue sur une lame de verre. </li><li> Transfert de 5 à 10 anesthésiés moustiques femelles sur la goutte de PBS et de placer la lame sur un microscope à dissection. </li><li> En utilisant la même aiguille, enlever les ailes de chaque moustique et les jambes, puis, tenant l'insecte à l'abdomen du thorax et postérieur, tirez le corps de l'autre jusqu'à l'intestin moyen, un blanc en forme de sac du corps, est libéré. Détachez l'intestin moyen et jeter le reste du corps. </li><li> Ajouter plus de PBS sur l'intestin moyen, si les lames sont sèches. L'intestin moyen va dégénérer si les laissez sécher. Placer une lamelle sur la estomacs. </li><li> Examiner les estomacs sous un microscope optique à un grossissement 100x. Comptez le nombre d'oocystes dans chaque intestin moyen (Fig. 3). Les oocystes sont reconnaissables comme à paroi épaisse structures circulaires qui se trouvent sur la surface extérieure de la estomacs. </li><li> Lorsque vous avez terminé, jeter les seringues, aiguilles, et glisser dans une poubelle les objets tranchants. </li><li> Si les oocystes sont absents dans les estomacs, nourrir les moustiques avec des souris infectées avec le plus grand nombre de gamétocytes et donner un plus long temps d'alimentation. La température est critique pour cette étape. Assurez-vous que la température est fixé à 24 à 26 ° C. </li></ol> 5. Collecte sporozoïtes de moustiques par centrifugation <ol><li> Préparer des tubes de prélèvement sporozoïte comme suit: couper le couvercle d'un tube à centrifuger de 0,5 ml propre et percer un trou (0,1-0,2 mm de diamètre) au fond du tube en utilisant une aiguille de 19 G flambé. </li><li> Remplir 1 / 3 du tube avec de la laine de verre. Insérez le tube du filtre dans un tube de collecte de 1,5 mL (un tube est suffisante pour la récolte sporozoïtes de ~ 100 moustiques) </li><li> Sur l'alimentation après 17 jours, de recueillir les moustiques (étape 4) de la cage dans un petit récipient à l'aide d'un aspirateur. </li><li> Utilisez gaz CO 2 à anesthésier les moustiques. </li><li> Séparez les femelles des moustiques mâles. Transférer les moustiques femelles anesthésiées par le conteneur pour un plat en verre de Pétri sur la glace. </li><li> Préparer deux seringues avec des aiguilles 26 G ½ remplis avec du PBS. Caution de 100 ul de PBS à partir d'une seringue sur une lame de verre. </li><li> Transférer les moustiques sur une lame de microscope. Retirez la tête des moustiques, des ailes, des jambes et l'abdomen sous un microscope à dissection. </li><li> En utilisant une pince à pointe fine transférer le thorax dans 0,5 ml de PBS dans un homogénéisateur de 1,5 mL (mortier et un pilon). Stocker le thorax sur glace (sporozoïte reste infectieux pendant 2-3 h). </li><li> Homogénéiser le thorax sur la glace pour libérer les sporozoïtes des glandes salivaires (voir Figure 3), et le transfert des lysats (broyats) dans le tube rempli de laine de verre (étape 5.1 à 5.2) en utilisant une pipette en verre. </li><li> Centrifuger pendant 10 à 20 sec à 1000 rpm à température ambiante. </li><li> Recueillir l'écoulement continu (la suspension de sporozoïtes purifiés) à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 22 à 30 G. (Facultatif: chute de 10 à 50 uL de l'écoulement continu sur une lame de microscope, placer une lamelle et visualiser les sporozoïtes vivre sous un microscope optique standard, 400X grossissement, voir aussi Fig 3) </li><li> Injecter ip de 0,1 à 0,5 ml de la suspension de sporozoïtes chez des souris (jusqu'à 200 000 parasites peuvent être récoltés à partir d'un seul moustique, voir réf 12). Dans un cas de succès, l'animal sera infecté 72 heures après une injection. </li></ol> 6. Progeny clonage en utilisant une dilution limitée <ol><li> Soixante-douze heures après les injections de sporozoïtes, collecter sang de la queue des deux souris donneuses infectées par les souches de parasites différents pour l'examen microscopique après coloration de Giemsa de frottis sanguins minces et pour la mesure de la densité des globules rouges (voir Matériaux supplémentaires pour les procédures détaillées). </li><li> Choisissez une souris affichant une parasitémie 0,1 à 1% et dont les globules rouges infectés contiennent des parasites souvent seule en tant que donateur pour la procédure de clonage. Répétez l'étape 6.1 prochains jours si les souris sont microscopiquement négatifs. Si les animaux ne sont pas infectés dans les 14 jours, répétez l'étape 2 à 5 et de déterminer la présence de sporozoïtes dans l'étape 5.11). </li><li> Diluer le sang de la queue récoltés dans un froid 1h01 solution de Ringer sérum de veau et de mammifères (2,7 mM de chlorure de potassium, chlorure de calcium 1,8 mM, 154 mM de chlorure de sodium) afin d'atteindre un conconcentration de 0,6 à 1 globule rouge infecté par 100 ul, et de stocker l'inoculum sur la glace. De cette manière, la plupart des souris individu doit recevoir soit un ou zéro parasites. </li><li> Par voie intraveineuse, injecter 100 ml de sang infecté diluée dans chaque de 50 à 100 souris. </li><li> Cinq à sept jours plus tard, l'écran les souris de la présence de parasites au stade sanguin en examinant colorés au Giemsa des frottis sanguins minces. Dans une expérience réussie, 20-50% des souris infectées et montrera parasitémie de 0,1 à 5,0% à 8 jours après l'infection. </li></ol> 7. Caractérisation de Progeny aide de marqueurs génétiques <ol><li> Recueillir 20 à 40 ul de sang de la queue de la souris dans un microtube de 1,5 ml contenant 0,2 ml de solution de citrate de sérum physiologique refroidi, brièvement au vortex et centrifuger 3 min à 3000 rpm à température ambiante pour obtenir un culot des cellules sanguines. Extraire l'ADN immédiatement ou garder la pastille à -80 ° C. </li><li> Préparer l'ADN du parasite en utilisant n'importe quel des méthodes standard d'extraction d'ADN. Pour l'isolation rapide de l'ADN, utiliser un High Pure PCR préparation template kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Recombinant descendance sont identifiés après le génotypage à l'aide de microsatellites (MS) ou single nucleotide polymorphism (SNP) sur différents chromosomes qui peuvent différencier les deux souches parentales de la croix génétique. Une méthode simplifiée utilisant une seule des amorces fluorescentes marquées pour MS génotypage de P. yoelii peut être utilisé (voir réf 8,9). </li></ol> 8. La cryoconservation des parasites du paludisme au stade sanguin <ol><li> Recueillir 0,5-1 ml de sang infecté par ponction cardiaque à partir d'une souris anesthésiés avec une parasitémie de 5-20% 5-10 mL dans le sérum physiologique refroidi. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 2000 rpm à température ambiante. Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter goutte à goutte 2x volume de la solution de Glycerolyte 57 (Fenwal Laboratories) sur pastilles de sang et bien mélanger. </li><li> Transférer la suspension dans des cryotubes (0,2-0,5 ml par tube). </li><li> Stocker le sang cryoconservés à -80 ° C (jusqu'à 1 mois) ou dans l'azote liquide. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs: Dans une expérience réussie, 5-10% des lignes cloné sera indépendant progéniture recombinantes. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentation schématique du cycle de vie et des événements de recombinaison génétique lors d'un croisement génétique. Événements de recombinaison génétique ont lieu durant la phase précoce de développement dans le moustique. Après la fécondation de "haploïde" gamètes mâles et femelles de différentes origines génétiques dans l'intestin du moustique, "diploïde" zygotes sont formées. Le zygote diploïde constitue l'étape seulement du cycle de vie du parasite; méiose suit dans les 12 heures de la fécondation, et toutes les étapes ultérieures dans le moustique et les mammifères restent haploïdes. Les zygotes résultant développer en ookinètes et des oocystes. La croissance et la division mitotique de chaque oocyste produit des milliers de sporozoïtes, qui sont libérées dans hemoceal moustiques. Ceux sporozoïtes qui migrent vers les glandes salivaires sont en position d'être transmis à un hôte mammifère, où le développement du foie et rouge stades cellulaires du sang a lieu. Au cours des cycles de globules rouges, certains parasites peuvent se différencier en maturité gamétocytes mâles et femelles. Le cycle de vie du parasite est terminée lorsque ces gamétocytes sont repris par un autre moustique, la transmission perpétuer. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Héritage des gènes nucléaires des parasites du paludisme et de la production de la descendance recombinante. La recombinaison génétique peuvent être générés par réassortiment chromosomique ou par des événements croisé. Progéniture produite par autofécondation homozygote entre les gamètes d'un même clone parental 1 ou 2 (A et D), respectivement. B) la descendance hétérozygote produit par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux différents clones parentaux, les noyaux recombinante (ovales bleu) étant formé par réassortiment chromosomiques seul. C) la descendance hétérozygote produit à partir de la fertilisation croisée entre les gamètes des deux clones parent différent, les noyaux recombinante (ovales rouge) étant formé par les croisements entre les chromatides non-sœurs des chromosomes homologues. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Morphologie du rongeur parasite du paludisme Plasmodium yoelii. A) stade anneau, B) trophozoïte, C) schizonte, D) mérozoïtes, E) immatures gamétocytes mâle, F) gamétocytes mâles matures, G) immatures gamétocytes femelles, H) gamétocytes femelles matures, I) l'intestin moyen avec des oocystes au jour 10 après l'alimentation (oocystes matures indiquées par des flèches; 200x de grossissement), J) les glandes salivaires des moustiques (grossissement 100x), K) sporozoïtes (400x de grossissement).

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Nous démontrer les techniques pour la production d&#39;un croisement génétique chez le rongeur le paludisme à Plasmodium yoelii, qui est également applicable à la production des croisements génétiques dans les paludismes autres rongeurs. Infections des souris avec une seule clones parentaux sont généralement effectués pour déterminer la transmission réussie des parasites des parents pour s&#39;assurer que les parents sont compétents dans la production de gamètes fonctionnels avant d&#39;effectuer une croix. </p...

MATÉRIAUX SUPPLÉMENTAIRES: <ul><li> Entretien des souris de laboratoire </li><li> Entretien du laboratoire des moustiques </li><li> L&#39;examen microscopique des frottis sanguins minces colorés avec le colorant de Giemsa </li><li> Mesure de la densité des globules rouges </li></ul> Entretien des souris de laboratoire Les femelles de souche de laboratoire de souris consanguines BALB / c, âgés de 5 à 8 semaines, sont utilisées dans l&#39;étude. Les souris sont logées dans un standard solide fond de la cage en polycarbonate avec fil-bar couvercle, équipé d&#39;engraissement et une bouteille d&#39;eau. Les souris sont maintenus à une température constante (25 ± 1 ° C) sur 12:12 heures de lumière: le cycle noir. Les souris sont autorisés à se nourrir de 2018S Harlan Teklad mondiale régime protéiné rongeurs 19% extrudé (stérilisable; de ​​Harlan-Teklad) et fourni avec acidifiés potable de l&#39;eau ad libitum. Expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation à l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses en vertu du protocole LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Entretien du laboratoire des moustiques Les moustiques sont d&#39;une colonie de laboratoire de race Anopheles stephensi. Les adultes sont maintenus dans des cages en nylon maintenu à une température et humidité contrôlées ambiante (23 à 25 ° C pour le Plasmodium yoelii et Plasmodium chabaudi, et 19 à 21 ° C pour Plasmodium berghei, 80 à 95% humidité; le 12:12 heures de lumière: le cycle sombre). Les moustiques adultes sont nourris avec du glucose à 10% et 2,00% acide para-aminobenzoïque (PABA) une solution d&#39;eau complété. Pour obtenir de haute qualité aux adultes, 500 larves sont cultivées dans un état ​​de faible densité dans 1 L d&#39;eau distillée dans un 1000 cm 3-plat ouvert fourni avec environ 1 mg de bicarbonate de sodium. Après éclosion, les larves sont donnés TetraMin poudre (PETCO) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils développent dans le stade de pupe et sont transférés vers les cages de moustiques adultes pour les pays émergents. L&#39;examen microscopique des frottis sanguins minces colorés avec le colorant de Giemsa Avec des ciseaux propres coupez l&#39;extrémité (1,0 mm) de la queue de la souris infectée. Déposer une goutte (0,5-1,0 uL) de sang de la queue sur une lame de spécimen propre. La souris arrêter le saignement dans les 1-2 min. Placez une diapositive épandeur de nettoyage sur le dessus de la goutte de sang, son maintien à un angle de 45 ° par rapport à la diapositive échantillon, et permettre au sang d&#39;adsorption sur toute la largeur de l&#39;épandeur. Tenir la lamelle de préparation et de faire avancer la diapositive écarteur rapidement et en douceur pour produire un frottis mince. Laissez le film de sang sec, puis plonger les lames dans du méthanol absolu. Laisser la lame sécher à l&#39;air une fois de plus avant de le couvrir au Giemsa (10% de colorant Giemsa à l&#39;eau distillée). Après incubation des films minces de sang pendant 10-15 min à température ambiante, rincer soigneusement les lames avec de l&#39;eau du robinet et laissez sécher à l&#39;air. Examinez le nombre de globules rouges infectés (CISR; voir la figure 3 pour la morphologie des personnes infectées RBC) sous un microscope à lumière avec de l&#39;huile d&#39;immersion à un grossissement de 1000x (avec lentille de l&#39;objectif 100x) et calculer la parasitémie (le nombre d&#39;CISR par 100 RBC comptés). Différentes souches de parasites du paludisme varie en taux de croissance et la pathogénicité. Suivi des parasitémies stade sanguin peut être effectué 24 heures après les injections, en fonction de la dose de parasites du sang, le paludisme scène. Par exemple, les souris seront positifs au microscope 24 heures lorsqu&#39;il est injecté avec 10 7 infectées par voie intrapéritonéale RBC ou 10 6 infectées RBC par voie intraveineuse. Mesure de la densité des globules rouges Comme les niveaux de parasitémie, de globules rouges (RBC) de densité chez les souris infectées varie tout au long du cours de l&#39;infection. La densité de RBC doit être mesurée dans les 1-2 heures avant le début de l&#39;infection unique et mixte clone et les expériences de clonage. Il existe deux méthodes pour la mesure de la densité de RBC: un comptage manuel en utilisant Neubauer hémocytomètre et une de comptage automatique en utilisant un Cellometer (Nexcelom Bioscience). Dans les deux méthodes, retirer 1 pl de sang de la queue de la souris en utilisant un capillaire en verre (VWR) et diluer dans 10 ml de PBS et mélangez bien. Pour utiliser un hémocytomètre Neubauer, charge de 20 pi de la suspension sur le hématimètre. Placez le hématimètre sur un microscope optique avec objectif 10x. L&#39;hématimètre contient une grille divisée en 9 grandes places, et 4 grands carrés à l&#39;angle sont encore divisés en 16 petits carrés. Compter le nombre total de cellules dans chacune des 16 petits carrés dans les quatre cases de coin. Pour éviter de compter partialité ou le comptage des cellules qui se chevauchent une ligne de grille, comptez une cellule comme &quot;in&quot; s&#39;il recouvre les lignes haut ou à droite et &quot;out&quot; s&#39;il recouvre les lignes en bas ou de gauche. Estimer le nombre de cellules par une petite place et diviser par 0,00625 (le volume d&#39;un petit carré est de 6,25 nL). Cela donne le nombre de cellules par microlitre (&amp;mu, L). De ces données, calculer la densité de la finale de globules rouges en multipliant avec 10.000 (un facteur de dilution). Rincer la lamelle et chambre de comptage de l&#39;eau distillée et 70% d&#39;éthanol; l&#39;air sec. Sinon, charge de 20 pi de la suspension sur une lame de chambre Cellometer comptage. Insérez la lame dans une chambre de glisser Cellometer (le lecteur). Démarrez le logiciel Cellometer, sélectionnez l&#39;option &quot;globules rouges du sang&quot; option, puis entrez un facteur de dilution de 10 000. Enregistrement de la densité de RBC.

protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation de la réponse aux médicaments antipaludiques et dans la pathogénicité des parasites du paludisme est de l&#39;importance biologique et médicale. Cartographie de liaison a conduit à l&#39;identification réussie de gènes ou loci sous différents traits de parasites du paludisme des rongeurs 1-3 et humains 4-6. Le parasite du paludisme Plasmodium yoelii est l&#39;une des nombreuses espèces de paludisme isolé de rongeurs africains sauvages et a été adapté à croître dans les laboratoires. Cette espèce se reproduit de nombreuses caractéristiques biologiques des parasites du paludisme humain; marqueurs génétiques tels que des microsatellites et amplifié fragment length polymorphism (AFLP) ont également été développés pour le parasite 7-9. Ainsi, les études génétiques des parasites du paludisme des rongeurs peuvent être effectués pour compléter les recherches sur Plasmodium falciparum. Ici, nous montrons les techniques de production d&#39;un croisement génétique de P. yoelii qui ont d&#39;abord mis au point par les Drs. David Walliker, Richard Carter, et ses collègues de l&#39;Université d&#39;Edimbourg 10. Croisements génétiques de P. yoelii et autres parasites du paludisme chez les rongeurs sont menées en infectant les souris Mus musculus avec un inoculum contenant des gamétocytes de deux clones génétiquement distincts qui diffèrent dans les phénotypes d&#39;intérêt et en permettant aux moustiques de se nourrir de souris infectées quatre jours après l&#39;infection. La présence de gamétocytes mâles et femelles dans le sang au microscope de la souris est confirmée avant la tétée. Dans les 48 heures après le repas, dans l&#39;intestin moyen du moustique, les gamétocytes haploïdes se différencier en gamètes mâles et femelles, fertiliser, et forment un zygote diploïde (Fig. 1). Pendant le développement d&#39;un zygote dans un ookinète, méiose semble se produire 11. Si le zygote est dérivée par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux parasites génétiquement distinctes, les échanges génétiques (réassortiment chromosomiques et cross-overs entre les chromatides non-sœurs d&#39;une paire de chromosomes homologues;. Fig 2) peut se produire, résultant en une recombinaison du matériel génétique au locus homologue. Chaque zygote subit deux divisions successives nucléaires, conduisant à quatre noyaux haploïdes. Un ookinète développe davantage dans un oocyste. Une fois l&#39;oocyste mûrit, des milliers de sporozoïtes (la descendance de la croix) sont formés et libérés dans hemoceal moustiques. Les sporozoïtes sont récoltées à partir des glandes salivaires et injecté dans un nouvel hôte murin, où le développement stade pré-érythrocytaire et érythrocytaire a lieu. Formes érythrocytaires sont clonés et classés à l&#39;égard des caractères distinctifs des lignées parentales avant la cartographie de liaison génétique. Contrôle des infections de l&#39;individu clones parentaux sont effectuées de la même manière que la production d&#39;un croisement génétique.

Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements génétiques<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Et est applicable à d&#39;autres parasites du paludisme chez les rongeurs.

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

La variation de la réponse aux médicaments antipaludiques et de la pathogénicité des parasites du paludisme revêt une importance biologique et médicale. La cartographie par liaison a permis de...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un croisement génétique du parasite du paludisme à rongeurs Plasmodium yoelii afin de générer une descendance recombinante. Cette opération est réalisée en injectant d'abord un groupe de souris avec un inoculum mixte contenant les deux clones parentaux des parasites à croiser. Les souris infectées sont ensuite utilisées pour nourrir des moustiques, à l'intérieur desquels les gamètes de chaque souche parentale fusionnent pour former un zygote diploïde ; la division méiotique à ce stade pouvant entraîner une recombinaison génétique, conduisant ainsi à la production d'une descendance recombinante.Les sporozoïtes obtenus sont ensuite récoltés dans les glandes salivaires des moustiques et réinjectés dans des souris naïves destinataires afin d'obtenir des parasites du stade sanguin, parmi lesquels se trouvent des clones recombinants individuels pouvant être isolés par dilution limitée. Dans une expérience réussie, cinq à 10 % des lignées clonées seront des recombinants, qui peuvent être caractérisés par typage génétique à l'aide de marqueurs génétiques appropriés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domain

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo illustre les techniques générales utilisées pour l'arrière Anopheles gambiae dans le laboratoire. Les méthodes pour prendre soin de moustiques de laboratoire sont démontrées par tous les stades du cycle de vie de l'organisme à partir de larves en pupes au sang maternel adultes.

Protocole pour l&#39;élevage des moustiques (A. gambiae)

Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires au paludisme, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections à Plasmodium dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des infections à Plasmodium de moustiques peuvent être dosés. Les techniques de préparation de la culture de gamétocytes, se nourrissant de sang humain membrane moustiques, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Protocole pour les infections à Plasmodium falciparum dans la détermination Phénotype moustiques et les infections

Cette vidéo montre la génération d’un modèle murin expérimental de paludisme cérébral. Des sporozoïtes isolés de moustiques femelles infectées par Plasmodium berghei sont injectés dans les veines de la queue d'une souris restreinte, entraînant une rupture de la barrière hémato-encéphalique et une inflammation cérébrale, provoquant un paludisme cérébral. Ce modèle de souris infectée offre un outil précieux pour étudier in vivo la pathologie microvasculaire associée au paludisme cérébral.

Génération d’un modèle murin de paludisme cérébral expérimental à l’aide de sporozoïtes dérivés de moustiques hôtes

La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l'épreuve avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie naturelle de l'infection.

Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei</i

Les moustiques transmettant le paludisme présentent un certain nombre de caractéristiques épidémiologiquement importantes qui ne peuvent être détectées qu’à l’aide de techniques moléculaires. À l’aide d’une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF, nous avons mis au point un test permettant de détecter simultanément plusieurs traits clés (espèce, résistance aux insecticides, infection parasitaire et choix de l’hôte) des vecteurs du paludisme.

Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

Les auteurs décrivent une méthode pour générer des MLG-base conditionnelles mutants knockdown de Plasmodium falciparum à l’aide de CRISPR/Cas9 génome édition.

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

Le système bipartite GAL4-UAS est un outil polyvalent pour la modification de l’expression des gènes de manière spatio-temporelle contrôlée qui permet une analyse génétique fonctionnelle chez Anopheles gambiae. Les procédures décrites pour l’utilisation de ce système sont une stratégie de clonage semi-standardisée, le sexage et le dépistage des pupes pour les marqueurs de protéines fluorescentes et la fixation des embryons.

Utilisation du système GAL4-UAS pour la génétique fonctionnelle chez Anopheles gambiae

Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .

Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Apprenez à produire des croisements génétiques du parasite du paludisme Plasmodium yoelii chez les rongeurs. Cette méthode permet de générer des progénitures recombinantes pour étudier la résistance aux médicaments et la transmissibilité.

Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

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