Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un croisement génétique du parasite du paludisme à rongeurs Plasmodium yoelii afin de générer une descendance recombinante. Cette opération est réalisée en injectant d'abord un groupe de souris avec un inoculum mixte contenant les deux clones parentaux des parasites à croiser. Les souris infectées sont ensuite utilisées pour nourrir des moustiques, à l'intérieur desquels les gamètes de chaque souche parentale fusionnent pour former un zygote diploïde ; la division méiotique à ce stade pouvant entraîner une recombinaison génétique, conduisant ainsi à la production d'une descendance recombinante.

Les sporozoïtes obtenus sont ensuite récoltés dans les glandes salivaires des moustiques et réinjectés dans des souris naïves destinataires afin d'obtenir des parasites du stade sanguin, parmi lesquels se trouvent des clones recombinants individuels pouvant être isolés par dilution limitée. Dans une expérience réussie, cinq à 10 % des lignées clonées seront des recombinants, qui peuvent être caractérisés par typage génétique à l'aide de marqueurs génétiques appropriés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le paludisme, telles que quelles sont les déterminants génétiques de la résistance aux médicaments et de la transmissibilité dans le paludisme ?

Parasites à température ambiante pour deux flacons contenant le stade sanguin congelé, des parasites du paludisme devant être croisés. Dans cet exemple, les deux souches de parasites du paludisme de rongeur utilisées sont Plasmodium yoelii et Plasmodium yoelii nigeries. Munissez une seringue d'une aiguille de calibre 22 à 30 et aspirez 400 microlitres de PBS à pH 7,4 en utilisant la même seringue.

Aspirez 100 microlitres du sang infecté par Thor, puis retournez la seringue plusieurs fois afin de bien mélanger son contenu de manière homogène. Au cours de cette démonstration, des animaux anesthésiés seront utilisés afin de minimiser la douleur et le stress. L'anesthésie est réalisée par injection de 50 microlitres d'un cocktail anesthésiant contenant 82,5 milligrammes par kilogramme de kétamine et 7,5 milligrammes par kilogramme de xylazine dans le péritoine d'une souris.

Surveiller les souris pour évaluer la profondeur de l'anesthésie et prévenir la mortalité. Grâce à cette procédure, les souris resteront anesthésiées pendant 20 à 30 minutes. Avant la récupération, injecter 200 microlitres de solution contenant des parasites directement dans le péritoine d'une souris.

Lorsque l'opération est terminée, jeter la seringue dans un conteneur pour objets tranchants. À l'aide de cette méthode, infecter deux souris avec chacun des deux parasites dont on souhaite obtenir le croisement, trois à cinq jours après les injections. Les parasites du stade sanguin se développeront chez les souris infectées.

Couper l'extrémité de la queue du souris donneur infectée par différentes souches de parasites à l'aide de ciseaux stériles. Prélever une goutte de sang de la queue de la souris sur une lame de microscope et réaliser des frottis minces. Colorer le frottis sanguin mince avec la coloration de Giemsa.

Le colorant Guillem SA ne colore pas les globules rouges non infectés en raison de l'absence de noyau dans ces cellules. Le SAI colorera le noyau du parasite dans les globules rouges infectés ; les parasites apparaissent sous forme de stades en anneau, de trophozoïtes et de schizontes en cours de rupture. Une fois que l'anémie parasitaire atteint 1 à 5 % chez les deux souris, les parasites en stade sanguin peuvent être récoltés pour l'infection mixte de clones.

Prélevez l'extrémité de la queue de souris donneuses infectées par les différents parasites. Homogénéisez à l'aide de ciseaux stériles comme décrit précédemment. Recueillez un microlitre de sang de la queue de souris à l'aide d'une capillarité en verre dans un millilitre de PBS stérile ; utilisez 20 microlitres de la suspension sanguine pour analyser la densité des globules rouges avec un cell ome.

À l’aide de la densité des globules rouges et des mesures para, diluer les échantillons de sang dans une solution saline citratée physiologique afin d’obtenir une concentration de globules rouges infectés de 1 million par 100 microlitres. Combiner un échantillon de sang infecté provenant des deux donneurs selon un rapport un pour un afin d’obtenir un inoculum de clones mixtes. Ensuite, injecter 100 microlitres de l’échantillon mixte dans le péritoine de chaque souris à infecter.

Utilisez deux souris pour des infections par un clone unique afin de confirmer la transmission réussie de chaque souche parentale. Les stades sexuels du parasite, appelés gamétocytes mâles et femelles, devraient commencer à apparaître dans le sang des souris environ quatre jours après l'infection à ce moment-là. Commencez à surveiller quotidiennement les souris pour la présence de gamétocytes en prélevant du sang de la queue comme décrit précédemment et en préparant des frottis sanguins minces de la queue maintenus.

Les cytes mâles et femelles sont reconnaissables à la présence de gros granules ou de pigments. Le cytoplasme des gato sites mâles est rose, tandis que le cytoplasme des sites TER femelles est bleu. Seuls les gato sites matures présentent une grande vacuole.

Une fois les cytes mâles et femelles matures détectés, les souris peuvent être utilisées pour nourrir les moustiques. Injectez 50 microlitres de solution anesthésique de kétamine et de xylazine dans la cavité péritonéale de chaque souris infectée. Une fois les souris anesthésiées, placez-en une sur le dos, face vers le bas, sur le dessus d'une cage contenant 50 à 100 moustiques femelles Anis defense enzyme privés d'apport sucré depuis 24 heures, et laissez les moustiques se nourrir pendant 30 minutes sans interruption.

Euthanasier humainement les souris immédiatement après la période d'alimentation. Si la transmission est réussie, neuf jours après l'alimentation, les gamétocytes captés par les moustiques se seront fusionnés en zygotes diploïdes qui mûrissent en oocystes, visibles dans l'intestin moyen des insectes. Plus un grand nombre d'oocystes est détecté, plus les chances que les parasites recombinants aient été générés sont élevées.

Utilisez un aspirateur pour prélever cinq à 10 moustiques infectés dans la cage et transférez les moustiques dans un petit récipient. Anesthésiez les moustiques à l’aide de gaz dioxyde de carbone et transférez-les dans une boîte de Pétri en verre placée sur de la glace. Les mâles dont les antennes sont nettement plus touffues que celles des femelles doivent être écartés.

Remplissez deux seringues avec du PBS et fixez-y des aiguilles de 26 gauge d'un demi-pouce. Déposez environ 100 microlitres de PBS d'une seringue sur une lame de verre. Transférez cinq à dix moustiques femelles anesthésiés dans la goutte de PBS et placez la lame sous un microscope stéréo à l’aide des aiguilles.

Retirer les ailes et les pattes de chaque moustique, puis tenir l'insecte par le thorax et l'abdomen postérieur. Tirez sur le corps jusqu'à ce que le tube digestif moyen, une structure en forme de sac blanc, soit libéré. Détacher le tube digestif moyen et jeter le reste du corps tout en effectuant les dissections.

Veillez à maintenir les intestins moyens humides à l’aide du PBS des aiguilles de dissection. Placez une lame couvre-objet sur les intestins moyens une fois la dissection terminée. Examinez les intestins moyens au microscope optique à un grossissement de 100 fois.

Les OOS seront reconnaissables à leurs structures circulaires à paroi épaisse situées à la surface externe des intestins moyens. Comptez le nombre d'OOS dans chaque intestin moyen. Dix-sept jours après l'ingestion, les sporozoïtes libérés par les OOS auront migré vers les glandes salivaires des moustiques, sporozoïtes des parasites du paludisme.

Des cellules en forme de fuseau minces pour récolter les sporozoïtes. Préparez d'abord un tube de collecte à l'aide de ciseaux propres. Coupez le couvercle d'un petit tube einor de 500 microlitres.

Chauffer l'extrémité d'une aiguille stérile de calibre 19 et percer le fond du tube. Remplir un tiers du tube de paroi de verre pour créer un filtre. Insérer le tube filtre dans un tube einor plus grand de 1,5 millilitre.

Une fois l'appareil de filtration prêt, collecter et anesthésier les moustiques comme décrit précédemment. Monter les insectes à l'air libre pour la dissection comme auparavant, puis retirer les moustiques, les têtes, les ailes, les pattes et les abdomens. Seul le thorax contient les glandes salivaires infectées.

À l’aide de pinces fines, transférer le thorax dans un homogénéisateur de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS. Homogénéiser le thorax sur de la glace afin de libérer les sporozoïtes des glandes salivaires, puis, à l’aide d’une pipette en verre, transférer les homogénats dans l’appareil de filtration. Centrifuger le tube filtre pendant 10 à 20 secondes à 1000 tours par minute.

Une fois les homogénats centrifugés, récupérez le flux traversant à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 22 à 30 gauge. Injectez de 100 à 500 microlitres de la suspension de sporozoïtes dans le péritoine d’une souris. Commencez à surveiller la parasitémie et la densité des globules rouges chez les souris trois jours après l’infection.

Choisir une souris présentant une parasitémie de 0,1 à 1 % et dont les globules rouges infectés contiennent principalement des parasites uniques comme donneur pour la procédure de clonage. Prélever une quantité appropriée de sang dans du PBS en diluant le sang de la queue dans une solution froide, égale parts, de sérum de veau et de solution de Ringer pour mammifères, afin d'obtenir une concentration de 0,6 à 1 globule rouge infecté par 100 microlitres, puis conserver l'inoculum sur glace. Nettoyer le site d'injection sur la queue avec de l'éthanol par voie intraveineuse.

Injecter 100 microlitres de sang infecté dilué à chacune des 100 souris. De cette manière, chaque souris doit recevoir soit un parasite, soit aucun. Dans une expérience réussie, de 20 à 50 % des souris présenteront un taux parasitémique de 0,1 à 0,5 % au huitième jour.

Cinq à sept jours plus tard, dépister la présence de parasites en phase sanguine chez les souris en examinant des frottis sanguins minces fixés au gémothiazol. Les parasites issus du croisement peuvent ensuite être génotypés par PCR de l'ADN extrait d'échantillons sanguins de la queue, en utilisant des marqueurs génétiques situés sur différents chromosomes, tels que des microsatellites et des polymorphismes de nucléotide unique. Les parasites dont les loci génétiques indépendants proviennent des deux clones parentaux sont des clones recombinants.

Le sang des animaux infectés par des parasites recombinants peut être cryopréservé pour une utilisation ultérieure. Dans une expérience réussie, cinq à 10 % des souris au total présenteront une descendance recombinante indépendante. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment produire un processus génétique dans le paludisme.

Parasite plus milieu yoi. Cette méthode peut s'appliquer également à d'autres espèces de parasites.