Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

L’objectif global de cette procédure est de produire un croisement génétique du parasite du paludisme chez les rongeurs Plasmodium yoi afin de générer une descendance recombinante. Ceci est réalisé en injectant d’abord un groupe de souris avec un inoculum mixte contenant les deux clones parentaux des parasites à croiser. Les souris infectées sont ensuite utilisées pour nourrir les moustiques à l’intérieur, que la souris de chaque souche parentale fusionnera en une division myotique zygote diploïde à ce stade peut conduire à une recombinaison génétique, produisant ainsi une descendance recombinante.

Les sporozoïtes résultants sont ensuite récoltés sur les glandes saliennes des moustiques et réinjectés dans des souris receveuses naïves afin d’obtenir des parasites de stade sanguin, parmi lesquels se trouvent des clones recombinants individuels qui peuvent être isolés par dilution limitée. Dans une expérience réussie, 5 à 10 % des lignées clonées seront des recombinants, qui peuvent être caractérisés par génotypage pour des marqueurs génétiques appropriés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le paludisme, telles que : quels sont les déterminants génétiques des fourmis résistantes aux médicaments et la transmissibilité du paludisme ?

Parasites A température ambiante pour deux flacons contenant le stade de sang congelé, parasites du paludisme à croiser. Dans cet exemple, les deux souches de parasites du paludisme chez les rongeurs utilisées sont Plasmodium yoi, oi et Plasmodium. Les Nigérians de Yoi ajustent une seringue avec une aiguille de calibre 22 à 30 et aspirent 400 microlitres de PBS pH 7,4 à l’aide de la même seringue.

Prélevez 100 microlitres de sang infecté par Thor, retournez la seringue de haut en bas jusqu’à ce que le contenu soit mélangé de manière homogène. Lors de cette démonstration, des animaux anesthésiés seront utilisés afin de minimiser la douleur et le stress. L’anesthésie est réalisée en injectant 50 microlitres de cocktail de médicaments anesthésiques contenant 82,5 milligrammes par kilogramme de kétamine et 7,5 milligrammes par kilogramme de xylazine dans le péritoine d’une souris.

Surveillez les souris pour la profondeur de l’anesthésie et pour prévenir la mortalité. En utilisant cette procédure, les souris resteront sous anesthésie pendant 20 à 30 minutes. Avant la récupération, injectez 200 microlitres de solution contenant du parasite directement dans le péritoine d’une souris.

Une fois terminé, jetez la seringue dans une rotation brusque. En utilisant cette méthode, infectez deux souris avec chacun des deux drains de parasites à croiser trois à cinq jours après les injections. Des parasites sanguins se développeront chez les souris infectées.

Coupez l’extrémité de la queue de souris des souris donneuses infectées par les différentes souches de parasites avec des ciseaux stériles. Prélevez une goutte de sang de queue de souris sur une lame microscopique et effectuez de minces frottis. Teignez la fine tache de sang avec une tache de guillem.

Le colorant Guillem SA ne colore pas les globules rouges non infectés en raison des cellules non infectées. L’absence d’un noyau em SAI colorera le noyau du parasite dans les parasites infectés des globules rouges, les globules rouges apparaissent sous la forme de stades annulaires, les trophozoïtes skions et les maites en rupture . Une fois que l’anémie paras atteint un à 5 % chez les deux souris, les parasites au stade sanguin peuvent être récoltés pour l’infection à clone mixte.

Coupez le bout de la queue de souris des souris donneuses infectées par les différents parasites. Souches avec des ciseaux stériles comme décrit précédemment. Prélevez un microlitre de sang de queue de souris à l’aide d’un capillaire en verre dans un millilitre de PBS stérile, utilisez 20 microlitres de suspension sanguine pour analyser la densité des globules rouges avec ome cellulaire.

À l’aide de la densité des globules rouges et des mesures para, diluez les échantillons de sang dans une solution saline physiologique de citrate de manière à obtenir une concentration de globules rouges infectés de 1 million pour 100 microlitres. Combinez un échantillon de sang infecté des deux donneurs dans un rapport de un pour un pour obtenir un inoculum de clone mixte. Ensuite, injectez 100 microlitres de l’échantillon mélangé dans le péritoine de chaque souris à infecter.

Utilisez deux souris pour les infections à clone unique afin de confirmer la transmission réussie de chaque souche parentale. Les stades sexuels du parasite, appelés gamétocytes mâles et femelles, devraient commencer à apparaître dans le sang des souris environ quatre jours après l’infection. Commencez à surveiller quotidiennement les souris pour l’apparition de gamétocytes en recueillant le sang de la queue comme décrit précédemment et en préparant des frottis de queue de sang mince.

Les cytes mâles et femelles sont reconnaissables à la présence de gros granules ou de pigments. Le cytoplasme des sites Gato mâles est rose, tandis que le cytoplasme des sites TER femelles est bleu. Seuls les sites matures de gato présentent une grande vacuole.

Une fois que les cytes matures des deux sexes sont détectés, les souris peuvent être utilisées pour nourrir les moustiques. Injectez 50 microlitres de kétamine, de xylazine et de solution anesthésique dans le péritoine de chaque souris infectée. Une fois les souris anesthésiées, placez-en une face vers le bas sur le dessus d’une cage contenant 50 à 100 moustiques femelles de l’enzyme de défense de l’anis qui ont été privés de sucre pendant 24 heures et laissez les moustiques se nourrir pendant 30 minutes sans interruption.

Euthanasiez les souris sans cruauté immédiatement après la période d’alimentation. Si la transmission est réussie, neuf jours après l’alimentation, les gamétocytes absorbés par les moustiques auront fusionné en zygotes diploïdes qui se transforment en oocystes, que l’on peut voir dans l’intestin moyen des insectes. Plus il y a d’oocystes détectés, plus les chances sont élevées que les parasites recombinants aient été générés.

À l’aide d’un aspirateur, prélevez cinq à 10 moustiques infectés dans la cage et transférez-les dans un petit récipient. Anesthésiez les moustiques à l’aide de dioxyde de carbone et transférez-les dans une boîte de Pétri en verre sur de la glace. Les moustiques mâles dont les antennes sont nettement plus touffues que les femelles doivent être jetés.

Remplissez deux seringues de PBS et ajustez-les avec des aiguilles d’un demi-pouce de calibre 26. Déposez environ 100 microlitres de PBS à partir d’une seringue sur une lame de verre. Transférez cinq à 10 moustiques femelles anesthésiées sur la goutte de PBS et placez la lame sur un microscope à dissection à l’aide des aiguilles.

Retirez les ailes et les pattes de chaque moustique, puis tenez l’insecte au niveau du thorax et de l’abdomen postérieur. Séparez le corps jusqu’à ce que l’intestin moyen, un corps blanc en forme de sac soit libéré. Détachez l’intestin moyen et jetez le reste du corps pendant que vous effectuez les dissections.

Assurez-vous de garder le milieu des intestins humide à l’aide du PBS des aiguilles de dissection. Placez une lamelle sur le milieu des entrailles une fois la dissection terminée. Examinez les intestins moyens au microscope optique à un grossissement de 100 fois.

Les OOS seront reconnaissables comme des structures circulaires à paroi épaisse qui se trouvent sur la surface extérieure des intestins moyens. Comptez le nombre de OOS dans chaque intestin moyen. 17 jours après l’alimentation, les sporozoïtes libérés du système auraient dû migrer vers les moustiques des glandes SIV, les sporozoïtes des parasites du paludisme.

De fines cellules fusiformes pour récolter les sporozoïtes. Tout d’abord, préparez un tube de collecte à l’aide de ciseaux propres. Coupez le couvercle d’un petit tube einor de 500 microlitres.

Chauffez la pointe d’une aiguille stérile de calibre 19 et percez le bas du tube. Remplissez un tiers du tube avec une paroi en verre pour créer un filtre. Insérez le tube filtrant à l’intérieur d’un tube einor plus grand de 1,5 millilitre.

Une fois que l’appareil de filtration est prêt, collectez et anesthésez les moustiques comme décrit précédemment. Montez à l’air les insectes pour la dissection comme précédemment, et retirez les moustiques, les têtes, les ailes, les pattes et les abdomens qui partent. Seul le thorax contient les glandes siv infectées.

À l’aide d’une pince à pointe fine, transférez le thorax dans un homogénéisateur de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS. Homogénéiser le thorax sur de la glace pour libérer les sporozoïtes des glandes salivaires et à l’aide d’une pipette en verre, transférer les homogénats dans l’appareil de filtration. Centrifugez le tube filtrant pendant 10 à 20 secondes à 1000 rotations par minute.

Une fois les homogénats essorés, recueillir le débit à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 22 à 30. Injectez 100 à 500 microlitres de suspension de sporozoïte dans le péritoine d’une souris. Commencez à surveiller la densité des paraglobules et des globules rouges des souris trois jours après l’infection.

Choisissez une souris présentant un para de 0,1 à 1 % et dont les globules rouges infectés contiennent principalement des parasites uniques comme donneur pour la procédure de clonage. Prélever une quantité appropriée de sang dans le sang dilué de la queue de la souris dans une solution froide de sonnerie de veau, de sérum et de mammifère afin d’atteindre une concentration de 0,6 à un globule rouge infecté par 100 microlitres et stocker l’inoculum sur de la glace. Nettoyez le site d’injection sur la queue avec de l’éthanol par voie intraveineuse.

Injectez 100 microlitres de sang infecté dilué dans chacune des 100 souris. De cette manière, chaque souris individuelle devrait recevoir un ou aucun parasite. Dans une expérience réussie, 20 à 50 % des souris présenteront un para de 0,1 à 0,5 % au huitième jour.

Cinq à sept jours plus tard, dépister les souris pour détecter la présence de parasites au stade sanguin en examinant des frottis sanguins minces. La descendance, les parasites issus du croisement peuvent ensuite être génotypés par PCR de l’ADN, extraits d’échantillons de sang de queue à l’aide de marqueurs génétiques sur différents chromosomes tels que les microsatellites et les polymorphismes nucléotidiques simples. Les parasites dont les locus génétiques indépendants sont dérivés des deux clones parentaux sont des clones recombinants.

Le sang des animaux infectés par des parasites recombinants peut être cryoconservé pour une utilisation future. Dans une expérience réussie, cinq à 10 % du total des souris auront une descendance recombinante indépendante. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire un processus génétique dans le paludisme.

Parasite plus yoi moyen. Cette méthode peut également être applicable à d’autres espèces de parasites.