Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer les réponses induites par la lumière provenant de cellules ganglionnaires génétiquement marquées dans la rétine isolée de la souris. Cela est réalisé en premier lieu par la dissection de la rétine à partir de l'œil de la souris. La deuxième étape de la procédure consiste à traiter la rétine avec une enzyme afin d'éliminer le vitré restant.

La troisième étape de la procédure consiste à monter la cellule ganglionnaire de la rétine côté cellules ganglionnaires vers le haut dans la chambre d’enregistrement, à fixer la chambre sur la platine du microscope et à identifier les cellules ganglionnaires marquées génétiquement. La dernière étape de la procédure consiste à obtenir un enregistrement en configuration whole cell de la cellule ganglionnaire identifiée et à enregistrer les réponses induites par la lumière. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant les propriétés fonctionnelles d’un type défini de cellule ganglionnaire dans la rétine de la souris, et définir les signaux qu’elle transmet au cerveau par des enregistrements au patch-clamp sur une cellule unique.

Bonjour, je m'appelle Tiffany Schmidt et je suis étudiante diplômante en neurosciences dans le laboratoire du Dr. Paulo Ka Fuji à l'Université du Minnesota. Cette technique permet l'identification et l'enregistrement d'une population définie de cellules ganglionnaires marquées génétiquement, ainsi qu'une analyse morphologique ultérieure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la vision, telles que la manière dont les différents sous-types de cellules ganglionnaires traitent des caractéristiques clés des stimuli visuels, avant la réalisation de la chirurgie.

Pour retirer la rétine, la première étape consiste à préparer les huit solutions nécessaires à l'expérience. Les ingrédients de toutes les solutions utilisées dans cette expérience sont indiqués dans le texte accompagnant. Transférez 200 millilitres de la solution extracellulaire dans un bécher de 250 millilitres destiné au stockage de la rétine.

Placer la solution extracellulaire restante dans une ampoule à décanter pour la perfusion par gravité pendant l'enregistrement. Ces deux solutions doivent être maintenues saturées en 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone en permanence. Pour visualiser les dendrites pendant l'expérience, ajouter un traceur fluorescent tel que LOR 5 94 à la solution intracellulaire.

Si vous prévoyez de réaliser une immunohistochimie après l'enregistrement en cellule entière, ajoutez 0,3 % de neurobiotine à la solution intracellulaire. Une fois les solutions nécessaires préparées, euthanasiez une souris par asphyxie au dioxyde de carbone, énucléez le globe oculaire en insérant délicatement une pince courbée n°2 derrière l’œil et en soulevant le globe oculaire. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour retirer les muscles extraoculaires et sectionner le nerf optique.

Placer le globe oculaire dans une boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de solution extracellulaire. Retirer la cornée avec des ciseaux ophtalmiques et extraire le cristallin à l’aide d’une pince n°5. Utiliser la pince n°5 pour déchirer la sclérotique et sectionner le nerf optique restant au niveau de la jonction entre la rétine et la sclérotique.

Retirer délicatement la rétine du fond de l’œil en passant la pince dans l’espace situé entre la rétine et la sclérotique. Pour gagner du temps, effectuer chaque étape sur les deux rétines avant de passer à l’étape suivante. Une étape cruciale consiste à éliminer le vitré fixé à la rétine. Commencer par saisir à l’aide de la pince le vitré transparent situé au-dessus de la rétine.

Si le vitré est correctement retiré, vous verrez une petite substance gélatineuse transparente sur la pointe de la pince. Divisez chaque rétine en deux moitiés afin de maximiser la quantité de tissu utilisable et de faciliter le montage de la rétine dans la chambre d’enregistrement. Placez les rétines dans une solution extracellulaire oxygénée à température ambiante et minimisez l’exposition à la lumière en ne permettant qu’une lumière ambiante minimale, comme celle provenant des écrans d’ordinateur ; les rétines restent viables environ six heures.

Après la dissection, prélevez 500 microlitres de la solution extracellulaire dans la solution où les rétines supplémentaires sont en train de buller. Diluez-y un aliquot de la solution enzymatique de collagénase hyaluronidase.

Mettre la solution enzymatique dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et y transférer l'un des rétines disséqués. Faire tourner la boîte de Pétri pendant 15 minutes en perfusant doucement en continu une atmosphère de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone dans la solution. La solution enzymatique élimine tout vitré restant et permet un accès plus aisé à la couche des cellules ganglionnaires. Pour les rétines provenant d'animaux plus jeunes, qui contiennent moins de vitré, ou si des effets indésirables sont observés, la durée de la digestion peut être réduite à cinq minutes.

À l’aide d’une pipette plastique de transfert dont la pointe a été coupée, retirez la rétine du milieu contenant l’enzyme. Lavez abondamment la rétine dans la solution extracellulaire.

Transférez la rétine dans la chambre d’enregistrement. Avec la couche des photorécepteurs orientée vers le bas, aspirez tout liquide résiduel à l’aide d’une pipette ou d’un tissu, puis repliez les bords de la rétine afin d’aplatir le tissu. Veillez à ne toucher que les bords de la rétine et non la couche des cellules ganglionnaires.

Pour fixer la rétine, placez un anneau de platine avec une maille en nylon par-dessus la rétine, puis remplissez immédiatement la chambre avec la solution extracellulaire. Montez la chambre d'enregistrement sur la platine du microscope, puis fixez le tube destiné à la perfusion par gravité de la solution extracellulaire, le tube d'aspiration sous vide et le fil de masse. Réglez la gravité de manière à obtenir une goutte à une millilitre par minute ou plus rapidement.

Si le débit de perfusion est trop lent, le tissu ne sera pas suffisamment oxygéné et la transmission synaptique pourrait être perturbée. L'étape suivante consiste à préparer l'électrode pour l'enregistrement en configuration whole cell. Sélectionnez une pipette ayant une résistance comprise entre trois et cinq mégohms.

Remplir la pipette d’enregistrement avec un aliquot décongelé de solution intracellulaire et l’insérer dans le porte-pipette en utilisant une illumination infrarouge et des optiques de contraste interférentiel différentiel (DIC) sous un objectif 10 x. Visualiser la rétine et la pipette d’enregistrement. La lumière infrarouge sert à minimiser l’exposition de la rétine à la lumière visible et à réduire l’adaptation à la lumière ; passer à un objectif 40 x et amener l’électrode en vue juste au-dessus du tissu.

La lignée de souris utilisée dans cette étude exprime la EGFP dans ses cellules ganglionnaires, ce qui rend les cellules ganglionnaires visibles en fluorescence épi. La microscopie illumine la rétine en fluorescence épi à 480 nanomètres. Si la rétine est saine, les cellules ganglionnaires individuelles doivent être visibles.

Les rétines non saines présenteront des noyaux larges et granulés et doivent être écartées. Sélectionnez l'une des cellules ganglionnaires fluorescentes pour l'enregistrement et utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour marquer la cellule sélectionnée sur l'écran de l'ordinateur. Passez à l'optique infrarouge afin que le corps cellulaire de la cellule ganglionnaire sélectionnée soit visible.

Positionnez l'électrode d'enregistrement près de la cellule ganglionnaire ciblée. Nettoyez la zone recouvrant immédiatement la cellule en appliquant une pression positive douce sur l'électrode d'enregistrement. La pression est appliquée à l'aide d'une seringue en plastique de 12 cc reliée au porte-pipette par un tube en polyéthylène, lorsque l'amplificateur est à zéro.

Tout décalage de tension. Placer l'électrode sur la cellule ganglionnaire sélectionnée jusqu'à l'apparition d'un affaissement à la surface de la cellule. En mode de blocage de tension sur l'amplificateur, appliquer une impulsion de test et surveiller le courant traversant la pipette.

Appliquez une pression négative pour créer un scellement entre l'électrode et la cellule. Relâchez la pression négative lorsque le scellement commence à se former et attendez que le courant de maintien indique un scellement électrique gigohm entre la membrane cellulaire et la pipette. Appliquez de légers impulsions de pression négative jusqu'à l'apparition de transitoires capacitifs, signe que le mode d'enregistrement en configuration whole cell a été obtenu, puis cessez toute application de pression.

Si la résistance d'accès est supérieure à 30 mégohms, cela peut souvent être amélioré par des impulsions supplémentaires très douces de pression négative. Une fois le mode cellule entière obtenu, éteignez la lumière infrarouge et couvrez le microscope avec un tissu noir. Laissez la cellule s'adapter à l'obscurité pendant cinq minutes.

Après cinq minutes, le prélèvement est prêt pour l'enregistrement. En mode de blocage de courant, activez la stimulation lumineuse blanche en champ complet et enregistrez la réponse de la cellule ganglionnaire. Si la cellule ganglionnaire doit être stimulée plusieurs fois, il convient de laisser la rétine s'adapter à l'obscurité pendant la durée nécessaire entre chaque stimulation.

Le stimulus lumineux peut également être modifié à ce stade pour inclure des stimuli structurés ou chromatiques afin d'évaluer les propriétés de réponse des cellules ganglionnaires après l'enregistrement. Le traceur fluorescent présent dans la solution intracellulaire se sera diffusé vers les dendrites en passant de l'optique infrarouge DIC à la fluorescence épi. Le traceur peut être visualisé en fluorescence épi à 594 nanomètres, ce qui permet d'examiner les dendrites afin de déterminer si la cellule ganglionnaire est du type ON-OFF ou stratifiée. La neurobiotine ajoutée à la solution intracellulaire s'est diffusée dans la cellule ganglionnaire ; la prochaine étape consiste donc à préparer la rétine pour l'immunohistochimie.

Retirez doucement la pipette afin de minimiser la perturbation de la membrane cellulaire. Notez que si vous enregistrez et remplissez une seule cellule ganglionnaire rétinienne par préparation, vous pouvez ensuite établir des corrélations spécifiques entre la cellule ganglionnaire enregistrée et sa morphologie détaillée. Ensuite, placez la rétine dans la solution de paraformaldéhyde et fixez-la toute la nuit à quatre degrés Celsius après une fixation nocturne.

Rincez la rétine fixée dans du PBS en effectuant au moins six changements de solution de PBS sur une durée de deux heures ou plus. Après le rinçage, transférez la rétine dans une plaque contenant la solution de blocage, placez la plaque sur un agitateur et laissez-la reposer pendant deux heures. À température ambiante, remplacez la solution de blocage par la solution de détection strep, replacez la rétine sur l'agitateur et laissez incuber deux jours à quatre degrés Celsius.

Après deux jours, rincez la rétine dans du PBS en effectuant six rinçages de 20 minutes chacun afin de monter la rétine. Placez-la côté cellules ganglionnaires vers le haut sur une lame de verre en utilisant du Vector Shield. Recouvrez avec un milieu de montage, une lamelle de verre, puis scellez avec du vernis à ongles ; la cellule ganglionnaire marquée peut désormais être observée au microscope confocal.

Cette figure montre des cellules ganglionnaires rétiniennes positives pour la GFP visualisées en épi-illumination fluorescente à un grossissement de 40 fois à gauche et en illumination DIC à droite. Si la rétine est saine et que la dissection a réussi, les cellules ganglionnaires individuelles sont visibles en DIC à fort grossissement. Les rétines non saines présenteront de grands noyaux granuleux et doivent être écartées.

Cette figure montre le type de réponse lumineuse typique d'une cellule ganglionnaire rétinienne photosensible intrinsèquement stratifiée de type M deux. Selon le type de cellule ganglionnaire rétinienne marquée génétiquement dans une préparation donnée, les propriétés de réponse varieront. Si la réponse synaptique d'une cellule ganglionnaire donnée est intacte, la cellule doit répondre à l'allumage ou à l'extinction de la lumière par des potentiels d'action.

Et dans le cas d'une cellule ganglionnaire intrinsèquement photosensible, une dépolarisation soutenue ; cette image d'une cellule ganglionnaire remplie de neurobiotine montre la morphologie d'une cellule ganglionnaire rétinienne intrinsèquement photosensible typique de type M1, stratifiant en sous-couche externe. Après un enregistrement en configuration whole cell, l'immunohistochimie permet d'établir une corrélation entre la morphologie dendritique et la réponse électrophysiologique de la cellule ganglionnaire rétinienne. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'oxygéner correctement la chambre rétinienne et de perfuser rapidement le tissu afin de préserver les réponses synaptiques.

Merci d'avoir regardé cette démonstration.