Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer les réponses évoquées par la lumière à partir de cellules ganglionnaires génétiquement marquées dans la rétine isolée de souris. Ceci est accompli en disséquant d’abord la rétine de l’œil de la souris. La deuxième étape de la procédure consiste à traiter la rétine avec une enzyme pour enlever le vitré restant.

La troisième étape de la procédure consiste à monter la cellule ganglionnaire de la rétine vers le haut dans la chambre d’enregistrement, à monter la chambre sur la platine du microscope et à identifier les cellules ganglionnaires génétiquement marquées. La dernière étape de la procédure consiste à obtenir un enregistrement cellulaire entier de la cellule ganglionnaire identifiée et à enregistrer les réponses évoquées par la lumière. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les propriétés fonctionnelles d’une cellule ganglionnaire définie, un type dans la rétine de la souris et définissent les signaux qu’elle transmet au cerveau par le biais d’enregistrements de patch clamp de cellule unique.

Bonjour, je m’appelle Tiffany Schmidt et je suis étudiante diplômée en neurosciences dans le laboratoire du Dr Paulo Ka Fuji à l’Université du Minnesota. Cette technique permet l’identification et l’enregistrement d’une population de cellules ganglionnaires définie et génétiquement marquée, ainsi qu’une analyse morphologique ultérieure. Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine visuel, telles que la façon dont les différents sous-types de cellules ganglionnaires traitent les caractéristiques clés des stimuli visuels avant d’effectuer la chirurgie.

Pour enlever la rétine, la première tâche consiste à mélanger les huit solutions nécessaires à l’expérience. Les ingrédients de toutes les solutions utilisées dans cette expérience sont donnés dans le texte d’accompagnement. Transférez 200 millilitres de la solution extracellulaire dans un bécher de 250 millilitres pour le stockage de la rétine.

Placez la solution extracellulaire restante dans un entonnoir séparateur pour la profusion gravitaire pendant l’enregistrement. Ces deux solutions doivent être maintenues saturées de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone à tout moment. Pour visualiser les dendrites pendant l’expérience, ajoutez un traceur fluorescent tel que LOR 5 94 à la solution intracellulaire.

Si vous prévoyez de faire de l’immunohistochimie après l’enregistrement de la cellule entière, ajoutez 0,3 % de biotine neurologique à la solution intracellulaire. Une fois les solutions nécessaires préparées, euthanasiez une souris par asphyxie au dioxyde de carbone, nucléez le globe oculaire en insérant doucement une pince numéro deux inclinée derrière l’œil et en soulevant le globe oculaire. Utilisez des ciseaux ophtalmologiques pour nettoyer les muscles extraoculaires et couper le nerf optique.

Placez le globe oculaire dans une boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de solution extracellulaire. Coupez la cornée avec des ciseaux ophtalmologiques et retirez le cristallin à l’aide d’une pince numéro cinq. Utilisez la pince numéro cinq pour déchirer la sclérotique et sectionner le nerf optique restant à l’endroit où la rétine et la sclérotique se rencontrent.

Tirez doucement la rétine loin de l’œilleton en passant la pince dans l’espace entre la rétine et la sclère. Pour gagner du temps, faites chaque étape sur les deux rétines Avant de passer à l’étape suivante, une étape cruciale consiste à retirer le vitré attaché à la rétine. Commencez par utiliser une pince pour saisir le vitré transparent au-dessus de la rétine.

Si le vitré est retiré avec succès, vous verrez une petite substance gélatineuse claire sur le bout de la pince. Coupez chaque rétine en deux pour maximiser la quantité de tissu utilisable et faciliter le montage de la rétine dans la chambre d’enregistrement. Placez les rétines dans la solution extracellulaire oxygénée à température ambiante et minimisez l’exposition à la lumière en ne laissant qu’une lumière ambiante minimale, comme la lumière des écrans d’ordinateur, les rétines restent viables pendant environ six heures.

Après la dissection, prélever 500 microlitres de la solution extracellulaire de la solution dans laquelle les rétines supplémentaires bouillonnent. Diluez-y dedans. Une aliquote de la solution enzymatique de la collagénase hyaluronidase.

Mettez la solution enzymatique dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et transférez l’une des rétines disséquées dans le Petri. Faites pivoter la boîte de Pétri pendant 15 minutes tout le temps en fusionnant doucement 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone dans la solution. La solution enzymatique élimine tout vitré restant et permet un accès plus facile à la couche de cellules ganglionnaires Pour les rétines d’animaux plus jeunes avec moins de vitré, ou si des effets indésirables sont observés, la digestion peut être raccourcie à cinq minutes.

À l’aide d’une pipette de transfert en plastique dont l’embout est coupé, retirez la rétine du milieu contenant l’enzyme. Lavez abondamment la rétine dans une solution extracellulaire.

Transférez la rétine dans la chambre d’enregistrement. Avec la couche photoréceptrice vers le bas, évacuez tout liquide restant avec une pipette ou un mouchoir et déroulez les côtés de la rétine pour aplatir le tissu. Veiller à ne toucher que les bords de la rétine et non la couche de cellules ganglionnaires.

Pour ancrer la rétine, placez un anneau de platine avec un treillis en nylon sur la rétine, puis remplissez immédiatement la chambre avec une solution extracellulaire. Montez la chambre d’enregistrement sur la platine du microscope, puis fixez le tube pour la perfusion par gravité de la solution extracellulaire, le tube d’aspiration sous vide et le fil de terre. Ajustez la gravité de manière à ce qu’elle s’égoutte à un millilitre par minute ou plus.

Si le taux de perfusion est trop lent, le tissu ne sera pas suffisamment oxygéné et la signalisation synaptique peut être perturbée. L’étape suivante consiste à configurer l’électrode pour l’enregistrement de patchs de cellules entières. Sélectionnez une pipette avec une résistance de trois à cinq méga ohms.

Remplissez la pipette d’enregistrement avec une aliquote dégivrée de solution intracellulaire et insérez-la dans le porte-pipette à l’aide d’un éclairage infrarouge et d’une optique à contraste interférentiel différentiel ou DIC sous un objectif 10x. Visualisez la rétine et la pipette d’enregistrement. La lumière infrarouge est utilisée pour minimiser l’exposition de la rétine à la lumière visible et pour minimiser l’adaptation à la lumière, passez à un objectif 40 x et placez l’électrode en vue juste au-dessus du tissu.

La lignée de souris utilisée dans cette étude exprime EGFP dans ses cellules ganglionnaires, et donc les cellules ganglionnaires sont visibles sous épifluorescence. La microscopie illumine la rétine avec une épifluorescence à 480 nanomètres. Si la rétine est saine, les cellules ganglionnaires individuelles doivent être visibles.

Les rétines malsaines auront de gros noyaux granulés et doivent être jetées. Sélectionnez l’une des cellules ganglionnaires fluorescentes pour l’enregistrement et utilisez du ruban adhésif pour marquer la cellule sélectionnée sur l’écran de l’ordinateur. Passez à l’optique infrarouge afin que le corps de la cellule ganglionnaire sélectionnée soit visible.

Positionnez l’électrode d’enregistrement près de la cellule ganglionnaire ciblée. Nettoyez immédiatement la zone qui recouvre la cellule en appliquant une légère pression positive sur l’enregistrement. La pression de l’électrode est appliquée via une seringue en plastique de 12 cc reliée au porte-pipette par un tube en polyéthylène sur l’amplificateur zéro.

Tous les décalages de tension. Placez l’électrode sur la cellule ganglionnaire sélectionnée jusqu’à ce qu’une fossette apparaisse à la surface de la cellule. Avec l’amplificateur en mode pince de tension, appliquez une impulsion de test et surveillez le courant passant dans la pipette.

Appliquez une pression négative pour créer un joint entre l’électrode et la cellule. Relâchez la pression négative lorsque le joint commence à se former et attendez que le courant de maintien indique un giga joint électrique entre la membrane de la cellule et la pipette. Appliquez de douces impulsions de pression négative jusqu’à ce que des transitoires capacitifs apparaissent, indiquant que le mode d’enregistrement de la cellule entière a été obtenu, puis relâchez toute application de pression.

Si la résistance d’accès est supérieure à 30 mégaohms, elle peut souvent être améliorée par des impulsions supplémentaires très douces de pression négative. Une fois le mode cellule entière obtenu, éteignez la lumière infrarouge et couvrez le microscope avec un chiffon noir. Laissez la cellule s’adapter à l’obscurité pendant cinq minutes.

Au bout de cinq minutes, la préparation est prête pour l’enregistrement. En mode pince actuel, activez la stimulation par lumière blanche plein champ et enregistrez la réponse de la cellule ganglionnaire. Si la cellule ganglionnaire doit être stimulée plusieurs fois, la rétine doit être laissée s’adapter si nécessaire entre les stimulations.

Le stimulus lumineux peut également être modifié à ce stade pour inclure des stimuli à motifs ou chromatiques afin d’évaluer les propriétés de réponse des cellules ganglionnaires après l’enregistrement, le traceur fluorescent dans la solution intracellulaire se sera diffusé vers les dendrites en passant de l’épifluorescence et de l’optique infrarouge DIC. Le traceur peut être visualisé sous épifluorescence à 594 nanomètres, et vous pouvez examiner les dendrites pour déterminer si la cellule ganglionnaire est activée ou stratifiée. La neurobiotine qui a été ajoutée à la solution intracellulaire s’est diffusée dans la cellule ganglionnaire, et la prochaine étape consiste donc à préparer la rétine pour l’immunohistochimie.

Rétractez doucement la pipette afin de minimiser la perturbation de la membrane cellulaire. Notez que si vous enregistrez et remplissez une seule cellule ganglionnaire rétinienne par préparation, vous pouvez alors établir des corrélations spécifiques entre la cellule ganglionnaire enregistrée et sa morphologie détaillée. Ensuite, placez la rétine dans la solution d’aldéhyde Paraform et fixez-la pendant la nuit à quatre degrés Celsius après la fixation pendant la nuit.

Rincez la rétine fixe dans du PBS en effectuant au moins six changements de solution PBS sur une période de deux heures ou plus. Après le rinçage, transférez la rétine dans une assiette contenant une solution de blocage, placez la plaque sur un shaker et laissez-la reposer pendant deux heures. À température ambiante, remplacez la solution de blocage par la solution de preuve de streptocoque et remettez la rétine sur le shaker et laissez-la incuber pendant deux jours à quatre degrés Celsius.

Après deux jours, rincez la rétine dans du PBS en faisant six rinçages de 20 minutes chacun pour monter la rétine. Placez-le côté cellule ganglionnaire vers le haut sur une lame de verre à l’aide d’un bouclier vectoriel. En montant le couvercle du support avec un couvercle en verre, en glissant et en scellant avec du vernis à ongles, la cellule ganglionnaire étiquetée peut maintenant être examinée au microscope confocal.

Cette figure montre des cellules ganglionnaires rétiniennes positives à la GFP visualisées sous un éclairage fluorescent épi à un grossissement de 40 fois à gauche et sous un éclairage DIC à droite. Si la rétine est saine et que la dissection a réussi, les cellules ganglionnaires individuelles sont visibles sous CIVD à fort grossissement. Les rétines malsaines auront de gros noyaux granulés et doivent être jetées.

Cette figure montre le type de réponse à la lumière typique d’un M deux sur la stratification intrinsèquement photosensible des cellules ganglionnaires rétiniennes. Selon le type de cellule ganglionnaire rétinienne génétiquement marquée dans une préparation donnée, les propriétés de réponse diffèrent. Si la réponse synaptique d’une cellule ganglionnaire donnée est intacte, alors la cellule devrait répondre au début de la lumière ou compensée par des potentiels d’action.

Et dans le cas d’une cellule ganglionnaire intrinsèquement photosensible, une dépolarisation soutenue, cette figure d’une cellule ganglionnaire remplie de neurobiotine montre la morphologie d’une cellule ganglionnaire rétinienne typique M1 stratifiée, intrinsèquement photosensible. Après l’enregistrement de cellules entières, l’immunohistochimie permet une corrélation entre la morphologie dendritique et la réponse électrophysiologique des cellules ganglionnaires rétiniennes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de bien oxygéner la rétine et de perfuser rapidement le tissu afin de préserver les réponses synaptiques.

Merci d’avoir regardé cette démonstration.