Transplantation de progéniteurs neuronaux dérivés de cellules souches dans des tranches corticales humaines

Commencez par une culture adhérente de cellules progénitrices neuronales dérivées de cellules souches prêtes à se différencier en neurones corticaux.

Retirez le milieu, puis ajoutez une enzyme pour perturber la matrice extracellulaire et détacher les cellules.

Utilisez un inhibiteur pour neutraliser l’enzyme, puis ajoutez un milieu frais.

Transférez la suspension dans un tube, centrifugez-le et jetez le surnageant pour isoler les cellules.

Remettez les cellules en suspension dans une matrice de membrane basale pour faciliter la transplantation dans le tissu cérébral, puis chargez-les dans un tube capillaire froid.

Prenez une tranche corticale humaine sur un assemblage de transpuits contenant un milieu.

Retirez une partie du milieu, puis injectez des gouttelettes de la suspension cellulaire dans le tissu.

Incuber pour permettre à la matrice de se solidifier.

Ajoutez un milieu pour immerger le tissu, puis incubez pour permettre aux cellules progénitrices de se différencier en neurones, d’étendre leurs neurites et de former des synapses avec les neurones corticaux de l’hôte.

La tranche corticale est maintenant prête pour l’analyse.

Retirer le milieu de la fiole de culture cellulaire. Au septième jour de la différenciation, détachez les cellules GFP-lt-NES amorcées corticalement en ajoutant 500 microlitres de trypsine et incubez pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un volume égal d’inhibiteur de trypsine suivi de cinq millilitres de milieu DDM. Remettez les cellules en suspension, transférez doucement la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 300 G. Pendant ce temps, transférez la plaque contenant le tissu humain de l’incubateur vers la hotte et retirez deux millilitres de milieu du haut de l’insert. À la fin de la centrifugation, retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans une matrice de membrane basale froide et pure et transférez la suspension dans un tube plus petit.

Recueillir la suspension cellulaire dans un capillaire en verre froid relié à une tétine en caoutchouc pour l’aspiration. Injectez la suspension cellulaire sous forme de minuscules gouttes en poignardant la tranche de tissu semi-sec à divers endroits. Laissez le gel se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, transférez la plaque de l’incubateur vers la capuche et ajoutez soigneusement deux millilitres de milieu cortical humain adulte au sommet de l’insert pour immerger complètement le tissu.