Injection stéréotaxique de virus pour une modification génétique stable dans un modèle murin

Commencez avec une souris anesthésiée avec un crâne exposé dans un cadre stéréotaxique.

Abaissez le porte-seringue jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille s’aligne avec le bregma, un point de référence du crâne.

À l’aide des coordonnées stéréotaxiques prédéterminées, localisez la zone ventriculaire-sous-ventriculaire ou

V-SVZ, une niche neurogène contenant principalement des cellules souches neurales ou NSC, et marquez cette région.

Retirez la seringue et percez soigneusement un petit trou, évitant ainsi les lésions cérébrales.

Remplissez une seringue stérile de virus porteurs du transgène et placez l’aiguille sur la surface du cerveau.

Repositionnez la seringue et abaissez-la jusqu’à ce que l’embout touche la couche superficielle la plus interne du cerveau.

Pénétrez dans le cerveau pour atteindre le V-SVZ, injectez lentement le virus, maintenez brièvement, puis retirez la seringue.

Dans la V-SVZ, le virus pénètre dans les NSC par fusion membranaire. Son ARN inverse se transcrit en ADN.

Cet ADN s’intègre ensuite dans le génome des NSC, permettant une modification génétique stable des NSC.

Après l’anesthésie, une souris de six à huit semaines rase la zone entre ses oreilles. Ensuite, désinfectez la peau à l’aide d’un iodophore tel que la povidone iodée ou l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez l’animal en position couchée sur un cadre stéréotaxique.

Fixez soigneusement sa tête à l’aide des barres auriculaires et du support abdominal de l’appareil. Gardez la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius et appliquez un lubrifiant ophtalmique sur ses yeux.

Ensuite, faites une incision de 1 centimètre de long sur le cuir chevelu et rétractez doucement la peau pour exposer le crâne. Nettoyez soigneusement la surface de l’os à l’aide d’un applicateur stérile à embout de coton et retirez tout tissu restant. Après cela, montez la seringue stérilisée sur le dispositif stéréotaxique à l’aide du porte-seringue. Positionnez l’aiguille sur le bregma et assurez-vous que la position 0 de l’axe ventral dorsal est à la surface du crâne au niveau du bregma.

Maintenant, déplacez la seringue aux coordonnées désignées x et y, puis annotez les coordonnées de destination x, y et z sur l’échelle de Vernier comme site d’injection, et marquez l’os à l’aide d’un marqueur chirurgical.

L’échelle de Vernier est un outil de mesure précis, qui nous permet de déterminer les coordonnées stéréotaxiques de bregma avec une grande précision. Le 0 sur l’échelle principale marque les unités, et le nombre aligné sur l’échelle principale détermine les dixièmes de millimètre.

Ensuite, éloignez la seringue de la zone de travail. Percez soigneusement un trou sur le crâne sans endommager le cerveau.

La perceuse doit être utilisée horizontalement par rapport à la surface du crâne, et une surveillance continue des avancées doit être effectuée afin d’arrêter le forage une fois que la surface piale est exposée. N’endommagez pas le cerveau sous-jacent.

Ensuite, chargez la seringue avec une aiguille biseautée pointue de calibre 33 avec 1 microlitre de solution virale. Positionnez l’aiguille de la seringue à un angle de 90 degrés par rapport à la surface du cerveau. Ramenez la seringue vers le site d’injection et abaissez-la jusqu’à ce que l’extrémité touche la surface piale et pénètre dans le cerveau.

Pour minimiser les dommages au tissu cérébral dus à une pression excessive du fluide, libérez lentement la suspension virale. Après l’injection, attendez 5 à 10 minutes pour minimiser le reflux de la suspension virale avant de rétracter lentement la seringue.