Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la cinétique de l'exportation nucléaire des ARNm dans les cellules de mammifères. Cela est réalisé en micro-injectant d'abord des ARN ou de l'ADN dans les noyaux de cellules en culture issue de tissus de mammifères. Après la micro-injection, les échantillons sont fixés après diverses périodes d'incubation.

L'ARNm est ensuite coloré par hybridation in situ fluorescente ou FISH. La dernière étape de la procédure consiste à imager les cellules et à quantifier la quantité de fluorescence dans le cytoplasme et le noyau. En fin de compte, la vitesse d'exportation de l'ARNm peut être mesurée à l'aide d'une combinaison de microinjection et de microscopie fluorescente.

Bonjour, je suis SRG AV du laboratoire d'Alex Palazzo, du Département de biochimie de l'Université de Toronto. Je suis Stefan Toski, également du laboratoire Palazzo. Je suis Amy du laboratoire Palazzo et je suis Khi Maha David du laboratoire Palazzo.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'introduire un ARNm dans les noyaux de cellules en culture tissulaire de mammifères par microinjection. Nous allons également démontrer comment marquer l'ARNm par hybridation in situ fluorescente. Nous utilisons ces procédures dans notre laboratoire pour étudier la cinétique de l'exportation nucléaire de l'ARNm dans les cellules de mammifères.

Commençons. Avant la microinjection, préparez l'ADN plasmidique à une concentration comprise entre 50 et 200 microgrammes par millilitre dans le tampon d'injection. Ajoutez ensuite de l'Orange d'Or 488 ou OG conjugué au dextran de 70 kilodaltons au mélange afin de permettre l'identification des cellules injectées.

Le dextran conjugué à l'OG permettra de déterminer la quantité de fluide injectée dans le noyau et celle ayant fui dans le cytoplasme. Centrifuger les échantillons à 13 000 G et à quatre degrés Celsius pendant au moins 20 minutes afin de former un culot avec toute matière particulée susceptible d'obstruer l'extrémité de l'aiguille. Choisir la lignée cellulaire de mammifère à microinjecter selon les critères décrits dans le protocole écrit concernant le coût.

Sept cellules sont utilisées pour cette graine de démonstration. Les cellules sont placées sur des lamelles traitées à l'acide dans des boîtes de Pétri de 30 millimètres au moins 24 heures avant la microinjection. Idéalement, la monocouche cellulaire doit être approximativement de 70 à 90 % confluente au moment de l'injection afin de permettre une identification facile des cellules injectées ; la monocouche cellulaire est blessée avant l'injection à l'aide d'une pointe de pipette plastique de 200 microlitres.

Gravez une croix sur la lame et laissez les cellules se rétablir dans l’incubateur de culture tissulaire pendant au moins 15 minutes avant l’injection. Pour la microinjection, utilisez un microscope inversé placé sur une table antivibratoire afin de minimiser les vibrations pouvant perturber le processus de microinjection. À l’aide d’une pipette équipée d’une pointe einor gel loader, prélève environ un microlitre depuis le sommet de l’échantillon centrifugé pour éviter de perturber le culot.

Insérez la pointe de la pipette dans l'extrémité arrière d'une aiguille de microinjection préfabriquée et expulsez le liquide. Le liquide sera aspiré dans la pointe de l'aiguille par capillarité. Un ménisque près de la pointe doit être visible dans un délai de cinq à trente secondes.

Insérez l'aiguille remplie de liquide dans le support et fixez-la au micromanipulateur. Sous un angle de 45 degrés, visualisez l'aiguille à l'aide de l'objectif 10 x et positionnez-la au centre du champ de vision, près du plan focal. À l’aide des boutons grossiers du micromanipulateur, le support est relié par un tube à une seringue en verre, utilisée pour générer la pression nécessaire à l’éjection du liquide par l’extrémité de l’aiguille.

Pour maintenir une pression constante, fixez la seringue sur une pince de tuyau. À l’aide de deux bouchons en caoutchouc et de deux pinces métalliques, soulevez l’aiguille de quelques millimètres afin d’éviter qu’elle ne soit endommagée lors des étapes suivantes, puis reculez le microscope. Colonne, augmentez la pression en enfonçant le piston de la seringue.

De 0,5 à deux centimètres cubes. Placez une boîte de Pétri contenant un lamelle avec une monocouche blessée. Sur la platine d'observation, reculez le microscope.

Relever le pilier en position verticale afin d'aligner le condenseur avec l'aiguille pour pénétrer dans le liquide. Cette manipulation doit être effectuée soigneusement pour éviter que l'aiguille ne se brise sur la lamelle. À l'aide de l'objectif 10 x, identifier le centre de la croix enroulée et positionner l'aiguille au-dessus des cellules à injecter.

Augmentez le grossissement en passant à l'objectif 40 x. Abaissez ensuite l'aiguille et centrez-la à l'aide des boutons de réglage fin du joystick. Commencez l'injection dans un coin de la croix de la plaie en abaissant l'aiguille jusqu'au contact avec le noyau.

Une fois injectée, une cellule présente un changement notable de luminosité de phase. Poursuivre le long d'un bord du croisement de la plaie. Pour une identification facile des cellules injectées lors de la visualisation, il est essentiel que la pression d'injection soit correctement ajustée pour chaque micropipette.

La pression doit être suffisamment élevée pour percer les membranes plasmique et nucléaire, mais pas assez forte pour tuer les cellules. Micro-injecter les cellules le long du bord de la plaie pendant une durée fixe. Avec de la pratique, plusieurs centaines de cellules peuvent être injectées durant cet intervalle.

Si l'ADN plasmatique est injecté, incuber les cellules micro-injectées à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture tissulaire pendant 20 minutes avant la fixation, puis arrêter la transcription. Traiter les cellules avec un microgramme par millilitre d'alpha-amanitine dissous dans le milieu de croissance. Cette concentration inhibe efficacement la transcription à partir des plasmides micro-injectés.

Remettez les cellules dans l'incubateur et laissez-les exporter l'ARNm nouvellement synthétisé. Une seule aiguille peut être réutilisée pour injecter plusieurs lamelles. Toutefois, l'aiguille doit être remplacée lorsque le type d'ADN ou d'ARN micro-injecté change.

En outre, une fois que l'aiguille est retirée du stylet, elle doit être éliminée afin d'obtenir une mesure précise de la cinétique d'exportation nucléaire de l'ARNm. Des échantillons distincts doivent être fixés à zéro minute, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes et 120 minutes. Après le traitement par alpha manin au moment approprié, aspirez le milieu de croissance et lavez les cellules deux fois dans deux millilitres de solution PBS.

Il est important de maintenir l'humidité des lamelles en minimisant le temps pendant lequel elles ne sont pas immergées dans un liquide. Fixez les cellules en ajoutant deux millilitres d'aldéhyde 4 % dans du PBS et incubez les cellules pendant au moins 15 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les échantillons fixés deux fois supplémentaires, perméabilisez les cellules avec deux millilitres de Triton X-100 0,1 % dans du PBS, puis incubez à nouveau les cellules pendant au moins 15 minutes à température ambiante.

Enfin, laver les échantillons deux fois supplémentaires pour les préparer à l'hybridation. Laver les cellules deux fois avec un tampon de lavage constitué d'une solution XSSC 1x contenant de 25 à 60 % de formamide. Préparer ensuite la chambre de coloration pour l'hybridation en recouvrant le fond d'une boîte de Pétri de 150 millimètres d'eau et en plaçant un morceau de paraforme sur la surface.

Retirer l'eau en retournant la boîte, permettant ainsi au parafforme d'adhérer au fond de la boîte. Retirer manuellement toutes les bulles d'air pour chaque lamelle à colorer. Déposer au pipetage des gouttes de 100 microlitres de la solution d'hybridation sur le parafforme.

Remarquez que la quantité de formage doit être optimisée pour le poisson pro particulier utilisé à l'aide de pinces. Retirez une lame couvre-objet avec les cellules fixées de la boîte de Pétri de 30 millimètres. À l'aide de papier filtre Watman, séchez la face arrière de la lame couvre-objet et absorbez l'excès de tampon de la face avant sans dessécher les cellules.

Placez ensuite la lame couvre-objet face contre le bas dans la solution contenant le poisson. Répétez ce processus pour chaque lame couvre-objet. Après avoir remis le couvercle sur la chambre de coloration, incubez les échantillons pendant cinq à 18 heures à 37 degrés Celsius.

Préparez plusieurs chambres de lavage de la même manière que la chambre de coloration a été préparée : pour chaque lamelle, ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans la paraforme de la chambre de lavage. Après l'incubation, retirez les lamelles de la chambre de coloration en pipetant un millilitre de tampon de lavage. À côté de la lamelle, le liquide doit être aspiré sous chaque échantillon par action capillaire.

Ensuite, retirez les lamelles à l’aide de pinces et placez chacune sur une goutte de tampon de lavage incubée à température ambiante pendant cinq minutes. Lavez chaque lamelle deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages. Pour chaque lamelle, ajoutez 10 à 30 microlitres de solution de montage contenant du DAPI sur une lame préalablement lavée à l’aide d’une pipette. Chaque lame peut accueillir deux lamelles à l’aide de pinces et de papier filtre Watman.

Séchez l'arrière des lamelles et absorbez le liquide excédentaire à l'avant de la lamelle sans dessécher les échantillons. Placez chaque lamelle, côté face vers le bas, sur une goutte de solution de montage. Les échantillons montés peuvent être conservés à quatre degrés Celsius.

Ici, les effets de l'alpha-mantin sur la transcription de l'ADN plasmidique injecté ont été observés dans des cellules de fibroblastes NIH 3T3, prétraitées avec différentes concentrations d'alpha-mantin. Ces cellules ont été injectées avec le plasmide TFL s delta I, de l'ADN plasmidique et du dextran marqué au OG de 70 kilodaltons. Chaque ligne correspond à un seul champ d'observation, image pour le dextran OG de 70 kilodaltons et l'ARNm T uts delta I.

Il est évident que de fortes concentrations du médicament ont complètement inhibé la production du transcrit T UTS delta I, ce qui n'a pas été observé à de plus faibles concentrations. Représenté ici est un cours temporel du coût de l'exportation nucléaire des ARNm. Sept cellules ont été injectées avec de l'ADN plasmidique T UTS delta i et du dextran marqué au vert d'OG de 70 kilodaltons.

30 minutes après l'injection des cellules, celles-ci ont été traitées avec de l'alpha-mantinine et incubées à 37 degrés Celsius pendant 0 minute, 60 minutes et 120 minutes. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées avec une sonde dirigée contre l'ARNm de T UTS delta I, ainsi qu'avec des anticorps dirigés contre le marqueur du RE, la trappe alpha. Chaque ligne correspond à un seul champ de cellules.

Pour des informations sur la quantification de l'exportation d'ARNm, veuillez consulter le texte en ligne ici. Le point temporel de 120 minutes a été agrandi afin de démontrer la colocalisation de l'ARNm TFS delta I dans le réticulum endoplasmique ; un recouvrement de l'ARNm T UTS delta I en vert et de la TRAP alpha en rouge est présenté. Des informations sur la manière de réaliser une coloration simultanée d'ARNm avec des protéines sont disponibles dans le texte en ligne.

Nous venons de vous montrer comment mesurer la cinétique d'exportation nucléaire des ARNm par microinjection. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'une microinjection réussie nécessite une préparation adéquate. Les étapes clés telles que la préparation de l'ADN et de l'ARN, la préparation des échantillons, le tirage des micropipettes, l'alignement du matériel optique et la résolution des problèmes liés à la microinjection sont décrites dans notre protocole écrit.

Lors de l'imagerie et de l'analyse d'ARNm microinjectés, il est important que la quantification soit limitée aux cellules ayant reçu plus de 90 % du liquide injecté dans le noyau. Une injection nucléaire réussie peut être évaluée en visualisant la distribution du dextran vert organique dans le noyau et le cytoplasme. Veuillez consulter notre protocole en ligne pour plus d'informations sur la conception des sondes pour poisson et sur l'utilisation d'un logiciel d'analyse d'images pour étudier la distribution de l'ARNm dans le cytoplasme et le noyau.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.