Name: Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Découvrez la micro-injection et l'hybridation in situ fluorescente pour analyser la cinétique d'exportation nucléaire de l'ARNm dans les cellules de mammifères. Cette méthode permet de quantifier précisément le transport de l'ARNm vers le cytoplasme.

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Nous tenons à remercier E. Gomes conseils utiles et A. Wilde pour nous permettre d&#39;utiliser divers équipements. Ce travail a été soutenu par une subvention à l&#39;AFP par l&#39;Institut canadien de recherche en santé (FRN 102725).

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
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<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
</ol>

La microinjection est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier un certain nombre de différents processus cellulaires. Contrairement à la transfection de cellules conventionnelles, la microinjection permet au chercheur d&#39;introduire efficacement des acides nucléiques dans les noyaux cellulaires dans un délai très étroites. En conséquence, on peut effectuer des analyses cinétiques tels que la détermination des taux d&#39;ARNm de l&#39;exportation, la localisation d&#39;ARNm et la synthèse des protéines. En outre, depuis le calendrier de l&#39;expérience est relativement brève, on peut exposer des cellules à des composés toxiques dans les intervalles de temps courts, sans encourir des effets pléiotropes. Par ailleurs, les composés inhibiteurs ou stimulants tels que les protéines dominante négative, peut être co-injectées avec les acides nucléiques. Enfin, microinjections d&#39;éviter l&#39;obligation de réactifs de transfection, qui sont souvent toxiques pour les cellules et peuvent perturber les fonctions cellulaires différents. ARNm vs injections d&#39;ADN plasmidique Le choix de l&#39;acide nucléique à injecter dépendra d&#39;un certain nombre de considérations. Après l&#39;injection d&#39;ADN plasmidique, l&#39;ARN polymérase II non seulement synthétise l&#39;ARNm, mais recrute aussi des facteurs protéiques de la transcription naissante 12,13. Puisque ces facteurs régissent le traitement des événements tels que l&#39;ARNm, l&#39;exportation nucléaire et de la localisation cytoplasmique, les injections d&#39;ADN plasmidique peut être utilisé pour évaluer la façon dont la transcription est couplée à des processus en aval. Bien que la transcription peut être couplé à l&#39;exportation nucléaire 14, nous avons constaté que l&#39;ARNm injecté est exportée légèrement plus rapide que dans les ARNm transcrit in vivo 6. Les raisons de ce ne sont pas claires pour le moment, mais ce résultat peut suggérer que l&#39;ARNm nouvellement synthétisés se dégage de l&#39;ARN polymérase II, il peut être immobilisé dans des complexes qui retardent l&#39;exportation nucléaire. Il ya certains avantages à des injections d&#39;ARNm. Premièrement, le chercheur n&#39;a pas à utiliser des inhibiteurs de l&#39;ARN polymérase, qui pourrait affecter la façon dont les cellules réguler le métabolisme global de l&#39;ARN. Deuxièmement, l&#39;ARN peut être modifiée in vitro avant l&#39;injection. Par exemple, les ARNm peuvent être synthétisés avec divers analogues de bouchon 5 &#39;ou de poly (A) des longueurs de queue, afin d&#39;évaluer comment ces caractéristiques affectent les exportations nucléaires 6. Troisièmement, le montant exact de l&#39;ARN qui est injecté peut être grossièrement estimé. En suivant le protocole décrit ci-dessus, nous estimons qu&#39;environ 20.000 à 50.000 molécules sont injectées dans chaque noyau, qui est relativement faible comparé au nombre total de transcriptions dans une cellule de mammifère typique (400.000 à 850.000 molécules) 15. L&#39;inconvénient majeur avec des injections d&#39;ARNm est que pendant la microinjection, une fuite du fluide d&#39;injection dans le cytoplasme est inévitable. Depuis ARNm injecté directement dans le cytoplasme est stable sur de longues périodes (A. Palazzo, observation non publiée), des précautions supplémentaires doivent être prises pour sélectionner les cellules sont quantifiées. Généralement, nous analysons les cellules qui ont reçu&gt; 90% de l&#39;injection de fluide dans le noyau, tel qu&#39;évalué par la distribution de l&#39;OG-dextran.

<table><tbody><tr><td>Tampon d'injection</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl et 10 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>Dextran Oregon Green 488-70 kD</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>Un stock à 10 mg/ml dans le tampon d'injection peut être conservé longtemps à -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tubes capillaires en borosilicate</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de chargement pour aiguilles d'injection</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Seringue pour injection</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>Tampon PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7,4</td></tr><tr><td>Tampon SSC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM citrate de sodium, pH 7,4</td></tr><tr><td>Parafomaldehyde à 4 %</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>Un stock de parafomaldehyde à 37 % est dilué dans le PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100 à 0,1 % (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>Un stock de Triton X-100 à 10 % est dilué dans le PBS</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextrane</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ARNt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Complexe ribosidique de vanadyle (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Table anti-vibrations</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanitine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de micropipettes Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Gras à vide</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>ARN polymérase T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymérase</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d'hybridation</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 mg/ml de sulfate de dextrane, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM citrate de sodium, 0,5 mg/ml d’&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ARNt, 60 % de formamide</td></tr></tbody></table>

analyse de la cinétique arnm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Chez les eucaryotes, l&#39;ARN messager (ARNm) est transcrit dans le noyau et doivent être exportés dans le cytoplasme d&#39;accéder à la machinerie de traduction. Bien que les exportations nucléaires de l&#39;ARNm a été largement étudié dans des ovocytes de Xénope 1 et les organismes génétiquement traitables comme la levure et la drosophile deux lignée dérivée de cellules S2 3, peu d&#39;études avaient été menées dans les cellules de mammifères. De plus la cinétique de l&#39;exportation d&#39;ARNm dans les cellules somatiques de mammifères ne pouvaient être déduites indirectement à 4,5. Afin de mesurer la cinétique de l&#39;exportation nucléaire de l&#39;ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères, nous avons développé un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé avec d&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH). Ces tests ont été utilisés pour démontrer que des cellules de mammifères, la majorité des ARNm sont exportés de manière épissage dépendants 6,7, ou de manière qui exige des séquences spécifiques d&#39;ARN tels que la région séquence signal de codage (SSCR) 6. Dans cet essai, les cellules sont microinjectés soit in vitro avec des ARNm synthétisés ou ADN plasmidique contenant le gène d&#39;intérêt. Les cellules sont incubées pendant microinjectés divers moments alors fixé et la localisation sous-cellulaire des ARN est évaluée en utilisant FISH. Contrairement à la transfection, où la transcription a lieu plusieurs heures après l&#39;ajout d&#39;acides nucléiques, la microinjection d&#39;ADN ou d&#39;ARNm permet l&#39;expression rapide et permet de générer des données précises cinétique.

Nous décrivons ici un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé à fluorescence<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt; afin de mesurer avec précision la cinétique de l&#39;exportation nucléaire de l&#39;ARNm dans les cellules somatiques de mammifères.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

Chez les eucaryotes, l'ARN messager (ARNm) est transcrit dans le noyau et doit être exporté vers le cytoplasme pour accéder à la machinerie de traduction. Bien que...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la cinétique de l'exportation nucléaire des ARNm dans les cellules de mammifères. Cela est réalisé en microinjectant d'abord des ARN ou de l'ADN dans les noyaux de cellules en culture issue de tissus de mammifères. Après la microinjection, les échantillons sont fixés à la suite de différentes durées d'incubation.L'ARNm est ensuite marqué par hybridation in situ fluorescente, ou FISH. La dernière étape de la procédure consiste à imager les cellules et à quantifier la quantité de fluorescence dans le cytoplasme et le noyau. En fin de compte, la vitesse d'exportation de l'ARNm peut être mesurée au moyen d'une combinaison de microinjection et de microscopie fluorescente.Bonjour, je suis SRG AV du laboratoire d'Alex Palazzo au Département de biochimie de l'Université de Toronto. Je suis Stefan Toski, également du laboratoire Palazzo. Je suis Amy du laboratoire Palazzo et je suis Khi Maha David du laboratoire Palazzo.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'introduire de l'ARNm dans les noyaux de cellules en culture tissulaire de mammifères par microinjection. Nous allons également démontrer comment colorer l'ARNm par hybridation in situ en fluorescence. Nous utilisons ces procédures dans notre laboratoire pour étudier la cinétique de l'exportation nucléaire de l'ARNm dans les cellules de mammifères.Commençons. Avant la microinjection, diluez l'ADN plasmidique préalablement préparé à une concentration comprise entre 50 et 200 microgrammes par millilitre dans le tampon d'injection. Ensuite, ajoutez de l'Orange Verte 488 ou OG conjugué au dextran de 70 kilodaltons au mélange afin de permettre l'identification des cellules injectées.Le dextran conjugué à l'OG permettra de déterminer la quantité de fluide injectée dans le noyau et celle ayant fui dans le cytoplasme. Centrifuger les échantillons à 13 000 G et à quatre degrés Celsius pendant au moins 20 minutes afin de former un culot avec toute matière particulée susceptible d'obstruer l'extrémité de l'aiguille. Choisir la lignée cellulaire de mammifère à microinjecter selon les critères décrits dans le protocole écrit concernant le coût.Sept cellules sont utilisées pour cette graine de démonstration. Les cellules sont placées sur des lamelles traitées à l'acide dans des boîtes de Pétri de 30 millimètres au moins 24 heures avant la microinjection. Idéalement, la monocouche cellulaire doit être approximativement de 70 à 90 % confluente au moment de l'injection afin de permettre une identification facile des cellules injectées ; la monocouche cellulaire est blessée avant l'injection à l'aide d'une pipette en plastique de 200 microlitres.Gravez une croix sur la lame et laissez les cellules se rétablir dans l’incubateur de culture tissulaire pendant au moins 15 minutes avant l’injection. Pour la microinjection, utilisez un microscope inversé installé sur une table antivibratoire afin de minimiser les vibrations pouvant perturber le processus de microinjection. À l’aide d’une pipette équipée d’une pointe einor gel loader, prélève environ un microlitre depuis le sommet de l’échantillon centrifugé pour éviter de perturber le culot.Insérez la pointe de la pipette à l'extrémité arrière d'une aiguille de microinjection préfabriquée et éjectez le liquide. Le liquide sera aspiré dans la pointe de l'aiguille par action capillaire. Un ménisque près de la pointe doit être visible dans un délai de cinq à trente secondes.Placer l'aiguille remplie de liquide dans le porte-aiguille et la fixer au micromanipulateur. Sous un angle de 45 degrés, visualiser l'aiguille à l'aide de l'objectif 10 x et la positionner au centre du champ de vision, près du plan focal. À l’aide des boutons grossiers du micromanipulateur, le porte-aiguille est relié par un tube à une seringue en verre, utilisée pour générer la pression nécessaire à l’éjection du liquide par l’extrémité de l’aiguille.Pour maintenir une pression constante, fixez la seringue sur une pince de tube. À l’aide de deux bouchons en caoutchouc et de deux pinces métalliques, soulevez l’aiguille de quelques millimètres afin d’éviter qu’elle ne soit endommagée lors des étapes suivantes, puis reculez le microscope. Colonne, augmentez la pression en appuyant sur le piston de la seringue.De 0,5 à deux centimètres cubes. Placer une boîte de Pétri contenant un lamelle avec une monocouche blessée. Sur la platine d'observation, reculer le microscope.Relever le pilier en position verticale afin d'aligner le condenseur avec l'aiguille pour pénétrer dans le liquide. Cette opération doit être effectuée avec précaution afin d'éviter que l'aiguille ne se brise sur la lamelle. À l'aide de l'objectif 10 x, identifier le centre de la croix enroulée et positionner l'aiguille au-dessus des cellules à injecter.Augmentez le grossissement en passant à l'objectif 40 x. Abaissez ensuite l'aiguille et centrez-la à l'aide des boutons de réglage fin du joystick. Commencez l'injection dans un coin de la croix de la plaie en abaissant l'aiguille jusqu'au contact avec le noyau.Une fois injectée, une cellule présente un changement notable de luminosité en contraste de phase. Poursuivez le long d'un bord du travers de la plaie. Pour une identification facile des cellules injectées lors de la visualisation, il est essentiel que la pression d'injection soit correctement ajustée pour chaque micropipette.La pression doit être suffisamment élevée pour percer les membranes plasmique et nucléaire, mais pas assez forte pour tuer les cellules. Micro-injecter les cellules le long du bord de la plaie pendant une durée fixe. Avec de la pratique, plusieurs centaines de cellules peuvent être injectées durant cet intervalle.Si l'ADN plasmatique est injecté, incuber les cellules microinjectées à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture tissulaire pendant 20 minutes avant la fixation, puis arrêter la transcription. Traiter les cellules avec un microgramme par millilitre d'alpha-amanitine dissous dans le milieu de croissance. Cette concentration inhibe efficacement la transcription à partir des plasmides microinjectés.Remettez les cellules dans l'incubateur et laissez-les exporter l'ARNm nouvellement synthétisé. Une seule aiguille peut être réutilisée pour injecter plusieurs lamelles. Toutefois, l'aiguille doit être remplacée lorsque le type d'ADN ou d'ARN micro-injecté change.En outre, une fois que l'aiguille est retirée du stylet, elle doit être éliminée afin d'obtenir une mesure précise de la cinétique d'exportation nucléaire de l'ARNm. Des échantillons distincts doivent être fixés à zéro minute, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes et 120 minutes. Après le traitement par alpha manin au moment approprié, aspirez le milieu de croissance et lavez les cellules deux fois dans deux millilitres de solution PBS.Il est important de maintenir l'humidité des lamelles en minimisant le temps pendant lequel elles ne sont pas immergées dans un liquide. Fixez les cellules en ajoutant deux millilitres d'aldéhyde 4 % dans du PBS et incubez les cellules pendant au moins 15 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les échantillons fixés deux fois supplémentaires, perméabilisez les cellules avec deux millilitres de Triton X-100 0,1 % dans du PBS, puis incubez à nouveau les cellules pendant au moins 15 minutes à température ambiante.Enfin, laver les échantillons deux fois supplémentaires pour les préparer à l'hybridation. Laver les cellules deux fois avec un tampon de lavage constitué d'une solution XSSC 1× contenant de 25 à 60 % de formamide. Préparer ensuite la chambre de coloration pour l'hybridation en recouvrant le fond d'une boîte de Pétri de 150 millimètres d'eau et en plaçant un morceau de paraforme sur la surface.Retirer l'eau en retournant la boîte, permettant ainsi au parafforme d'adhérer au fond de la boîte. Retirer manuellement les bulles d'air pour chaque lamelle à colorer. Déposer à l'aide d'une pipette des gouttes de 100 microlitres de la solution d'hybridation sur le parafforme.Remarquez que la quantité de formage doit être optimisée pour le poisson pro particulier utilisé à l'aide de pinces. Retirez une lame couvre-objet avec les cellules fixées de la boîte de Pétri de 30 millimètres. À l'aide de papier filtre Watman, séchez la face arrière de la lame couvre-objet et absorbez l'excès de tampon de la face avant sans dessécher les cellules.Placez ensuite la lame couvre-objet face contre le bas dans la solution de poisson. Répétez ce processus pour chaque lame couvre-objet. Après avoir remis le couvercle des chambres de coloration en place, incubez les échantillons pendant cinq à 18 heures à 37 degrés Celsius.Préparez plusieurs chambres de lavage de la même manière que la chambre de coloration a été préparée : pour chaque lamelle, ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans la paraforme de la chambre de lavage. Après l'incubation, retirez les lamelles de la chambre de coloration en pipetant un millilitre de tampon de lavage. À côté de chaque lamelle, le liquide doit être aspiré sous chaque échantillon par action capillaire.Ensuite, retirez les lamelles à l’aide de pinces et placez chacune sur une goutte de tampon de lavage incubée à température ambiante pendant cinq minutes. Lavez chaque lamelle deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages. Pour chaque lamelle, ajoutez 10 à 30 microlitres de solution de montage avec dappy sur une lame préalablement lavée à l’aide d’une pipette. Chaque lame peut accueillir deux lamelles en utilisant des pinces et du papier filtre Watman.Séchez l'arrière des lamelles et retirez par capillarité l'excès de liquide du côté avant de la lamelle sans dessécher les échantillons. Placez chaque lamelle par son côté couvert sur une goutte de solution de montage. Les échantillons montés peuvent être conservés à quatre degrés Celsius.Ici, les effets de l'alpha-mantin sur la transcription de l'ADN plasmidique injecté ont été montrés dans des cellules de fibroblastes NIH 3T3, prétraitées avec différentes concentrations d'alpha-mantin. Ces cellules ont été injectées avec le plasmide TFL s delta i, de l'ADN plasmidique et du dextran conjugué à l'OG de 70 kilodaltons. Chaque ligne correspond à un champ unique d'observation imagé pour le dextran OG de 70 kilodaltons et l'ARNm T uts delta I.Il est évident que de fortes concentrations du médicament ont complètement inhibé la production du transcrit T UTS delta I, ce qui n'a pas été observé à de plus faibles concentrations. Représenté ici est un cours temporel du coût de l'exportation nucléaire des ARNm. Sept cellules ont été injectées avec de l'ADN plasmidique T UTS delta i et du dextran conjugué OG de 70 kilodaltons.30 minutes après l'injection des cellules, celles-ci ont été traitées avec de l'alpha-mantinine et incubées à 37 degrés Celsius pendant zéro minute, 60 minutes et 120 minutes. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées avec une sonde dirigée contre l'ARNm de T UTS delta I, ainsi qu'avec des anticorps dirigés contre le marqueur du RE, trap alpha. Chaque ligne correspond à un seul champ de cellules.Pour des informations sur la quantification de l'exportation d'ARNm, veuillez consulter le texte en ligne ici. Le point temporel de 120 minutes a été agrandi afin de démontrer la colocalisation de l'ARNm TFS delta I dans le réticulum endoplasmique ; un recouvrement de l'ARNm T UTS delta I en vert et de la TRAP alpha en rouge est présenté. Des informations sur la manière de réaliser une coloration simultanée des ARNm avec des protéines sont disponibles dans le texte en ligne.Nous venons de vous montrer comment mesurer la cinétique d'exportation nucléaire des ARNm par microinjection. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'une microinjection réussie nécessite une préparation adéquate. Les étapes clés telles que la préparation de l'ADN et de l'ARN, la préparation des échantillons, le tirage des micropipettes, l'alignement du matériel optique et la résolution des problèmes liés à la microinjection sont décrites dans notre protocole écrit.Lors de l'imagerie et de l'analyse d'ARNm micro-injecté, il est important que la quantification soit limitée aux cellules ayant reçu plus de 90 % du liquide injecté dans le noyau. Une injection nucléaire réussie peut être évaluée en visualisant la distribution du dextran vert organ dans le noyau et le cytoplasme. Veuillez consulter notre protocole en ligne pour plus d'informations sur la conception de sondes pour poisson et sur l'utilisation d'un logiciel d'analyse d'image afin d'analyser la distribution de l'ARNm dans le cytoplasme et dans le noyau.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Injection directe intranucléaire d'ADNc est une technique de transfection efficaces pour les cellules post-mitotiques. Cette méthode fournit des niveaux élevés d'expression de protéines hétérologues dans un ou plusieurs des constructions d'ADNc et la fonction des protéines permet d'être étudiée dans un environnement physiologiquement pertinents avec une variété de dosages seule cellule.

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Un protocole pour la préparation de solides, des extraits HeLa nucléaires à petite échelle est décrite. Ce protocole est valable pour les essais qui exigent l'utilisation de petites populations de cellules, telles que les cellules traitées avec des médicaments ou ARNi. La méthode devrait être applicable à une grande variété de tests d'expression génique et d'autres types cellulaires, y compris les cellules du patient.

Les petits extraits nucléaires pour les dosages fonctionnels de l&#39;expression génétique Machineries

En raison de leur grande taille et de leur organisation relativement simple, les cellules nourricières de drosophile sont parfaitement adaptées aux études d’imagerie de cellules vivantes. Cette vidéo décrit une méthode de micro-injection pour l’administration de composés exogènes dans les cellules, et le protocole présenté démontre la procédure avec des sondes oligonucléotidiques fluorescentes appelées balises moléculaires (MB) utilisées pour visualiser les transcrits d’ARNm endogènes.

Micro-injection de cellules nourricières de drosophile : une méthode d’administration intracellulaire

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser réticulum endoplasmique associés ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères. Cette technique implique l'perméabilisation sélective de la membrane plasmique avec de la digitonine à supprimer les contenus cytoplasmiques suivie par...

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

Ce protocole décrit un procédé pour mesurer de façon sensible le taux de transport nucléocytoplasmique dans les cellules NSC-34 de type neurone moteur en quantifiant le changement en temps réel de l'importation nucléaire d'une protéine NLS-NES-GFP.

Essai pour mesurer le transport des nucléocytoplasmes en temps réel dans les cellules NSC-34 de type Neuron moteur

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant divers compartiments cellulaires. Ici, nous avons utilisé la microinjection de snRNAs fluorescents afin de surveiller leur transport à l'intérieur de la cellule.

Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

Nous décrivons une méthode pour l'analyse de l'altération des N-glycanes par le début de la vie des glycoprotéines après leur biosynthèse dans les cellules de mammifères. Ceci est réalisé par pulse-chase analyse des glycanes métaboliquement étiquetés, libération enzymatique des glycoprotéines et l'examen par HPLC.

Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères

Découvrez la micro-injection et l'hybridation in situ fluorescente pour analyser la cinétique d'exportation nucléaire de l'ARNm dans les cellules de mammifères. Cette méthode permet de quantifier précisément le transport de l'ARNm vers le cytoplasme.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

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