Expression génique par électroporation de cellule unique dans des cultures de tranches d’hippocampe de souris

Commencez par une tranche d’hippocampe d’un cerveau de souris cultivée sur un insert de culture dans un plat.

Découpez l’insert contenant la tranche et fixez-le dans une chambre d’électroporation au microscope.

Perfuser la chambre avec un tampon contenant un bloqueur des canaux sodiques voltage-dépendant pour inhiber la surexcitation et prévenir la toxicité cellulaire.

Placez une pipette contenant des plasmides avec le gène d’intérêt près de la tranche.

Maintenez une pression positive pour éviter l’obstruction de la pipette à l’approche d’un neurone de l’hippocampe cible jusqu’à ce qu’une fossette membranaire se forme.

Passez en pression négative pour créer une étanchéité avec la membrane.

Alternez entre la pression positive et négative pour minimiser les dommages cellulaires.

Appliquez une impulsion d’électroporation pour perméabiliser transitoirement la membrane, facilitant ainsi l’entrée du plasmide.

Retirez la pipette tout en maintenant une pression positive, et répétez l’électroporation pour les neurones cibles voisins.

Transférez la tranche électroporée dans un insert frais et incubez-la pour permettre l’expression du gène d’intérêt.

Pour préparer les cultures en tranches pour l’électroporation, transférez les inserts de culture d’intérêt dans des boîtes de Pétri individuelles de trois centimètres chargées de 900 microlitres de milieu de culture, et placez les cultures dans un incubateur de dioxyde de carbone de table. Ensuite, pré-incubez des inserts de culture fraîche avec un millilitre de milieu de culture en tranches par insert dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres pendant au moins 30 minutes, et stérilisez les lignes de la plate-forme d’électroporation avec 10 % d’eau de Javel pendant cinq minutes.

À la fin de la perfusion, rincer les conduites avec de l’eau ionisée autoclavée pendant au moins 30 minutes avant de perfuser avec un filtre stérilisé contenant 0,001 millimolaire de tétrodotoxine. Réglez l’impulsion de l’électroporateur sur une amplitude de moins cinq volts, une impulsion carrée, un train de 500 millisecondes, une fréquence de 50 hertz et une largeur d’impulsion de 500 microsecondes. Remplissez une pipette en verre avec cinq microlitres de solution interne contenant un plasmide, puis effleurez doucement et tapotez l’embout plusieurs fois pour éliminer les bulles piégées.

Utilisez un microscope de dissection pour confirmer que la pointe n’est pas endommagée et fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode. Lorsque la pointe entre en contact avec l’aCSF, notez la lecture de la résistance de la pipette de l’électroporateur. Pour isoler une culture en tranches, coupez la membrane de l’insert de culture à l’aide d’une lame tranchante et utilisez une pince à angle vif pour transférer soigneusement la culture en tranches dans la chambre d’électroporation.

Fixez ensuite la position de culture à l’aide d’une ancre de tranche. Pour l’électroporation des cellules d’intérêt, appliquez une pression positive sur la pipette à la bouche et utilisez les commandes tridimensionnelles du bouton pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture de tranches. En observant la culture au microscope, approchez-vous de la cellule cible avec la pointe, en maintenant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule.

Une fois la fossette visualisée, appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche afin qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique. La membrane entrera légèrement dans la pipette. Une augmentation d’environ 2,5 fois de la résistance initiale de la pipette doit être observée, comme l’indique une augmentation de la tonalité des haut-parleurs.

Réappliquez rapidement une pression positive pour que la fossette se reforme. Ensuite, effectuez immédiatement au moins deux autres cycles de pression, comme nous venons de le démontrer, sans faire de pause. Après la dernière impulsion de pression, maintenez la pression négative pendant une seconde.

Lorsque la tonalité des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur, utilisez la pédale pour pulser rapidement l’électroporateur. Après l’électroporation, rétractez doucement la pipette à environ 100 microns de la cellule sans appliquer de pression, et réappliquez une pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à la lecture de base avant d’approcher la cellule suivante. Lorsque toutes les cellules d’intérêt ont été électroporées, transférez la culture en tranches dans l’un des inserts de culture fraîche préparés et placez l’insert à 35 degrés Celsius pendant trois jours maximum.