Name: La culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-L-lactide nanofibres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Apprenez la culture de neurones moteurs et sensoriels primaires de rat sur des échafaudages de nanofibres électrofilées alignées en poly-L-lactide. Cette méthode sans sérum permet d'étudier la croissance dirigée des neurites pour la régénération nerveuse.

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NIH K08 EB003996

1. Poly-L-lactique (PLLA) filage en solution <ol><li> Dissoudre 0,4 g PLLA dans 9 ml de chloroforme en agitant à feu doux. </li><li> Ajouter 1 ml de diméthylformamide à la solution, amenant la concentration finale de la solution à 4% PLLA (p / v) dans le chloroforme: DMF 9:1 (v / v). </li><li> Placer la solution dans un polypropylène ou d'une seringue en verre avec une pointe en métal 23ga émoussé. </li></ol> 2. Filature 1 Préparation du support <ol><li> Faire une solution à 8% (p / v) de 85:15 PLGA (poly-lactique-co-acide glycolique) dans le chloroforme en agitant à feu doux. </li><li> Manteau glisse propre couvercle de verre dans PLGA en recouvrant la surface de chaque lamelle avec la solution de PLGA. Laisser sécher le PLGA d'un film mince (env. 30 min). </li></ol> 3. Électrofilage 2 <ol><li> Fixez PLGA couvercle verre enduit glisse vers le collecteur avec du ruban de carbone conducteur. Pour les fibres alignées, le collecteur est une roue motorisée. Pour les fibres au hasard, le collecteur est un plateau fixe. </li><li> Placer dans une seringue à embout de la pompe de 20 cm de la roue de collecteur. Régler la pompe à environ 2 ml / h et si vous utilisez une roue, régler le moteur à 300-400 RPM. Si possible, appliquer un malus de -2 kV DC biais vers le collecteur et le 15 kV à pointe métallique. En l'absence d'accès à une alimentation bipolaire, terrain du collecteur. </li><li> Fibres va jet du bout de la seringue et recueillir sur la roue en rotation. Continuez jusqu'à ce que la filature de fibres de densité désirée est obtenue. Glissez la pointe en métal avec une serviette en papier fixée à une tige non conductrice périodiquement pour éviter le colmatage à la pointe. </li></ol> 4. Moating 1 <ol><li> Suite à filer, «fossé» les échantillons électrofilé par pipetage une ligne de PLGA autour du périmètre de la lamelle. Autoriser le PLGA à sécher. Ce sera de maintenir l'alignement des fibres au cours de la culture. </li></ol> 5. Revêtement des protéines <ol><li> Fibres de verre et de contrôles électrofilées besoin d'être recouvert de protéines avant la culture cellulaire. Couvrir les substrats dans une solution de protéines pour moins d'une heure et puis aspirer l'excès de solution et continuer jusqu'à ce que l'aspiration des substrats sont secs. Solutions de protéines possibles comprennent: PLL (poly-L-lysine) (100 pg / ml), la laminine (25 ug / ml) ou de la fibronectine (50 ug / ml). Si PLL est utilisée, les supports doivent être rincés à l'eau stérile et séché deux fois par la suite le revêtement initial. </li></ol> 6. Obtenir E15 embryons de rat 3 * Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec le Guide du NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire approuvé par l'Université du Michigan Comité sur l'utilisation et l'entretien des animaux. <ol><li> Préparation: Vérifiez si l'animal est enceinte. Dégel 3 ml de trypsine, 3 ml de FBS et chaleureuse d'une bouteille de L15. Incendie polir une pipette Pasteur. Désinfecter tous les instruments chirurgicaux dans l'éthanol 70% pendant 30 min. </li><li> Préparer et chaleureux des médias placage (voir tableau 1). </li><li> Euthanasie: Effectuer une injection IP de kétamine / xylazine. Attendez 10-15 minutes et vérifiez l'absence de la cornée et la pédale réflexes de retrait. Une fois que les réflexes sont absents, exécuter une injection IC de pentobarbital (FatalPlus). </li><li> Tente de la peau de l'abdomen. Couper à travers la peau et les couches musculaires pour exposer la cavité abdominale. Localisez l'utérus et le détacher au niveau du col et des ovaires. </li><li> Retirez les embryons dans l'utérus avec des ciseaux et de les placer immédiatement dans L15 chaud. (Toutes les procédures suivantes sont accomplies sous un microscope à dissection et d'embryons et les cordons disséqués doit être immergé dans L15 chaude à tout moment.) Décapitez les embryons par la fermeture des pinces autour du menton et en dessous de l'os occipital du crâne. </li></ol> 7. Dissection 3 <ol><li> Placez l'embryon d'un côté. Protéger la moelle épinière avec un jeu de pinces tout en utilisant l'autre ensemble de dépouiller membres et des organes abdominaux. </li><li> Tournez l'embryon et le tient stable avec un jeu de pinces. Snip le long de la longueur de l'embryon, à partir du cou à la queue, jusqu'à ce que le cordon entier est exposé. </li><li> Saisir l'extrémité de la corde et tirez soigneusement sur lui-même vers la queue à enlever. Le cordon va tirer gratuitement à membrane et les ganglions de la racine dorsale (DRG) ci-joint. </li><li> Si DRG explant ou dissocié de la culture neurone sensoriel doit être exécuté, snip la DRG hors du cordon et les transférer sur un plat frais de L15 chaud. <ol><li> Pour la culture DRG explant, passez à l'étape 10.2 </li><li> Pour la culture des neurones sensoriels dissocié, passez à l'étape 9 </li><li> Pour des neurones moteurs de la culture, la DRG sera supprimée avec la membrane à l'étape 7.5 </li></ol></li><li> Retirer la membrane de la moelle épinière en la saisissant à l'extrémité supérieure du cordon et le peler bas, similaire à enlever une chaussette longue. Répétez l'opération pour tous les embryons puis hachez les cordes en petits (2-3 mm) pièces. </li></ol><pclass motoneurone traitement>5,6,7 <ol><li> Verser les cordes coupées et L15 dans une conique et tourne à 1000 RPM pendant 2-3 min pour culotter les morceaux. </li><li> Décanter le surnageant et ajouter 3 ml de trypsine pour les cordes en granulés. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 20 min. </li><li> Ajouter 3 ml de FBS à conique et tournent à 1000 RPM pendant 2-3 min à nouveau à granulés. </li><li> Décanter le surnageant et le manteau d'un incendie polie pipette Pasteur avec du FBS. </li><li> Ajoutez une pipette Pasteur plein de L15 à la forme conique et ensuite triturer doucement jusqu'à ce que la solution est homogène, sans grumeaux visibles. Eviter les bulles. </li><li> Préparer une solution de 9% des Optiprep au L15. Préparer un tube avec 3 mL de la solution Optiprep pour deux embryons (s'il ya un nombre impair d'embryons, arrondir). </li><li> Déposer la solution homogénéisée sur la solution Optiprep, en le divisant équitablement entre tous les tubes. Faites tourner les tubes à 2000 RPM pendant 15 min. </li><li> Recueillir soigneusement les premiers 2 ml de chaque tube et d'une piscine dans un cône de 50 mL. Remplissez le conique avec L15 et tournent à 1000 RPM pendant 5 min pour se rincer les cellules de Optiprep. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une petite quantité de médias plaquage (250-500 pi). Compter les cellules en utilisant exclusion du bleu trypan pour identifier les cellules vivantes. Passer à l'étape 10.1 </li></ol> 9. Sensory Neuron (SN) Transformation 7 <ol><li> Verser le DRG retiré de la moelle épinière et L15 dans un tube conique et tourne à 1000 RPM pendant 2-3 min pour culotter les morceaux. </li><li> Décanter le surnageant et ajouter 3 ml de trypsine pour la DRG granulés. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Ajouter 3 ml de FBS à conique et tournent à 1000 RPM pendant 2-3 min à nouveau à granulés. </li><li> Décanter le surnageant et le manteau d'un incendie polie pipette Pasteur avec du FBS. </li><li> Ajoutez une pipette Pasteur plein de L15 à la forme conique et ensuite triturer doucement jusqu'à ce que la solution est homogène, sans grumeaux visibles. Eviter les bulles. </li><li> Spin l'homogénat à 1000 RPM pendant 5 min. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une petite quantité de médias plaquage SN (250-500 pi). Compter les cellules en utilisant exclusion du bleu trypan pour identifier les cellules vivantes. Passez à l'étape 10.1 </li></ol> 10. Placage et Culture <ol><li> Pour dissocier SN ou MN culture: <ol><li> Couvrir les substrats avec quelques gouttes de médias, puis ajouter un volume approprié de cellules en suspension. Les cellules dissociées doivent être étalées à une faible densité (25-50 cellules / mm 2). Laisser les cellules adhérer pendant au moins une heure avant l'inondation du puits avec les médias. </li></ol></li><li> Pour la culture des explants DRG: <ol><li> Couvrir les substrats avec quelques gouttes de médias puis ajouter DRG aux médias. Disposez les DRG de sorte qu'ils sont répartis à travers le substrat (environ 4 GHM tient sur une lamelle mm 22x22). Laisser le DRG adhérer pendant au moins 4 heures avant l'inondation du puits avec les médias. </li></ol></li><li> Les cultures peuvent être maintenues jusqu'à 4 jours sans changer de support. Pour plus des cultures, la moitié des modifications des médias doit être fait avec les médias nourrissent. Flux des médias est la même composition que les médias plaquage moins la L-glutamine. </li></ol> 11. Immunocytochimie 1,5,8 <ol><li> Fixation des cellules: les médias et la remplacer par Aspirer chaude 4% PFA (paraformaldéhyde) pendant 30 min. Effectuez ensuite 3X 5 min 1x lave PBS. </li><li> Blocage / perméabilisation: Préparer bloc / perm solution (1,25% de sérum albumine bovine dans du PBS 1X, 0,05% Triton X-100 et de 2,0% de sérum de chèvre normal). Aspirer PBS et appliquer bloc / perm solution pour échantillons pendant 30 minutes. Effectuez ensuite 1X 5 min 1x lave PBS. </li><li> L'anticorps primaire: Préparer la solution d'anticorps primaire de travail (10% de sérum de chèvre normal, 1,25% d'albumine sérique bovine, 0,1% de Na azide, 0,05% de Triton X-100 et à 10 mL avec du PBS 1X). Ajouter la quantité appropriée d'anticorps primaire (voir tableau 2). Ligne plusieurs plats avec du parafilm. Placer un cordon de 200 ul de solution d'anticorps primaire sur la parafilm pour chaque substrat. Inverser les substrats, flottant entre eux cellule vers le bas côté de la solution d'anticorps primaire travaille la nuit (si la salle est climatisée ou particulièrement sec, un morceau de papier saturé d'eau peut être ajoutée à un coin du plat pour éviter l'évaporation de la solution de travail) . </li><li> L'anticorps secondaire: Enlever les substrats de la primaire (la solution de travail peuvent être collectées, stockées à 4 ° C et réutilisés) et d'effectuer 2x 5 min 1x lave PBS. Appliquer 200 ul d'anticorps secondaires dilué 1:200 dans du PBS (également inversé sur parafilm plat bordé) pendant 4 heures. </li><li> Retirer du secondaire, puis effectuer 2x 5 min 1x lave PBS. Substrats mont sur des lames d'or avec Prolongez contenant DAPI ou un autre compteur convient colorant nucléaire. </li></ol> 12. Les résultats représentatifs: La morphologie typique d'alignement et de hasard elfibres ectrospun sont présentés dans la figure 1. Nous généralement obtenir une pureté de MN&gt; 90% des neurones 7,8 avec ce protocole et nous avons maintenu DRG cultures aussi longtemps que une semaine sans aucune croissance des fibroblastes significative. La figure 2 montre l'aspect typique de MN sur les fibres de verre et après 24 heures de culture et d'immunomarquage. DRG immunocolorés culture pendant trois jours sur le verre et les fibres sont illustrés dans la Figure 3. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> L'alignement des fibres Figure 1. Est manipulé par le choix du collectionneur. A.) alignés fibres filées sur un collecteur de roue tournante et B.) fibres aléatoire filé sur un collecteur de plaque stationnaire. Barres d'échelle = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Neurones moteurs Représentant colorées pour TuJ1 (vert) et le DAPI (bleu) après 24 heures de culture sur A. revêtement PLL) fibres et B.) en verre. Barres d'échelle = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Teinté DRG Représentant pour neurofilaments (vert) après 3 jours de culture sur PLL revêtement A.) en verre et B.) des fibres. Barres d'échelle = 200 pm. <table border="1"><tbody><tr><td> Solution mère: </td><td> MN médias: </td><td> DRG / SN médias: </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 d'albumine </td><td> 12,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 apo-transferrine </td><td> 50 ul </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> 50 pg ml -1 β-estradiol </td><td> 2,7 ul </td><td> 2,2 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mg mL -1 biotine </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 catalase </td><td> 8 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 mg mL -1 D-galactose </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 d'hydrocortisone </td><td> 3,7 ul </td><td> 2,9 ul </td></tr><tr><td> 0,63 mg mL -1 progestérone </td><td> 0,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 putrescine </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 pg ml -1 sélénium </td><td> 3,4 ul </td><td> 4,1 ul </td></tr><tr><td> 2,5 mg ml -1 superoxyde dismutase </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ng mL -1 facteur de croissance nerveuse </td><td> - </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 ml </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> * 2 mM L-glutamine </td><td> 35 pl </td><td> 35 pl </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> à 50 mL </td><td> à 50 mL </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Ajouter astérisque (*) des composants aux médias juste avant l'utilisation. Les autres composants peuvent être préparées comme une solution de réserve et conservés à -20 ° C jusqu'au moment de servir 6,7. <table border="1"><tbody><tr><td> Primaire (concentration) </td><td> Neurones: </td><td> Glia: </td><td> Fibroblastes: </td></tr><tr><td> anti-β-tubuline (TuJ1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-neurofilaments (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-S-100 (1:250) </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> anti-p75 NGFR (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> Tableau 2. La sélection d'anticorps primaire dépend des objectifs de l'enquêteur. Le ci-dessus sont plusieurs anticorps et les concentrations, nous avons utilisé avec succès dans notre laboratoire. S-100 est particulièrement utile pour identifier les cellules de Schwann et / ou vérifier les contaminer les fibroblastes, mais notez qu'il doit être utilisé en combinaison avec NGFR p75 de distinguer entre les cellules gliales et de fibroblasts4. Nous avons également remarqué que NGFR p75 taches neurites très légèrement tout en neurofilaments ou TuJ1 sont d'excellents choix si le but est de visualiser neurites individuels. </pclass>

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. Chapter 19 (1998).</li>
<li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li>
<li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li>
<li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li>
<li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li>
<li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li>
<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
<li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li>
</ol>

Ce protocole comporte plusieurs étapes cruciales. Le premier concerne la production proprement dite des substrats de fibres électrofilé. Dans les milieux liquides, les fibres PLLA, PLGA films et les douves PLGA sera séparée de la lamelle de verre comme une seule unité. Si le PLGA est omis, les fibres PLLA ne restera pas une feuille plate - ils se recroquevillent dans un enchevêtrement inutilisable. Ainsi, le film de PLGA est inclus comme un substrat adéquat pour maintenir l&#39;alignement des fibres pendant la culture. Le fossé est ajouté après le filage à la fois pour s&#39;assurer que les fibres sont solidement fixées au film PLGA et d&#39;ajouter à la rigidité structurelle du film. Le fossé est aussi une poignée utile lorsque les substrats sont manipulés lors de la fixation, la coloration et de montage. La trituration est la deuxième étape critique. Tous les efforts doivent être faits pour éviter la formation de bulles. De plus, nous avons obtenu des rendements beaucoup plus élevés quand une pipette polie au feu est utilisé pour cette étape. Pour le feu polonais, allumer un bec Bunsen et joindre une ampoule à la pipette. Passez l&#39;extrémité de la pipette rapidement à travers la flamme 2-3 fois tout en continuant à presser et relâcher l&#39;ampoule - le débit d&#39;air grâce à la pipette aidera à prévenir la pointe de se refermer complètement. Examiner la pointe de la pipette pour s&#39;assurer que le trou est toujours ouverte et que les bords apparaissent légèrement arrondi avant l&#39;utilisation. Électrofilage est un processus très polyvalent; les paramètres électrofilage peuvent être modifiés pour produire des fibres avec une variété de morphologies. Tan et al. (2005) détaille une étude systématique des paramètres affectant le diamètre des fibres électrofilées PLLA. Wang et al. (2009) présente une étude détaillée des paramètres influençant l&#39;alignement des fibres PLLA électrofilé.

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Sélénium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Superoxyde dismutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-neurofilament</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGFR p75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Bande de carbone</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

la culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-l-lactide nanofibres

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Électrofilage est une technique pour produire des micro-nano-échelle des fibres. Les fibres peuvent être électrofilé avec divers degrés de l&#39;alignement, de très alignés complètement aléatoire. En outre, les fibres peuvent être tissés à partir de divers matériaux, y compris les polymères biodégradables tels que la poly-L-lactique (PLLA). Ces caractéristiques font de fibres électrofilées approprié pour une variété d&#39;applications d&#39;échafaudages en ingénierie tissulaire. Notre accent est mis sur l&#39;utilisation de fibres électrofilé alignés pour la régénération des nerfs. Nous avons précédemment montré que les fibres alignées électrofilé PLLA directe l&#39;excroissance des deux neurones sensoriels et moteurs primaires in vitro. Nous soutenons que l&#39;utilisation d&#39;un système de culture de cellules primaires est essentielle lors de l&#39;évaluation des biomatériaux pour les neurones véritable modèle in vivo trouve aussi près que possible. Ici, nous décrivons les techniques utilisées dans notre laboratoire pour electrospin échafaudages fibreux et la culture des explants ganglions de la racine dorsale, ainsi que dissocié neurones sensoriels et moteurs, sur des échafaudages électrofilé. Toutefois, l&#39;électrofilage et / ou des techniques de culture présentées ici sont facilement adaptés pour une utilisation dans d&#39;autres applications.

Alignés fibres électrofilées diriger la croissance des neurones in vitro et sont un élément potentiel de régénération nerveuse échafaudages. Nous décrivons une procédure pour la préparation des substrats de fibres électrofilé et la culture sans sérum de rat E15 sensorielles primaires (DRG) et les neurones moteurs. Visualisation des neurones par immunocytochimie est également inclus.

La culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-L-lactide nanofibres

L'électrofilage est une technique permettant de produire des fibres à l'échelle micro et nanométrique. Les fibres peuvent être électrofilées avec divers degrés d'alignement, allant de fortement alignées...

Les fibres électrofilées d'Electros bun alignées orientent la croissance des neurones in vitro et constituent un composant potentiel de supports pour la régénération nerveuse. Ici, des supports de fibres électrofilées d'Electros BUN sont générés et des neurones sensoriels et moteurs primaires de rat sont cultivés dessus. Premièrement, des supports fibreux sont électrofilés sur des lamelles de verre.Des neurones primaires sont ensuite obtenus à partir de rats au jour embryonnaire 15 et cultivés sur des échafaudages de fibres électrofilées. Les neurones sont laissés s'adhérer et croître, puis sont fixés et colorés à l'aide de techniques d'immunocytochimie. Les résultats d'imagerie révèlent des modifications de la morphologie des neurones cultivés sur les fibres électrofilées, indiquant que la nanotopographie de ces fibres peut orienter la croissance des neurites.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de lignées cellulaires transformées, est que les neurones primaires en culture in vitro imitent plus fidèlement le comportement des neurones in vivo que les cellules transformées. Ces techniques permettent aux utilisateurs d'utiliser des fibres électroactives avec d'autres types cellulaires. Alternativement, les utilisateurs peuvent souhaiter utiliser des neurones moteurs et sensoriels en culture à d'autres fins d'investigation.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car l'électrofilage est un procédé délicat, que nous expliquons plus en détail dans notre article vidéo associé. Pour préparer les substrats de fibres par électrofilage, commencez par préparer une solution à 8 % de polylactide-co-glycolide 85 à 15 ou PLGA dans le chloroforme, et une solution à 4 % de poly-L-lactide ou PLLA dans le chloroforme, en agitant à chaleur modérée. Ensuite, recouvrez des lamelles de verre propres de PLGA en appliquant la solution de PLGA sur la surface de chaque lamelle. Laissez sécher le PLGA en un film mince, ce qui prend environ 30 minutes.Une fois le PLGA sec, utilisez un ruban adhésif en carbone conducteur pour fixer un PLG. Un lamelle recouverte sur une roue entraînée par un moteur destinée à la production de fibres alignées ou sur une plaque fixe destinée à des fibres aléatoires. Placez une seringue contenant la solution de PLLA à 4 % dans une pompe munie d'une aiguille, positionnée à 20 centimètres du collecteur.Régler la pompe à environ 0,22 millilitre par heure. Régler le moteur de la roue entre 300 et 400 tours par minute. Appliquer une tension continue de moins deux kilovolts au collecteur et de plus 15 kilovolts à la plaque conductrice, en contact avec la pointe métallique.En l'absence d'accès à une alimentation bipolaire reliée à la masse, le collecteur démarre la pompe à seringue : les fibres jaillissent de l'extrémité de la seringue et s'accumulent sur la roue tournante. Continuer à faire tourner jusqu'à l'obtention de la densité souhaitée de fibres ; pour éviter l'obstruction de l'embout métallique, le nettoyer périodiquement avec une serviette en papier fixée à une tige non conductrice, puis faire tourner le pipeteur autour du périmètre du lamelle recouvert de PLGA, créant ainsi une sorte de douve entourant l'électrofilage.Les échantillons en forme de cône permettent au PLGA de sécher. Cela maintiendra l'alignement des fibres pendant la culture. Les fibres obtenues par électrofilage et les témoins en verre doivent être revêtus de protéines avant la culture cellulaire.Pour ce faire, recouvrez les substrats de polyol, de lysine, de laminine ou de fibronectine pendant au moins une heure. Ensuite, aspirez la solution en excès jusqu'à ce que les substrats soient secs. Si du polyol lysine est utilisé, le substrat doit être rincé à l'eau stérile, puis séché deux fois après le revêtement initial.Une fois qu'ils sont secs, placer les substrats dans des plaques de culture tissulaire à six puits pour la culture cellulaire afin de préparer les cellules qui seront cultivées sur des fibres électrofilées. Obtenir des embryons E15 à partir d'un rat gestant euthanasié. Commencer par stériliser la zone avec de l'éthanol à 70 %, puis soulever la peau de l'abdomen.Incisez les couches cutanée et musculaire pour exposer la cavité abdominale. Localisez l'utérus et détachez-le au niveau du col de l'utérus et des ovaires. Transférez l'utérus dans une boîte stérile.Ensuite, retirez les embryons de l'utérus à l’aide de ciseaux et placez-les immédiatement dans du L15 tiède. Après avoir décapité les embryons, placez un embryon sur le côté en protégeant la moelle épinière avec une première pince. Utilisez l’autre pince pour enlever les membres et les organes abdominaux.Ensuite, retournez l'embryon et maintenez-le fermement avec une pince. Détachez délicatement le long de l'embryon, du cou jusqu'à la queue, jusqu'à ce que toute la moelle épinière soit exposée. Saisissez soigneusement l'extrémité de la moelle épinière, puis tirez-la sur elle-même en direction de la queue.Pour l'enlever, le cordon se détachera en tirant, avec la membrane et les ganglions de la racine dorsale attachés. Si l'on doit réaliser un explant de ganglion de la racine dorsale x ou une culture de neurones sensoriels dissociés, sectionner les ganglions de la racine dorsale du cordon et les transférer dans une nouvelle boîte contenant du milieu L 15 tiède. Pour la culture de neurones moteurs.Saisir la membrane provenant de la moelle épinière à l'extrémité antérieure du cordon et la détacher en la tirant vers le bas. De manière analogue au retrait d'une chaussette longue, répéter ce processus pour tous les embryons, puis, à l'aide de pinces, hacher les cordons en petits morceaux afin d'obtenir des cultures de neurones moteurs.Verser les moelles épinières hachées et le milieu L 15 dans un tube conique et centrifuger à 180 ×g pendant deux à trois minutes. Pour former un culot des fragments, éliminer le surnageant et ajouter trois millilitres de tripsine aux cordons pelotés. Placer le tube dans un bain-marie à 37 °C et incuber pendant 20 minutes.Après l'incubation, ajouter trois millilitres de SBF dans le tube conique. Ensuite, centrifuger à 180 ×g pendant deux à trois minutes pour le sédimenter. Pendant ce temps, polir à la flamme une pipette en verre COTA en faisant passer du SBF à l'intérieur de la pipette, puis en l'expulsant.Cela empêche les fragments de tissu de coller au verre pendant la trituration. Après la centrifugation, retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez un volume complet de L-15 prélevé avec une pipette Pasteur dans le tube conique, puis triturez délicatement à l’aide de la pipette revêtue de FBS jusqu’à obtention d’une solution homogène, sans agrégats visibles.Évitez les bulles. Préparez un tube avec trois millilitres de 9 % opre dans du L 15 pour chaque paire d'embryons. S'il y a un nombre impair d'embryons, ajoutez une goutte.La solution homogénéisée se trouve au-dessus de la solution OptiPrep, en répartissant de manière équitable l'homogénat entre tous les tubes. L'homogénat formera une couche trouble visible au-dessus de la solution OptiPrep. Faire centrifuger les tubes à 700 × g pendant 15 minutes.Prélevez soigneusement les deux millilitres supérieurs de chaque tube et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Remplissez le tube conique avec du L-15 et centrifugez à 180 ×g pendant cinq minutes afin de rincer les cellules d'opre. Éliminez le surnageant.Le culot est rarement visible à l'œil nu. À ce stade, Reese, suspendez les cellules dans une petite quantité de milieu de mise en culture. Comptez les cellules en utilisant l'exclusion au bleu de tripan pour identifier les cellules vivantes.Les cellules sont désormais prêtes à être mises en culture. Une pureté supérieure à 90 % de neurones est attendue pour obtenir des cultures de neurones sensoriels. Commencez par verser les ganglions de la racine dorsale prélevés sur les moelles épinières et le L 15 dans un tube conique.Faire centrifuger à 180 ×g pendant deux à trois minutes afin de former un culot des fragments après la centrifugation. Verser le surnageant et ajouter trois millilitres de trips dans le culot de ganglions rachidiens, puis incuber au bain-marie à 37 °C. Après 10 minutes, retirer le tube du bain-marie et ajouter trois millilitres de SFB au tube, puis centrifuger à 180 ×g pendant deux à trois minutes pour reconstituer le culot.Entre-temps, recouvrir d’un film de sérum fœtal bovin (FBS) une pipette en verre polie au feu. Comme précédemment, utiliser la pipette enduite de FBS pour ajouter une pipette pleine de milieu L-15 au culot et trier doucement jusqu’à obtention d’une solution homogène, sans agrégats visibles. Éviter la formation de bulles après avoir centrifugé l’homogénat à 180 × g pendant cinq minutes.Éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans une petite quantité de milieu de culture pour neurones sensoriels. Comptez les cellules en utilisant l'exclusion au bleu de trypan pour identifier les cellules vivantes. Les cellules sont désormais prêtes à être mises en culture pour obtenir des neurones sensoriels ou moteurs.Commencez par recouvrir les substrats de fibres électrofilées revêtues de protéines avec quelques gouttes de milieu. Ajoutez ensuite un volume approprié de suspension cellulaire. Les cellules dissociées doivent être ensemencées à faible densité.Laisser les cellules adhérer pendant au moins une heure dans l'incubateur avant de remplir les puits avec du milieu et de les remettre dans l'incubateur pour la culture. Recouvrir les substrats de fibres électrofilées revêtus de protéines avec quelques gouttes de milieu à l’aide d’aubergines de ganglions de la racine dorsale. Puis ajouter les ganglions de la racine dorsale au milieu.Disposer les ganglions de la racine dorsale de manière à ce qu'ils soient uniformément répartis sur le substrat. Environ quatre ganglions de la racine dorsale peuvent être placés sur un coverslip de 22 sur 22 millimètres. Placer les cultures de ganglions de la racine dorsale dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et laisser adhérer pendant au moins quatre heures après l'incubation.Inondez les puits avec du milieu et remettez-les dans l’incubateur. Les cultures peuvent être maintenues jusqu’à quatre jours sans changement de milieu. Pour des cultures plus longues, des changements partiels de milieu doivent être effectués avec du milieu de nourrissage.Le milieu de culture a la même composition que le milieu de mise en place, sauf qu'il ne contient pas de L-glutamine. Une fois que les cellules ont atteint le point temporel souhaité, la cyto-immunochimie peut être réalisée selon les instructions du protocole écrit joint. Cette image MEB illustre la morphologie typique de fibres électrofilées alignées et aléatoires.L'alignement des fibres est contrôlé par le choix du collecteur. Notez que les fibres déposées sur un collecteur tournant sont uniformément alignées. En revanche, les fibres déposées sur un collecteur fixe présentent une morphologie aléatoire.Ces images montrent une coloration des motoneurones pour la bêta-tubuline, en vert, et une coloration des noyaux en DAPI, en bleu. Après 24 heures de culture sur des fibres revêtues de PLL et sur du verre, les motoneurones présentent généralement peu de prolongements qui s'étendent depuis le corps cellulaire parallèlement à la direction de l'alignement des fibres, orientée de gauche à droite sur cette image. Les prolongements principaux des cellules cultivées sur les fibres sont nettement plus longs que ceux des cellules cultivées sur du verre au temps équivalent.Les neurones moteurs sur verre présentent généralement plus de prolongements à 24 heures, qui s'étendent radialement à partir du corps cellulaire. Les neurones cultivés sur fibres. Le prolongement majeur est également plus court sur verre que sur fibres dans ces images.Les ganglions de la racine dorsale sont colorés pour les neurofilaments, montrés en vert. Après trois jours de culture sur du verre revêtu de PLL et des fibres, des neurites émanent radialement du ganglion de la racine dorsale. On observe également un important recouvrement des neurites adjacents sur les fibres.Les neurites émanent également de manière radiaire du ganglion. Toutefois, elles effectuent par la suite un virage et suivent la direction des fibres alignées. Il y a significativement moins de recouvrement entre les neurites adjacentes une fois que ces procédures sont maîtrisées.Le filage électrostatique peut être réalisé en environ 30 minutes, et les neurones moteurs et sensitifs peuvent être obtenus en environ deux heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser une technique stérile. L'utilisation d'une pipette polie à la flamme pour l'étape d'itération est nécessaire afin de maximiser la survie neuronale.En outre, il est important d'incuber la molécule d'adhésion et les fibres électrofilées pendant la durée appropriée. Par exemple, si les fibres sont recouvertes de polylysine pendant moins d'une heure, le revêtement sera insuffisant pour permettre l'adhésion cellulaire. Toutefois, si la polylysine reste en contact trop longtemps, par exemple toute une nuit, les fibres peuvent se dégrader.Il est également important de se rappeler que la plupart des microscopes ne permettent pas la visualisation des neurones sur les fibres pendant la culture. Cela s'explique par le fait que les fibres et les prolongements neuronaux se ressemblent fortement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cultiver des neurones moteurs et sensoriels primaires provenant de rats à 15 jours de développement embryonnaire sur des substrats de fibres électrofilées.N'oubliez pas que le travail avec des tensions élevées peut être extrêmement dangereux et que des précautions appropriées doivent toujours être prises pour isoler l'opérateur du dispositif de filage électrique.

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La culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-L-lactide nanofibres (Vidéo) | JoVE Journal

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