Préparation d’un inoculum bactérien unicellulaire

Prenez une culture métaboliquement active de Mycobacterium marinum. Cela garantit une viabilité bactérienne élevée et un état physiologique optimal.

Centrifugez la culture pour granuler les bactéries.

Jetez l’excès de surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu frais contenant un agent dispersant.

Transférez la suspension dans des tubes de microcentrifugation et sonifiez dans des conditions contrôlées.

La sonication perturbe les agrégats bactériens et disperse les cellules, ce qui permet d’obtenir une suspension unicellulaire viable.

Prélevez la suspension soniquée dans une seringue et passez-la à travers un filtre à membrane pour éliminer tous les amas restants, assurant ainsi une population unicellulaire uniforme.

À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la densité optique de la suspension bactérienne.

Diluer la suspension avec un milieu frais contenant un cryoprotecteur pour atteindre la concentration bactérienne souhaitée tout en préservant la viabilité cellulaire.

Aliquote la suspension monocellulaire finale et stockez-la à des températures ultra-basses. Le cryoprotecteur aide à maintenir la viabilité bactérienne pendant le stockage à long terme.

Après l’inoculation selon le manuscrit, centrifuger la culture à 3000 fois G pendant 10 minutes pour recueillir le Mycobacterium marinum sous forme de pastille. Jetez tous les microlitres sauf 300 microlitres de surnageant et remettez le granulé en suspension.

Ajoutez trois millilitres de milieu 7H9 avec 10 % de glycérol pour remettre le granulé en suspension, puis sonifiez la suspension dans un bain-marie à 100 watts, avec 15 secondes de marche et 15 secondes d’arrêt, pour un total de deux minutes pour obtenir un homogénat à cellule unique. Transférez la suspension bactérienne dans une seringue de 10 millilitres et passez-la à travers un filtre de cinq microns pour éliminer tous les amas bactériens. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la densité optique de la suspension et diluez-la avec un milieu 7H9 contenant 10 % de glycérol à OD 600 à un.

Divisez la suspension en aliquotes de 10 microlitres et conservez-la au congélateur à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.