Name: Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Apprenez à visualiser les extrémités libres de F-actine dans les cônes de croissance neuronaux perméabilisés. Cette méthode utilise la rhodamine-actine pour étudier la dynamique de l'actine et les signaux de guidage axonal.

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Les auteurs remercient le Dr James Bamburg et des membres de son laboratoire pour la collaboration dans ces études. Ce travail a été financé par des subventions du NIH HD19950, EY07133 et par des subventions de la Fondation Minnesota Medical.

Pour la rhodamine-actine étiquetage, les neurones sont cultivées sur des lamelles en verre placé dans le fond de 35 mm plats en plastique, ou sur des lamelles collées dans "vidéo" plats. 1. Préparation des Lamelles ou "Video" Plats <ol><li> Beaucoup de types de neurones sont mal adhésif pour substrats in vitro. Lamelles de verre, qui sont requis pour cette procédure, ne permettent pas suffisamment de neurones substrat d'adhésion sauf si elles sont convenablement nettoyés et préparés. Une procédure détaillée pour l'acide lavage et de nettoyage des lamelles en verre est décrite dans les cellules nerveuses de l'ouvrage Culture, édité par Banker et Goslin. Alternativement, un revêtement nitrocellulose pour lamelles, qui lie avidement molécules de substrat, est décrit dans les étapes 1.7 et 1.8 ci-dessous. </li><li> Verre lamelles (par exemple des carrés de 18 mm ou 24 mm cercles) sont rincées dans de dH 2 O et cuit dans la chaleur sèche (≥ 225 ° C) aussi longtemps que possible (un minimum de plusieurs jours jusqu'à trois mois ou plus) pour enlever les traces de composés organiques composés. Passez à l'étape 1.6 ou pour les plats de la vidéo procéder à 1.3. </li><li> Pour créer un substrat de verre mince clair pour vidéomicroscopie de haute résolution, des trous circulaires de diamètre approprié sont percés dans le fond de 35 ou 50 mm ou de Petri en plastique des boîtes de culture tissulaire en utilisant un perce-bouchon électrique (ou un instrument similaire). Le forage est effectué lentement avec une légère pression pour éviter la fissuration du plastique. Bords du trou foré sont raclées avec des ciseaux afin de créer une surface lisse sur les deux côtés. </li><li> Lamelles de verre sont nettoyées pour une utilisation culture de tissus, tels que décrits en 1.1 ou 1.2. Lamelles sont collées en place au fil des trous, en utilisant du ciment non toxique d'aquarium en silicone (pour lamelles 18x18mm, un peu de diamètre 12mm est utilisé). Le ciment est durci pendant 24 heures. </li><li> (Les étapes suivantes sont effectuées en utilisant des conditions stériles) Les plats vidéo sont rincés trois fois avec stériles dH 2 O et sécher à l'air. </li><li> Lamelles sont recouvertes de molécules de substrat pour la culture neuronale. Tout d'abord, la surface est enduite d'lamelle (250 uL d'18x18 lamelle) une solution de 100 ug / ml de poly-D-lysine dans du PBS pendant heures 4-8 (ou une nuit) dans un incubateur humidifié 38 ° C. Lamelles sont ensuite rincés 3 fois avec stériles O DH 2 pour enlever Unbound poly-D-lysine et sécher à l'air. Beaucoup de types de neurones sont cultivées sur des lamelles recouvertes de poly-D-lysine seule, si les protéines sériques sont inclus dans le milieu de culture. Cependant, des résultats plus pertinents pour les conditions in vivo sont obtenues en utilisant des molécules du substrat naturel. Les solutions de ces molécules, telles que la laminine, fibronectine ou L1 CAM (1-20 mg / ml dans le PBS), peuvent être directement appliquées à la poly-D-lysine lamelles enduits pour 4-8 heures ou toute la nuit, mais dans notre laboratoire nous avons l'habitude enrober les lamelles préparées avec un mince film de nitrocellulose avant d'appliquer les molécules d'adhésion cellulaire pour augmenter la protéine de liaison du substrat. </li><li> Faire une solution de nitrocellulose 1% en dissolvant 5 g de nitrocellulose dans 5 ml d'acétate d'amyle 100%. Appliquer 10 uL de cette solution à la lamelle et doucement l'étaler sur la surface. Sécher à l'air 10 minutes. </li><li> Appliquer 250 ul d'une solution de 25 pg / ml de laminine ou 4 mg / ml L1 CAM dans le PBS et répartis sur la surface de nitrocellulose. Incuber 4 heures (ou une nuit) dans un incubateur humidifié 38 ° C, substrat aspirer et d'ajouter immédiatement un milieu de culture, de sorte que le substrat ne sèche pas. </li></ol> 2. Préparation des cultures de neurones <ol><li> Embryonnaires embryons de Poulet de 7 jours sont supprimés à partir d'oeufs, et placés dans des boîtes de Pétri 100 mm contenant du milieu de culture avec 10% de sérum pour la dissection d'enlever les organes internes du thorax et l'abdomen, à l'aide d'un stéréomicroscope. </li><li> Les embryons sont ensuite rincés à moyen et déplacé à une boîte de 60 mm avec un milieu liquide et d'autres disséquées pour retirer et de préparer des explants de ganglions de la racine dorsale (DRG) ou neurones tissus rétiniens. Une description détaillée de dissection peut être trouvée dans Methods in Cell Biology, volume 71, Neurones: méthodes et applications pour le biologiste cellulaire, édité par Hollenbeck et Bamburg. Explants DRG sont ganglions 1/2-whole et neural explants rétiniens sont de 1 mm de diamètre ou moins. </li><li> Après le nettoyage des explants de tissus étrangers, des explants individuels sont déplacés avec des pinces horlogers à l'lamelles, qui sont déjà dans des boîtes de culture avec le milieu de culture. Sous un microscope à dissection, l'explant est doucement pressé pour le centre de la lamelle avec une pince pour empêcher tout mouvement pendant le transport à l'incubateur. Les explants sont cultivés en milieu F12 avec B27 additifs, tamponné avec 10 mM d'HEPES à pH 7,4 et placé une nuit dans un incubateur humidifié 38 ° C. Les facteurs de croissance peuvent être ajoutés, si nécessaire, au milieu de culture. Les neurotrophines sont souvent ajoutés à des cultures de DRG âgées embryons, même si les neurones DRG E7 s'étendra axones d'explants sans neurotrophines ajouté. Des explants de rétine neurale étendre axones dans ce milieu de culture sansdding facteurs de croissance. </li><li> Les cultures sont incubées pendant au moins 18 heures afin de permettre suffisamment excroissance axonale avant le début de la procédure ci-dessous. </li></ol> 3. Préparation du tampon de perméabilisation rhodamine-actine <ol><li> Une solution stock de tampon de perméabilisation contenant 138 mM, KCl 10 mM PIPES, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2, et 1% de BSA (pH = 6,9) peuvent être conservés jusqu'à 2 semaines à 4 ° C11. Juste avant l'utilisation, les composants suivants sont ajoutés pour une concentration finale de: 0,025% saponine, 0,1 mM d'ATP, et 100 nM Alexa Fluor-350 phalloïdine. </li><li> Une solution séparée est également fraîchement préparés juste avant utilisation avec ces mêmes composants, plus 0.45μM rhodamine non musculaires d'actine La solution est alternativement agité et tritrated pendant 5 min à dissoudre la rhodamine-actine touffes, et est vortexé pendant 1 min durant l'étape initiale de perméabilisation pour empêcher la polymérisation dans le tube. Si malgré cela, l'assemblage de filaments dans le tube reste un problème, la solution peut être centrifugé avant d'utiliser. </li></ol> 4. Perméabilisation des cultures de neurones et incorporation de la rhodamine-actine sur F-actine Ends barbelé <ol><li> Une boîte de culture avec des explants DRG ou rétinienne est soigneusement enlevé de l'incubateur et les étapes suivantes sont réalisées à température ambiante. </li><li> Tous les changements de solutions doit être fait soigneusement. La pointe de la pipette devrait être placé au bord de la lamelle, et les solutions doivent être retirés et ajoutés lentement et avec une force minimale. </li><li> Le milieu de culture est retiré à la pipette avec soin, mais de façon constante, et le tampon de perméabilisation suffisant pour couvrir les cellules est ajouté pendant 1 min (pour x 18mm lamelle 18mm, ~ 60 pi). La culture n'est pas rincée avec d'autres solutions avant d'ajouter le tampon de perméabilisation, et la lamelle n'est pas autorisé à sécher avant d'ajouter le tampon de perméabilisation. </li><li> Le tampon de perméabilisation est doucement retiré à la pipette et remplacé par le tampon de perméabilisation contenant 0,45 uM rhodamine non musculaires d'actine pendant 4 min. </li><li> La rhodamine-actine contenant tampon est délicatement retiré à la pipette, et les neurones sont fixées par l'ajout d'une solution de paraformaldéhyde à 4% (qualité laboratoire, faite avec un tampon phosphate, pH 7,3), le glutaraldéhyde à 0,05% et 10% de saccharose. Après fixation 5 minutes les lamelles sont délicatement rincés avec du PBS, et monté dans Slowfade sur lames de verre de 3 pouces. </li><li> Une approche alternative aux solutions de change est d'utiliser une cellule d'écoulement. Ce peut être une cellule d'écoulement commercialement disponible, ou une cellule d'écoulement simple peut être fait en plaçant des petits morceaux de plastique (≤ 1 mm d'épaisseur) que des entretoises dans les coins de la lamelle, puis monter une lamelle de taille égale au sommet de la lamelle. Des solutions peuvent être échangés en plaçant la pipette sur un côté de la cellule de débit et de retrait des solutions avec une mèche (coton ou une Kimwipe) de l'autre côté. </li><li> L'incorporation de la rhodamine-actine sur F-actine fluorescente et de barbelés se termine-phalloïdine étiquetage des F-actine dans les cônes de croissance est visualisée avec épifluorescence optiques à travers un objectif à immersion 60X, et les images sont recueillies, en utilisant une caméra CCD refroidie. Un microscope confocal peut fournir l'imagerie améliorée. </li><li> Pour une meilleure quantification de la rhodamine-actine incorporation toutes les images doivent être recueillies en une seule séance, en utilisant le même gain et les paramètres de l'exposition de la sensibilité de la caméra numérique pour chaque image. L'analyse de l'étiquetage doit être fait à partir des régions équivalentes de chaque image; Metamorph, Image J ou similaire outils informatiques pour l'analyse de l'image peut être utilisée. </li></ol> VARIATIONS DE CETTE PROCÉDURE 5. Variation I: recueillir des images Live Cell Avant la rhodamine-actine Étiquetage <ol><li> Vidéo plats sont placés sur une platine de microscope réchauffé, et des images en direct du cône de croissance sont collectées. Maillées lamelles peuvent être utilisées, ou de gravures et / ou des marques stylo sur la lamelle peut être fait pour trouver plus facilement des cellules spécifiques après marquage, ou le plat vidéo peuvent être fixés en place sur la platine du microscope pour la durée de la procédure. </li><li> Perméabilisation, l'incorporation de la rhodamine-actine, et la fixation de cellules sont réalisées dans le plat vidéo, soit sur ou hors de la platine du microscope. Après fixation, PBS est ajouté à des plats vidéo pour l'imagerie immédiate. Afin de préserver l'échantillon pour l'imagerie tard, moyen slowfade montage est ajouté à la lamelle et une lamelle de taille égale est doucement placée sur le dessus (en évitant les bulles), et les bords sont ensuite scellés avec du vernis à ongles transparent. </li></ol> 6. Variation Deux: immunochimie à Co-label protéines supplémentaires <ol><li> Rhodamine-actine constitution et la fixation peut être réalisée sur des neurones cultivés sur des lamelles ou en plats vidéo, tel que décrit ci-dessus (04/02 au 04/04). </li><li> Après fixation, et de rinçage dans du PBS, les cellules sont traitées 15 min avec 0,1 M de glycine dans du PBS et ensuite extrait avec 0,1% de Triton X-100 (TX-100) dans du PBS avec du sérum de chèvre 2% et 1% de BSA pendant 1 h. Lamellessont incubées avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS contenant 1% de BSA pendant 1 h. Les lamelles sont ensuite rincés et incubées dans 0,1% TX-100 dans du PBS avec du sérum de chèvre 2% et 1% de BSA pendant 1 h, avant d'appliquer des anticorps secondaires fluorescents à dilution de 1:1000 dans du PBS avec 1% de BSA pendant 1 h. Après rinçage, les lamelles sont à nouveau incubées dans 0,1% TX-100 dans du PBS avec du sérum de chèvre 2% et 1% de BSA pendant 30 min, rincées et montées en anti-fading moyenne. La localisation de certaines protéines est perturbée par l'étape de perméabilisation initiales (4,3). Pour conserver ces protéines pour la localisation avec des anticorps, le paraformaldéhyde 0,05% et 0,05% de glutaraldéhyde peuvent être ajoutés à la mémoire tampon de perméabilisation pendant 1 min (c'est à dire avant d'ajouter la rhodamine-actine) sans affecter l'étiquetage fin barbelés par la rhodamine-actine. </li><li> Les images de cônes de croissance triple-étiquetés sont collectés par microscopie à fluorescence ou confocal. </li></ol> 7. Variation Trois: Évaluation des effets des signaux de guidage sur la F-actine extrémités libres barbelé <ol><li> Un facteur de croissance ou de signaux de guidage est ajouté à des boîtes de culture dans l'incubateur à des concentrations de plusieurs ng / mL pendant quelques minutes (ou un temps de traitement approprié) avant de retirer le plat de l'incubateur et le début de la procédure de perméabilisation. Cela permet l'évaluation des effets à court terme de facteurs de croissance ou de signaux de guidage sur la F-actine extrémités libres de fer barbelé. </li><li> Un plat vidéo avec des cultures neuronales peuvent être placés sur une platine de microscope réchauffé, et des facteurs de croissance ou de signaux de guidage peut être libéré d'une micropipette dans un gradient de près d'un cône de croissance avant le début de la perméabilisation et la rhodamine-actine constitution. Par exemple, le NGF peut être libéré pour DRG neurones ou la nétrine pour neurale des cellules ganglionnaires de la rétine. La pipette peut être introduite pour aussi courte que 1-2 minutes avant le début de la procédure de perméabilisation. Cela permet l'évaluation des effets locaux d'un gradient de signal de guidage sur la formation de F-actine extrémités libres de fer barbelé dans les marges du cône de croissance leader (voir 10 citations de référence pour les images). </li><li> Ces variations peuvent être combinés avec des anticorps médiée étiquetage des autres composants neuronaux, comme décrit en 6.2 ci-dessus. </li></ol> 8. Variation IV: F-actine Étiquetage extrémité libre barbelé sur les neurones transfectées <ol><li> L'utilisation de constructions constitutivement actif ou dominant-négatifs ou knockdown protéines à l'aide d'ARNi (avec un marqueur fluorescent identifiant) peut être utilisé pour évaluer l'implication d'une protéine dans la régulation de la F-actine extrémités libres de fer barbelé. Fonction de la protéine, sa localisation dans le cône de croissance, et si elle est fusionnée à un marqueur fluorescent, la protéine fluorescente exprimée dans les cellules transfectées peuvent être perdues lors de perméabilisation. Si c'est le cas, de la vaisselle vidéo peut être utilisé pour identifier une cellule transfectée microscope avant de perméabilisation et la perméabilisation peut être effectuée sur la platine du microscope, après avoir marqué les positions des cellules transfectées. Alternativement, une construction GFP-actine peuvent être co-transfectées avec un GFP-construction d'intérêt. Dans ce cas, la GFP-actine seront incorporés dans la F-actine, et ne sera pas perdue par perméabilisation, permettant l'identification de cellules transfectées après perméabilisation. </li><li> Cette variation peut être combiné avec l'ajout de signaux de guidage, comme décrit dans 7.1 à 7.3 ci-dessus. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Outre mondiale du NGF augmente totale de F-actine et la F-actine se termine barbelés à la marge du cône de croissance de premier plan. Quand un cône de croissance est stimulée DRG avec un facteur de croissance nerveuse (NGF) pendant 5 minutes, polymérisation de l'actine est stimulée à la marge de premier plan, et une bande brillante de la rhodamine-actine étiquetage est perçu sur le pourtour du cône de croissance. La figure 1 compare la rhodamine-actine incorporation dans un cône de croissance DRG non stimulées et un cône NGF stimule la croissance DRG. La fluorescence verte dans les images fusionnées est étiquetage phalloïdine pour F-actine dans le cône de croissance et le rouge est la rhodamine-actine étiquetage. Un bon contrôle de l'étiquetage final de fer barbelé est d'ajouter de 10-6 M ou plus cytochalasine B ou D dans la mémoire tampon de perméabilisation dans les étapes 4.2 et 4.3. Cytochalasines bouchon F-actine se termine barbelés et inhibent la rhodamine-actine se liant à bouts de fer barbelé. Cela devrait considérablement réduire ou éliminer l'incorporation de la rhodamine-actine dans la cellule. Barres d'échelle, 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Un gradient de NGF augmente localement F-actine se termine barbelé. Une micropipette qui libère le NGF est amené à un côté d'un cône de croissance DRG pendant 2 minutes, suivie par l'étiquetage de la F-actine extrémités libres de fer barbelé. Les images ci-dessous montrent que l'exposition à un gradient de NGF stimule localement une augmentation de la F-actine extrémités libres barbelés dans la région du cône de croissance plus proche de la pipette. L'image fusionnée montre phalloïdine en vertet la rhodamine-actine en rouge. La barre d'échelle, 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Protéines ERM Activé s'accumulent à la marge du cône de croissance de premier plan. Marquage immunocytochimique de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (Perm) avec F-actine extrémités libres de fer barbelé. Glutaraldéhyde (0,05%) et paraformaldéhyde (0,05%) ont été ajoutés à la mémoire tampon de perméabilisation initiaux pendant une minute afin de préserver la localisation du MCE. Rhodamine-actine, rouge; PERM, vert; phalloïdine, bleu. La barre d'échelle, 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Stimulation de la polymérisation de l'actine nécessite protéines ERM actif. DRG dissociées ont été co-transfectées avec GFP-actine et un contrôle GFP plasmide ou un dominant négatif Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) construire. L'utilisation de la GFP-actine permet l'identification de cellules transfectées après perméabilisation. Ici, le NGF a été ajouté 5 min avant l'étiquetage de F-actine se termine barbelé. Notez le cône de croissance transfectées avec DN MCE a réduit les niveaux de la fin barbelés à la marge du cône de croissance menant (panneau inférieur du milieu), qui contraste avec un cône de croissance non transfectées proximité (panneaux inférieurs), ou avec le contrôle GFP (panneau du milieu en haut). Rhodamine-actine, rouge; GFP-actine, vert. Barres d'échelle, 10 um.

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Les méthodes présentées ici permettent la résolution temporelle et spatiale des composants cellulaires qui sont impliquées dans le remodelage dynamique du cytosquelette d&#39;actine à la marge de premier plan de migration des cônes de croissance. L&#39;action des molécules attractives, comme le NGF ou nétrine, de stimuler rapidement filaments d&#39;actine de polymérisation se révèle comme une augmentation locale de l&#39;actine se termine barbelés, créé par filaments d&#39;actine séparation par activées ADF / cofiline <...

<table><tbody><tr><td>Couvre-objet 18x18 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Ciment pour aquarium</td><td></td><td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td><td>N'importe quel magasin de bricolage</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (pm &amp;gt; 300 000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>Laminine naturelle de souris</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>Phalloïdine Alexa-fluor 350</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Actine non musculaire marquée rhodamine</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture F12</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade </td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetage f-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Les conseils mobiles des axones en croissance sont appelées cônes de croissance. Cônes de croissance conduisent naviguer axones à travers les tissus en développement en interaction avec les signaux de guidage exprimés au niveau local moléculaires qui lient les récepteurs du cône de croissance et de réguler la dynamique et l&#39;organisation du cytosquelette de la croissance cône 3-6. La cible principale de ces signaux de navigation est le maillage filament d&#39;actine qui remplit la périphérie du cône de croissance et que la motilité du cône de croissance grâce à des lecteurs polymérisation de l&#39;actine et le remodelage continu dynamiques 7. Signaux de guidage positif ou attrayante induisent cône de croissance tourne en stimulant filaments d&#39;actine (actine F) de polymérisation dans la région de la périphérie du cône de croissance qui est près de la source de la queue attractif. Cette polymérisation de l&#39;actine disques locaux cône de protrusion de croissance, l&#39;adhérence de la marge de leader et l&#39;allongement des axones vers l&#39;attractif. Filaments d&#39;actine de polymérisation dépend de la disponibilité du monomère d&#39;actine suffisante et sur les noyaux de polymérisation ou se termine filament d&#39;actine barbelés pour l&#39;addition de monomère. L&#39;actine monomère est disponible en abondance dans le ganglion de la racine dorsale de la rétine et poussins (GHM) des cônes de croissance. En conséquence, la polymérisation augmente rapidement quand il est libre F-actine se termine barbelés deviennent disponibles pour l&#39;addition de monomère. Cela se produit dans chiches DRG et les cônes de croissance rétiniens via l&#39;activation locale de l&#39;actine F-actine rupture protéines dépolymérisation facteur (ADF / cofiline) dans la région du cône de croissance plus proche d&#39;un 80-10 attractif. Ce accrue ADF / cofiline activité Severs filaments d&#39;actine à créer de nouveaux F-actine se termine barbelés pour la polymérisation. La méthode suivante illustre ce mécanisme. Contenu total de la F-actine est visualisée par coloration avec la phalloïdine fluorescente. F-actine se termine barbelés sont visualisés par l&#39;incorporation de la rhodamine-actine dans les cônes de croissance qui sont perméabilisées avec la procédure décrite dans la suivante, qui est adapté à partir des études antérieures sur d&#39;autres cellules mobiles 11, 12. Lorsque la rhodamine-actine est ajouté à une concentration supérieure à la concentration critique pour l&#39;addition de monomères d&#39;actine à l&#39;extrémité de fer barbelé, la rhodamine-actine assemble sur des extrémités libres de fer barbelé. Si le repère attractif est présenté dans un dégradé, comme d&#39;être libéré d&#39;une micropipette positionné sur un côté d&#39;un cône de croissance, l&#39;incorporation de la rhodamine-actine sur F-actine se termine barbelés sera plus grande dans le côté du cône de croissance vers la micropipette 10 . Cônes de croissance sont des structures à petites cellules et délicat. Les procédures de perméabilisation, la rhodamine-actine incorporation, la fixation et la visualisation de fluorescence sont tous soigneusement fait et peut être menée sur la scène d&#39;un microscope inversé. Ces méthodes peuvent être appliquées à l&#39;étude de polymérisation de l&#39;actine locale dans les neurones en migration, d&#39;autres cellules des tissus primaires ou de lignées cellulaires.

Une méthode de visualiser et de quantifier la F-actine se termine barbelés dans les cônes de croissance neuronale est décrite. Après les neurones en culture sur des lamelles en verre, les cellules sont perméabilisées avec une solution contenant de la saponine. Ensuite, une courte incubation avec le tampon de la saponine contenant rhodamine-actine intègre actine fluorescente sur l&#39;actine se termine sans barbelés.

Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées

Les extrémités motiles des axones en croissance sont appelées cônes de croissance. Les cônes de croissance guident la navigation des axones à travers les tissus en développement en interagissant localement...

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser la localisation et le nombre d'actine F libre, ainsi que des extrémités pointues disponibles pour la polymérisation de l'actine dans les cônes de croissance neuronaux exposés à des signaux de guidage axonal. Ceci est réalisé en immergeant d'abord des neurones cultivés sur des lamelles dans un tampon contenant de la saponine afin de rendre les cônes de croissance perméables. Les cellules sont ensuite exposées à un tampon contenant de l'actine marquée à la rhodamine pendant quatre minutes, permettant à l'actine marquée de pénétrer dans les cônes de croissance et de polymériser sur les extrémités pointues libres de l'actine F.Enfin, les cellules sont fixées chimiquement et rincées pour préserver la distribution de l'actine F. Les extrémités pointues ayant incorporé de l'actine marquée. Des résultats obtenus par microscopie de fluorescence et analyse quantitative d'images montrent que les signaux de guidage attractifs augmentent le nombre de f effectin libre.Extrémités en forme de flèche au niveau du bord antérieur des cônes de croissance en migration. Bonjour, je suis Paul Erno du Département des neurosciences à la Faculté de médecine de l'Université du Minnesota. Aujourd'hui, nous allons démontrer la préparation de cultures de cônes de croissance neuronaux de poulet.Nous allons démontrer une méthode permettant de visualiser, dans les cônes de croissance, les extrémités pointues des filaments d’actine, qui sont les composants cytosquelettiques dynamiques responsables de la progression des axones lorsqu’ils se déplacent à travers les embryons vers leurs cibles synaptiques. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier la dynamique de l’actine et les cônes de croissance nerveux, elle peut être appliquée à d’autres cellules nerveuses mobiles telles que les cellules gliales, les cellules de la crête neurale ou les neurones en migration. Démonstration des procédures.Aujourd'hui seront présents les membres du laboratoire, Bonnie Marek, chercheuse postdoctorale, et Jose San Miguel Ruiz, étudiant en médecine et doctorat. Pour préparer les boîtes de culture utilisées pour l'étiquetage de l'actine neuronale avec rumine, rincez des lamelles en verre carrées de 18 millimètres ou circulaires de 24 millimètres avec de l'eau distillée, puis faites-les cuire à sec pendant trois mois ou plus. D'autres méthodes de nettoyage des lamelles peuvent être utilisées à la place de la cuisson au four. Percez des trous circulaires de diamètre approprié dans le fond de boîtes en plastique de 35 ou 50 millimètres, Petri ou pour culture tissulaire, à l'aide d'un tire-bouchon, d'un foret ou d'un autre instrument. Ensuite, grattez les bords des trous percés avec des ciseaux afin d'obtenir une surface lisse des deux côtés.Ensuite, un lamelle propre est collée sur le trou de chaque boîte à l’aide d’un ciment aquarium au silicone, puis les boîtes sont rincées plusieurs fois avec de l’eau distillée stérile. Les boîtes sont désormais prêtes pour le revêtement du substrat. Appliquez une solution de PDL dans le PBS à 100 microgrammes par millilitre sur les lamelles ou les boîtes pour vidéo, puis incubez de deux à quatre heures dans un incubateur humide à 38 degrés Celsius.Aspirez la solution de PDL et rincez les lamelles trois fois avec de l'eau distillée stérile ; laissez sécher à l'air. Ensuite, préparez une solution de nitrocellulose à 1 % en dissolvant cinq milligrammes de nitrocellulose dans cinq millilitres d'acétate d'amyle. Appliquez 10 microlitres de cette solution sur la face supérieure d'une lamelle, puis inclinez-la pour répartir uniformément la solution sur toute la surface ; laissez sécher à l'air environ 10 minutes.Enfin, appliquer 250 microlitres de laminine à 25 microgrammes par millilitre, ou de L un cam à 4 microgrammes par millilitre dans du PBS, et répartir le mélange sur la surface de nitrocellulose. Incuber de six à huit heures dans une étuve humide à 38 degrés Celsius. Puis, dans une hotte de culture tissulaire, aspirer le substrat et ajouter immédiatement le milieu de culture, en veillant à ce que le substrat ne s'assèche pas.Explan.Des cultures de ganglions de la racine dorsale ou DRG ou de tissus rétiniens neuronaux sont préparées en dissociant des embryons de poulet de sept jours. Les implants de DRG correspondent à la moitié d'un ganglion entier et les explants rétiniens ont un diamètre d'un millimètre ou moins.Sous un microscope stéréoscopique, utilisez une pince pour placer l'explants sur la lamelle. Ensuite, appuyez doucement au centre de la lamelle afin d'éviter tout déplacement lors du transport vers l'incubateur. Les boîtes contenant les lamelles sont déplacées avec précaution et placées dans un incubateur chaud et humidifié pendant la nuit ou pendant 18 heures.Au cours de cette période, des axones de plusieurs centaines de micromètres sont étendus à partir de l'explante. Préparez le tampon de perméabilisation à l'actine rumine en ajoutant les composants suivants : saponine A TP et LOR trois 50 fein. La composition de ce tampon est décrite dans le protocole écrit.Préparez une solution séparée en utilisant les mêmes composants ainsi que 0,45 micromolaire d'actine non musculaire T rate d'ermine, puis vortexez pour mélanger afin de rendre perméables et marquer les cellules neuronales. Retirez délicatement de l'incubateur une boîte de culture contenant des implants de DRG ou de la rétine et effectuez les étapes suivantes à température ambiante. À l’aide d’une pipette, retirez soigneusement le milieu de culture et ajoutez suffisamment de tampon de perméabilisation pour recouvrir les cellules ; incubez pendant une minute.Retirez délicatement le tampon de perméation et remplacez-le par le tampon contenant 0,45 micromolaire d’actine non musculaire de rumine, puis incubez pendant quatre minutes. Enfin, retirez le tampon contenant l’actine de rumine et fixez les neurones avec du paraformaldéhyde à 4 % et du glutaraldéhyde à 0,05 % pendant cinq minutes. Rincez délicatement avec du PBS et montez avec du milieu de montage anti-fade sur des lames de verre de trois pouces.Utilisez un microscope à fluorescence épiscopique équipé d'un objectif à immersion huile de 60 x pour visualiser l'incorporation de l'actine R domine dans l'actine F, les extrémités pointues et le marquage fluorescent de l'actine F dans les cônes de croissance, afin d'obtenir une quantification optimale de l'incorporation de l'actine R domine. Toutes les images doivent être acquises lors d'une seule session, en utilisant les mêmes réglages de gain de sensibilité et de temps d'exposition pour la caméra numérique pour chaque image. Analysez le marquage à partir de régions équivalentes à l'aide de Metamorph ImageJ ou d'un logiciel d'analyse d'image similaire.Plusieurs variantes de cette procédure peuvent également être réalisées. L'une des variantes consiste à utiliser l'immunochimie afin de localiser d'autres protéines en plus de F fact et des extrémités pointues. Après la fixation de l'actine rumine incorporée et un rinçage au PBS, des anticorps dirigés contre un autre composant du cône de croissance peuvent être ajoutés, suivis d'un rinçage, d'un blocage et d'une incubation avec un anticorps secondaire marqué par un fluorophore, approprié pour un triple marquage avec l'actine r domine et la falline fluorescente.Une troisième variante évalue les effets des signaux directeurs sur F FACT et les extrémités barbées libres en ajoutant un facteur de croissance ou un signal directeur aux boîtes de culture dans l’incubateur pendant cinq à quinze minutes avant de retirer la boîte de l’incubateur et de commencer la procédure de perméabilisation. Cela permet d’évaluer les effets à court terme des facteurs de croissance ou des signaux directeurs sur FAC et les extrémités barbées libres. Alternativement, placez une boîte pour observation vidéo contenant des cultures neuronales sur la platine chauffée d’un microscope et utilisez une micropipette pour libérer des facteurs de croissance ou des signaux directeurs en gradient devant le cône de croissance neuronal avant de commencer la perméabilisation et l’incorporation de l’actine marquée.Les facteurs de croissance peuvent être introduits pendant aussi peu qu'une à deux minutes avant de commencer la procédure de perméabilisation. La perméabilisation et la fixation peuvent être effectuées tout en laissant la boîte de culture vidéo sur la platine du microscope. Cela permet d'évaluer les effets locaux d'un gradient de signal directeur sur la formation de F ACT et des extrémités barbées libres dans les cônes de croissance.Ce vidéo montre l'expansion rapide de la marge du cône de croissance modal en réponse à l'ajout global de NGF. Lorsqu'un cône de croissance de ganglion racine dorsal est traité de manière globale avec du facteur de croissance nerveux pendant cinq minutes, la polymérisation de l'actine est stimulée au niveau de la marge antérieure et une bande brillante d'incorporation d'actine marquée apparaît autour de la périphérie du cône de croissance. Cette vidéo montre un cône de croissance qui s'oriente vers une micropipette libérant du NGF et créant un gradient de NGF illustré ici.Lorsqu'un côté d'un cône de croissance de ganglion racinaire dorsal est exposé à un gradient de NGF pendant deux minutes, cela stimule localement une augmentation de l'incorporation d'actine R domine dans l'actine F et des extrémités libres pointues. Dans cet exemple, la distribution de la phospho RIN ridin moin est révélée par immunohistochimie. En plus de marquer l'actine F et les extrémités libres pointues par l'incorporation d'actine R domine lorsque le NGF est ajouté de manière globale ici, les neurones du ganglion racinaire dorsal ont été cotransfectés avec l'actine GFP et un construit dominant négatif d'ezrin ridin moisan ; le NGF a été ajouté cinq minutes avant le marquage des extrémités pointues de l'actine F.On remarque que le cône de croissance transfecté avec le construit dominant négatif d'ERM présente peu d'extrémités en épi d'actine F à la marge antérieure du cône de croissance, ce qui contraste avec un cône de croissance voisin non résecté. En combinant cette procédure avec l'immunochimie, la localisation de l'actine F et des bardens peut être mise en relation avec la distribution d'autres protéines régulant la dynamique et l'organisation de l'actine. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire attention à ne pas perturber la structure délicate des cônes de croissance moteurs.

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