Détection des transporteurs de métaux de surface chez Neisseria gonorrhoeae à l’aide de Dot Blot
Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Commencez par une culture de Neisseria gonorrhoeae cultivée dans un milieu appauvri en métaux.
La rareté du métal déclenche l’expression de transporteurs à membrane externe qui initient l’absorption du métal lorsqu’il est disponible.
Placez une membrane de nitrocellulose pré-trempée sur des papiers filtres humides et assemblez l’appareil de transfert de points.
Repérez les cellules bactériennes et laissez le liquide absorber.
Démontez l’appareil, retirez la membrane et faites-le sécher à l’air.
Ajoutez un agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique.
Réinsérez la membrane dans l’appareil, scellez-la avec du parafilm et remontez-la.
Ajoutez un ligand de liaison métallique dérivé de l’hôte et incubez en secouant.
Le ligand se lie aux transporteurs bactériens.
Retirez le liquide et lavez la membrane pour éliminer tout ligand non lié.
Ajoutez un anticorps primaire spécifique au ligand, suivi d’un anticorps secondaire conjugué à une enzyme et d’un réactif de détection colorimétrique qui forme un produit coloré.
Un signal visible indique l’expression de transporteurs de métaux bactériens dans des conditions limitées en métal.
Après l’incubation par doublement de masse, diluez les cultures
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