Détection des transporteurs de métaux de surface chez Neisseria gonorrhoeae à l’aide de Dot Blot

Commencez par une culture de Neisseria gonorrhoeae cultivée dans un milieu appauvri en métaux.

La rareté du métal déclenche l’expression de transporteurs à membrane externe qui initient l’absorption du métal lorsqu’il est disponible.

Placez une membrane de nitrocellulose pré-trempée sur des papiers filtres humides et assemblez l’appareil de transfert de points.

Repérez les cellules bactériennes et laissez le liquide absorber.

Démontez l’appareil, retirez la membrane et faites-le sécher à l’air.

Ajoutez un agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique.

Réinsérez la membrane dans l’appareil, scellez-la avec du parafilm et remontez-la.

Ajoutez un ligand de liaison métallique dérivé de l’hôte et incubez en secouant.

Le ligand se lie aux transporteurs bactériens.

Retirez le liquide et lavez la membrane pour éliminer tout ligand non lié.

Ajoutez un anticorps primaire spécifique au ligand, suivi d’un anticorps secondaire conjugué à une enzyme et d’un réactif de détection colorimétrique qui forme un produit coloré.

Un signal visible indique l’expression de transporteurs de métaux bactériens dans des conditions limitées en métal.

Après l’incubation par doublement de masse, diluez les cultures avec trois volumes de CDM. Ensuite, incubez les cultures à 37 degrés Celsius en secouant pendant quatre heures. Peu avant la marque des quatre heures, coupez trois morceaux de papier filtre et un morceau de nitrocellulose à la taille approximative nécessaire pour tenir dans un appareil à tamponnage.

Pré-trempez la nitrocellulose dans de l’eau déminéralisée pendant environ 10 minutes avant d’assembler l’appareil avec du papier filtre sous la nitrocellulose. À la fin de l’incubation, enregistrez les densités cellulaires et normalisez les densités jusqu’à une densité finale appropriée. Ensuite, pipetez les cultures cellulaires sur la nitrocellulose.

Lorsque le papier filtre a absorbé tout le liquide, démontez l’appareil et laissez sécher le tampon. Bloquez la membrane de nitrocellulose pendant une heure avec une solution de blocage appropriée et remontez l’appareil dot-blot, en remplaçant le papier filtre par un film de paraffine pour créer un joint étanche sous la nitrocellulose. Diluez le ligand de liaison métallique d’intérêt à 0,2 micromolaire dans le bloqueur et sondez les cellules pendant une heure en secouant modérément.

À la fin de l’incubation, siphonnez le liquide sous vide, lavez le transfert et suivez les procédures immunologiques standard pour développer le signal.