Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

Dans cette procédure, un vaccin recombinant exprimant la protéine RBD du SARS-CoV est préparé et sa capacité à induire une activité neutralisante contre un pseudovirus du SARS est évaluée. Premièrement, la protéine RBD est exprimée et purifiée à partir du surnageant de culture de cellules 293T transfectées. La protéine purifiée est ensuite utilisée pour immuniser.

Des souris et des sérums sont prélevés chez les souris vaccinées à différents moments après l'immunisation afin de quantifier le potentiel de neutralisation des sérums immuns. Un dosage de neutralisation par virus pseudotypé est réalisé : un virus pseudo SARS recombinant exprimant la luciférase est produit et incubé avec un sra de bouche titré. Ensuite, la capacité de ces virus neutralisés à infecter des cellules exprimant le co-récepteur ACE du SARS est évaluée en mesurant l'activité relative de la luciférase dans les cellules infectées.

Le titre d'anticorps neutralisant à 50 % peut ensuite être calculé. Je m'appelle tu. Je suis actuellement un postdoctorant dans le laboratoire.

Le principal avantage du test de neutralisation par pseudovirus par rapport aux techniques existantes, telles que les tests de neutralisation basés sur des virus vivants, réside dans son caractère relativement sûr. Cette technique ne nécessite pas de virus SARS infectieux et peut être réalisée dans un laboratoire ne requérant pas un niveau de sécurité 3. Mon nom est en train de démontrer la procédure qui sera effectuée par DU, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, qui s'est concentré sur le développement de vaccins contre les maladies infectieuses émergentes telles que le SARS et la grippe. Décongeler les aliquots de tampon HBS stérile 2X, pH 7, chlorure de calcium 2,5 M, et le plasmide RBD à température ambiante.

Une fois les solutions décongelées, transférez deux millilitres de deux XHBS dans un tube conique de 50 millilitres ; dans un tube de 15 millilitres, mélangez 200 microlitres de chlorure de calcium avec 40 microgrammes de plasmide RBD. Ajustez le volume à deux millilitres à l’aide d’eau distillée stérile à température ambiante, en utilisant une pipette stérile de cinq millilitres. Ajoutez la solution de plasmide aux deux XHBS de manière goutte à goutte, tout en maintenant le mélange sous agitation vortex constante mais douce.

Il est essentiel de maintenir ce vortex lent et continu pour obtenir un précipité de consistance adéquate assurant une efficacité élevée de transfection. Conserver 20 minutes à température ambiante. Après cette incubation, ajouter le mélange goutte à goutte à un flacon contenant des cellules 293T à 50 à 70 % de confluence.

Dans un volume de 40 millilitres de milieu de culture cellulaire, il est important de répartir uniformément la solution de transfection. Mélangez immédiatement le milieu après l'ajout du mélange de transfection. Placez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après huit à dix heures d'incubation, retirez le milieu complet de culture cellulaire et remplacez-le par 50 millilitres de milieu Opti-MEM sans sérum afin d'éviter toute interférence du sérum lors de la purification ultérieure des protéines, puis remettez les cellules dans l'incubateur à 37 °C. Deux jours plus tard, récupérez le surnageant, qui contiendra la protéine RBD exprimée, et centrifugez pendant 15 minutes à 6 000 tr/min pour éliminer les débris cellulaires. Une fois les cellules pelletées, transférez le surnageant dans un tube propre et ajoutez un cocktail d'inhibiteurs de protéases.

Pour éviter la dégradation des protéines, utilisez la résine nickel NTA super flow en suivant les instructions du fabricant afin de purifier la protéine recombinante RBD à partir du surnageant récolté. Éluerez la protéine RBD avec un tampon contenant 250 millimolaire d'OLE. Ensuite, à l'aide de tubes Emon Ultra 15, concentrez la protéine purifiée contenant l'OLE par centrifugation à 3000 tr/min à 4 degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Jetez le flux sortant.

Ajouter du PBS aux tubes de concentration de RBD et centrifuger à nouveau à 3000 tr/min à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Répéter le lavage deux fois. Pour assurer l'élimination complète de l'olé, la protéine purifiée sera maintenant dissoute dans du PBS ; pipeter la protéine dans un tube EOR propre de 1,5 millilitre.

Enfin, calculez la concentration de la protéine purifiée à l’aide d’un NanoDrop en utilisant le PBS comme témoin, puis conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Ajoutez d’abord un millilitre de PBS stérile à un flacon de système adjuvant Sigma. Préchauffez dans un bain-marie à 40 à 45 degrés Celsius et vortexez le flacon soigneusement pendant deux à trois minutes.

Ensuite, préparez l'émulsion de protéine adjuvante dans un tube einor de 1,5 millilitre. Mélangez la quantité souhaitée de protéine purifiée décongelée diluée dans du PBS avec un volume égal de système adjuvant et vortexez vigoureusement pendant deux à trois minutes. Préparez également des émulsions témoins en mélangeant l'adjuvant avec du PBS seul. Par voie sous-cutanée.

Injecter au moins cinq souris BC âgées de quatre à six semaines avec 200 microlitres chacun du mélange d'immunisation initial contenant 20 microgrammes de protéine par dose, ou avec l'émulsion témoin, 21 jours après l'inoculation initiale par voie sous-cutanée. Administrer des doses de rappel contenant 10 microgrammes de protéine dans un volume final de 200 microlitres chacune. Prélever des échantillons sanguins chez chaque souris avant l'immunisation initiale et 10 jours après chaque vaccination, puis conserver le sérum isolé à moins 20 degrés Celsius après chauffage.

Inactivation du complément à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes, 16 heures avant la transfection, plaquez les cellules 293T dans des boîtes de culture tissulaire de 100 millimètres à une densité de 2 millions de cellules par boîte. Préparez le réactif de transfection comme décrit précédemment et transfectez simultanément les cellules avec un plasmide codant pour la protéine S du SARS-CoV-2 et un autre codant pour le génome d'HIV-1 déficient en ENV et exprimant la luciférase. Huit à 10 heures après la transfection.

Remplacer le milieu par 10 millilitres de milieu DMEM frais contenant 10 % de sérum, puis remettre les cellules dans l’incubateur. Deux jours plus tard, récolter le surnageant contenant le pseudovirus SARS. Faire passer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,45 micron pour éliminer les débris cellulaires et aliquoter le virus.

Utiliser immédiatement ou congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure à l’aide d’une plaque de pipette multicanal. Cultiver des cellules 293T exprimant le récepteur ACE2 du SARS-CoV dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits à une concentration de 10 000 cellules par 100 microlitres par puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Utiliser une plaque à 96 puits distincte pour titrer le pseudovirus du SARS exprimant la luciférase recombinante et déterminer la concentration appropriée de virus pour le test de neutralisation dans les rangées A et B de la première plaque.

150 microlitres par puits de DMEM contenant 10 % de FBS. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de virus non dilué aux lignes A1 et B1, puis effectuez une dilution sérielle deux fois par duplication en transférant 150 microlitres des puits de la ligne 1 vers les puits de la ligne suivante, et ainsi de suite jusqu’à la ligne 11. Jetez les derniers 150 microlitres et n’ajoutez pas de virus à la ligne 12.

Une fois la dilution en série effectuée et après une incubation des cellules T ACE 2 93 pendant 16 heures, infecter les cellules en transférant 100 microlitres de chaque puits de la plaque virale vers le puits correspondant de la plaque contenant les cellules. Incuber les cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius afin de permettre aux virus d'entrer dans les cellules. Déterminer le niveau d'infection dans chaque puits en lisant la plaque à l'aide d'un luminomètre ultra 3 84.

La quantité d'infection est proportionnelle à l'intensité de l'activité de la luciférase. La concentration de virus pour laquelle l'unité relative de luciférase est d'environ mille fois supérieure à l'unité relative de luciférase (RLU) de fond des cellules seules dans la colonne 12 sera utilisée dans le test de neutralisation. Préparez d'abord la neutralisation dans une plaque séparée de 96 puits à l'aide d'une pipette multipuits en ajoutant 150 microlitres de D-M-E-M contenant 10 % de S-F-B à la colonne 1 et 120 microlitres aux puits des autres colonnes.

Ensuite, ajoutez trois microlitres de chaque sérum de souris à tester dans des puits dupliqués de la colonne un. Dans cet exemple, les deux premiers puits contiennent du sérum dilué 50 fois provenant d'une souris immunisée avec la RBD. Les deux suivants contiennent du sérum d'une deuxième souris immunisée avec la RBD, et les quatre derniers puits contiennent du sérum de deux animaux contrôles immunisés au PBS. À l'aide d'une pipette multicanal, effectuez une dilution sériée cinq fois en transférant 30 microlitres depuis tous les puits de la première colonne vers les puits de la deuxième colonne, et répétez ce processus jusqu'à la colonne 11.

Jetez les 30 microlitres restants et laissez les puits de la colonne 12 sans sérum. Ensuite, ajoutez 120 microlitres par puits d'un pseudovirus SAR dilué dans chacun. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure afin que les anticorps anti-RBD présents dans le sérum de souris puissent se lier au pseudovirus SARS et l'neutraliser.

Après cette incubation, transférez 100 microlitres de virus neutralisé de chaque puits vers les puits correspondants de la plaque 96 puits contenant les cellules 293T exprimant ACE2. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures afin de permettre l'infection. Une fois les cellules infectées, retirez le milieu à l’aide d’une pipette multicanal et remplacez-le par 100 microlitres de milieu frais par puits.

Remettez la plaque dans l’incubateur après 72 heures à 37 degrés Celsius. Retirez à nouveau le surnageant. À ce stade, tout pseudovirus qui n’a pas été neutralisé par le sérum de souris devrait avoir pu infecter les cellules à l’aide d’une pipette multicanal. Ajoutez 60 microlitres par puits d’un réactif de lyse de culture cellulaire luciférase.

Placez la plaque sur un agitateur à température ambiante et laissez les cellules lysées pendant une à deux heures. Une fois les cellules lysées, transférez 50 microlitres des lysats cellulaires dans une plaque de luminomètre à 96 puits et ajoutez 50 microlitres par puits de substrat de luciférase. Utilisez un luminomètre Ultra 3 84 configuré en mode luminescence pour plaques 96 puits pour lire la plaque et évaluer de manière relative l'activité de la luciférase dans les différents puits, à partir de laquelle le pourcentage de virus neutralisé peut être déduit.

Ces données montrent que le pourcentage de neutralisation du virus obtenu est proportionnel à la concentration du sérum provenant de souris immunisées avec la RBD. En revanche, le sérum d'animaux injectés avec du PBS ne parvient pas à neutraliser le virus, quelle que soit la concentration, d'après ces données. Le NT50, ou la dilution sérique à laquelle 50 % du virus est neutralisé, peut être facilement déterminé.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la confiance et la patience sont essentielles pour la réussite des expériences. Après avoir visionné ces vidéos, vous devriez mieux comprendre comment exprimer un vaccin recombinant contre le SARS dans des cellules mammaires, et comment déterminer la capacité d'induire une réponse en anticorps neutralisants dans des modèles murins.