Name: Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Découvrez la préparation de vaccins recombinants RBD contre le SRAS, l'immunisation de souris et l'évaluation de la neutralisation par pseudovirus. Cette méthode permet d'induire des anticorps neutralisants protecteurs.

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Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (RO1 AI68002).

1. Recombinante Préparation du SARS-CoV protéines RBD <ol><li> Préparer réactif de transfection de phosphate de calcium <ol><li> Préparation de 2X tampon HBS: Mélanger 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, et 13,0 g d&#39;HEPES. Ajuster le pH à 7,00 et amener le volume total à 1000 ml d&#39;eau distillée. Après filtration de la solution pour la stérilisation, aliquote et le stocker à -20 ° C. Astuce: Toute variation de la valeur du pH aurait une incidence sur les résultats de la transfection. Ainsi, il est conseillé de tester plusieurs valeurs de pH autour de 7,00 (par exemple, 6,99, 7,00, ou 7,01) et de trouver le meilleur pour la transfection en utilisant la méthode présentée ci-dessous. </li><li> 2,5 M CaCl 2 préparation: Ajouter 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O à l&#39;eau distillée dans un volume final de 200 ml. Filtrer la solution et conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Recombinant transfection plasmidique et purification des protéines recombinantes <ol><li> Fractionner les cellules 293T à 50-70% de confluence 24 h avant la transfection. Cultiver des cellules de T-175 cm 2 flacons de culture tissulaire dans 40 ml de DMEM contenant 10% inactivés par la chaleur (HI) FBS et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Tous les réactifs de transfection devrait être porté à la température ambiante avant la transfection. Ces réactifs comprennent 2X HBS, 2.5M CaCl 2, Dih 2 O, et rRBD 6 plasmide. Astuce: Le plasmide final recombinant de construction utilisé pour l&#39;expression protéique doit contenir un peptide signal pour assurer la sécrétion de protéines recombinantes exprimées dans le surnageant de culture. Un 6x Son étiquette peut être ajoutée à la C-terminale de la protéine exprimée pour la purification facile. </li><li> Préparer un 50 ml (A) et un 15 ml (B) BD Falcon tube, et ajouter des réactifs dans les tubes comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter 2X tampon HBS à A. Dans le tube tube B, ajouter 2,5 M CaCl 2 et rRBD plasmide, et de porter le volume à l&#39;exigence de Dih 2 O. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. Un T-175 cm 2 flacon de culture tissulaire (4000 ul / flacon): se préparer pour l&#39;expression rRBD </td></tr><tr><td colspan="2"> Un tube </td><td colspan="2"> Le tube B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 2000 uL </td><td> 2,5 M CaCl 2 </td><td> 200 uL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> rRBD ADN plasmidique </td><td> 40 ug </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O </td><td> 2000 uL </td></tr><tr><td colspan="4"> B. Une de 100 mm boîte de Petri (1000 ul / plat): se préparer pour la production pseudovirus SRAS </td></tr><tr><td colspan="2"> Un tube </td><td colspan="2"> Le tube B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 500 ul </td><td> 2,5 M CaCl 2 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ADN plasmidique S SRAS-CoV </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td></td><td></td><td> VIH-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE) </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Préparation du mélange de transfection et les volumes Les volumes indiqués dans le tableau 1 sont pour une unité de transfection. Si plus des flacons ou des plats sont utilisés pour la transfection, ajuster les volumes en conséquence. </li><li> Ajouter la solution d&#39;ADN et de calcium dans le tube B dans le tube A dans un goutte à goutte, tout en maintenant constante et douce de mélange dans un tourbillon. Laissez reposer le mélange à la température ambiante pendant 20-30 min. La clé pour la transfection de phosphate de calcium succès dépend de la taille et la forme du précipité formé. Ainsi, le mélange doit être constamment vortexé et lentement pour répondre à cette exigence et, par conséquent, d&#39;améliorer l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Ajouter le mélange goutte à goutte, et même dans les cellules 293T (4000 ul / flacon). Cellules en culture dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Remplacez le milieu de culture avec des produits frais sans sérum OPTI-MEM-je réduite Sérum Medium (50 ml / flacon) 8-10 h post-transfection. Continuer à cultiver des cellules pour deux jours de plus dans le même état. </li><li> Recueillir le surnageant contenant la protéine exprimée rRBD 72 h post-transfection. Centrifuger à 6000 rpm pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires. Ajouter un cocktail inhibiteur de protéase pour le surnageant collecté et stocker à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, purifier rRBD protéine recombinante à partir du surnageant de culture en utilisant les instructions du fabricant Superflow Ni-NTA suivante. </li><li> Concentré protéine purifiée en utilisant des tubes ultra concentration Amicon -15. Après la concentration de protéines,Ajouter PBS à la concentration des tubes et centrifuger à nouveau pour enlever l&#39;imidazole dans le tampon d&#39;élution. Calculer la concentration de protéines et de stocker des protéines purifiées à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li></ol> 2. Immunisation de souris et de prélèvement d&#39;échantillons <ol><li> Préchauffer Sigma adjuvant System (SAS) à 40-45 ° C selon les instructions du fabricant. Ajouter 1 ml de PBS par flacon et bien mélanger. </li><li> Préparer protéines adjuvant émulsion selon le protocole dans le tableau 2. Pipeter calculée protéines rRBD dans un tube de 1,5 ml. Ajouter un volume égal de SAS adjuvant dans le tube et vortexer vigoureusement pendant 2-3 min pour former l&#39;émulsion. Astuce: Les volumes indiqués dans le tableau 2 sont pour une souris. Ajustez le volume en fonction du nombre de souris utilisées réelle. Pour chaque groupe, mélanger les protéines et de l&#39;adjuvant nécessaire pour chaque vaccin. Toujours préparer un échantillon supplémentaire pour la vaccination pour assurer l&#39;exactitude. <table border="1"><tbody><tr><td> Groupe </td><td> 1 er vaccins (200 ul / souris) </td><td> 2 ème vaccin (200 ul / souris) </td><td> 3 ème vaccin (200 ul / souris) </td></tr><tr><td> protéines rRBD </td><td> 20 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS </td><td> 10 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS </td><td> 10 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS </td></tr><tr><td> PBS de contrôle </td><td> 100 ul de PBS + 100 uL SAS </td><td> 100 ul de PBS + 100 uL SAS </td><td> 100 ul de PBS + 100 uL SAS </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Protocole d&#39;immunisation de la souris </li><li> Sous-cutanée en prime-vacciner les femmes souris Balb / c (4-6 semaines, 5 souris / groupe), et de stimuler deux fois avec rRBD et SAS comme indiqué au tableau 2. Utilisez PBS groupe comme le contrôle. Le site d&#39;injections sous-cutanées généralement choisi est la peau lâche entre les omoplates. Alternativement, l&#39;abdomen ventral est couramment utilisé, car il est plus facile à injecter, et peut observer des fuites provenant des sites d&#39;injection. Lorsque des doses répétées de vaccins sont utilisés, il est facile de sélectionner des sites d&#39;injection différents, empêchant le potentiel des réactions cutanées locales. </li><li> Purger souris par rétro-orbitale avec anesthésie avant l&#39;immunisation et 10 jours après chaque vaccination, et la chaleur des sérums à 56 ° C pendant 30 min pour inactiver le complément. Magasin de sérums de souris à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Détection de neutralisation utilisant test de neutralisation pseudovirus <ol><li> Préparer pseudovirus SRAS <ol><li> Fractionner les cellules 293T en 100 mm plats de Pétri de culture tissulaire (2x10 6 cellules / boîte) 16 h avant la transfection, et cultiver des cellules comme ci-dessus. </li><li> Préparer des réactifs de transfection, comme indiqué dans le tableau 1. Co-transfection un plasmide codant pour le SRAS-CoV protéine S et d&#39;un plasmide codant pour Env-défectueux, la luciférase exprimant génome VIH-1 (pNL4-3.luc.RE) en utilisant le réactif de transfection de phosphate de calcium. </li><li> Remplacer moyenne avec 10 ml DMEM frais contenant 10% de FBS et 1% P / S 8-10 h post-transfection. Recueillir le surnageant contenant pseudovirus SRAS 72 h post-transfection. </li><li> Pseudovirus Filtrer à travers un filtre de 0,45 um. Aliquoter et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Dosage de SRAS neutralisation pseudovirus <ol><li> Fractionner les cellules 293T exprimant des récepteurs du SARS-CoV ACE2 (ACE2/293T) à 10 4 cellules/100 ul / puits de plaques de 96 puits de culture de tissus 16 h avant l&#39;infection. </li><li> Diluer pseudovirus SRAS en deux volets afin de détecter le titre du virus dans les cellules ACE2/293T. </li><li> Série diluer sérums de souris dans les plaques de 96 puits de culture tissulaire, et ajouter un volume égal de pseudovirus SRAS titré. Préincuber les plaques à 37 ° C pendant 1 h. </li><li> Après incubation, ajouter 100 ul du mélange de sérums-pseudovirus aux cellules ACE2/293T, et de continuer à cultiver des cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2. Ajouter DMEM frais 24 h plus tard. </li><li> Supprimer complètement les surnageants de culture à partir des plaques de 72 h post-infection. Ajouter 1X réactif luciférase lyse cellulaire de la culture (60 ul / puits), et de promouvoir la lyse cellulaire avec agitation constante de plaques pendant 1-2 heures à température ambiante. </li><li> Lysats de cellules de transfert (50 ul / puits) en plaques luminomètre (Microfluor plaques de 96 puits). Ajouter un substrat luciférase (50 ul / puits) inclus dans le système de dosage de la luciférase, et de détecter relativement activité luciférase dans les Ultra 384 luminomètre. </li><li> Calculer titre SRAS neutralisation pseudovirus et présents sous le titre d&#39;anticorps neutralisant 50% (NT 50) 6. </li></ol></li></ol>

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<li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca%282%2B%29-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li>
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</ol>

La densité cellulaire est un facteur important affectant l&#39;efficacité du phosphate de calcium à base de transfection. Dans notre expérience, moins de 70% de confluence des cellules apporte les meilleurs résultats. Ainsi, afin d&#39;améliorer l&#39;efficacité de transfection, il est recommandé que la densité cellulaire sera maintenu à environ 50-70% de confluence. La méthode de transfection de phosphate de calcium est généralement considéré comme moins efficace par rapport aux méthodes de transfection d&#39;autres, tels que 16 transfection des lipides. Toutefois, dans ce protocole, nous avons utilisé une méthode de calcium de phosphate modifiés transfection lequel constante et lente de mélange de la solution de transfection dans un vortex assure la formation d&#39;un précipité avec la taille et de forme appropriées, améliorant ainsi l&#39;efficacité de la transfection.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12430</td><td></td></tr><tr><td>SFBS inactivé</td><td>Invitrogen</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Milieu OPTI-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de protéase</td><td>Roche Group</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30450</td><td></td></tr><tr><td>Système adjuvant Sigma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6322</td><td></td></tr><tr><td>Système de dosage de la luciférase</td><td>Promega Corp.</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de lyse pour culture cellulaire à la luciférase (5X)</td><td>Promega Corp.</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra - 15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Microfluor 96-puits</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7905</td><td></td></tr><tr><td>Luminomètre Ultra 384</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocole pour vaccins recombinants contre le sras rbd-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Basé sur leur profil d&#39;innocuité et sa capacité à induire des réponses immunitaires contre les infections, vaccins sous-unitaires ont été utilisés comme des candidats pour une grande variété de pathogènes 1-3. Puisque le système de cellules de mammifères est capable de modifications post-traductionnelles, formant ainsi des protéines correctement repliées et glycosylée, protéines recombinantes exprimées dans les cellules de mammifères ont montré le plus grand potentiel pour maintenir l&#39;antigénicité et l&#39;immunogénicité élevée 4-6. Bien qu&#39;aucun nouveau cas de SRAS ont été rapportés depuis 2004, de futures éclosions sont une menace constante, par conséquent, le développement de vaccins contre le SRAS-CoV est une étape prudente et préventive doit être effectuée. Les RBD de la protéine S SRAS-CoV joue un rôle important dans la liaison aux récepteurs spécifiques et l&#39;induction d&#39;anticorps neutralisants contre 7-9 infection par le virus. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons de nouvelles méthodes pour développer un vaccin sous-unité RBD-Unis contre le SRAS. En bref, la protéine recombinante RBD (rRBD) a été exprimée dans le surnageant de culture de cellules de mammifères 293T d&#39;obtenir une protéine correctement repliée avec une conformation correcte et l&#39;immunogénicité élevée 6. La transfection du recombinant plasmide codant pour RBD aux cellules a été ensuite effectuée en utilisant une méthode de transfection de phosphate de calcium 6,10 avec quelques modifications. Comparativement à la méthode de transfection des lipides 11,12, cette méthode de calcium de phosphate modifiés transfection est moins cher, plus facile à manipuler, et a le potentiel pour atteindre une grande efficacité une fois complexes de transfection avec une taille convenable et la forme est formée 13,14. Enfin, un test de neutralisation du SRAS pseudovirus été introduite dans le protocole et utilisé pour détecter l&#39;activité neutralisante des sérums de souris vaccinées avec la protéine rRBD. Ce dosage est relativement sûr, n&#39;implique pas une maladie infectieuse du SRAS-CoV, et peut être effectuée sans l&#39;exigence d&#39;un laboratoire de biosécurité 3 15. Le protocole décrit ici peut également être utilisé pour la conception et l&#39;étude des vaccins sous-unitaires recombinants contre d&#39;autres virus avec des protéines de fusion de classe I, par exemple, le VIH, le virus respiratoire syncytial (VRS), virus Ebola, virus de la grippe, ainsi que les virus Nipah et Handra. En outre, les méthodes pour générer une pseudovirus et ensuite établir un test de neutralisation pseudovirus peut être appliquée à tous ces virus.

Ce protocole décrit une procédure générale pour l&#39;étude de liaison au récepteur recombinant domaine (RBD) basé vaccins sous-unitaires contre le SRAS. Il inclut des méthodes pour la transfection et l&#39;expression des protéines dans les cellules 293T RBD, l&#39;immunisation de souris avec RBD et la détection de l&#39;activité de neutralisation de sérums de souris en utilisant un dosage établie SRAS neutralisation pseudovirus.

Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

En raison de leur profil d'innocuité et de leur capacité à induire des réponses immunitaires puissantes contre les infections, les vaccins sous-unitaires ont été utilisés comme candidats pour un large...

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Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

Une méthode détaillée est fournie ici décrivant la purification, le repliement et la caractérisation des nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPN) pour le développement de vaccins.

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

La génération de rotavirus recombinants à partir de l’ADN plasmide fournit un outil essentiel pour l’étude de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, et le développement de vecteurs et de vaccins d’expression de rotavirus. Ici, nous décrivons une approche simplifiée de génétique inverse pour générer des rotavirus recombinés, y compris des souches exprimant des protéines fluorescentes de reporter.

Méthode simplifiée de génétique inversée pour récupérer les rotavirus recombinés exprimant des protéines reporter

Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2

La méthodologie décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) et leur application pour l’évaluation in vitro de candidats antigéniques au cours du développement de vaccins vétérinaires potentiels chez les bovins.

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Les virus pseudotypés (PV) sont des virions défectueux de réplication qui sont utilisés pour étudier les interactions hôte-virus dans des conditions plus sûres que la manipulation de virus authentiques. Nous présentons ici un protocole détaillé qui montre comment les PV du SRAS-CoV-2 peuvent être utilisés pour tester la capacité de neutralisation du sérum des patients après la vaccination contre la COVID-19.

Virus pseudotypés en tant qu’outil moléculaire pour surveiller les réponses immunitaires humorales contre le SRAS-CoV-2 via un test de neutralisation

Découvrez la préparation de vaccins recombinants RBD contre le SRAS, l'immunisation de souris et l'évaluation de la neutralisation par pseudovirus. Cette méthode permet d'induire des anticorps neutralisants protecteurs.

Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation (Vidéo) | JoVE Journal

Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

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