Name: Combinant colorant lipophile, In situ, immunohistochimie et lhistologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Découvrez une combinaison de techniques pour optimiser l'analyse de tissus murins : colorant lipophile, hybridation in situ, immunohistochimie et histologie. Cette méthode permet de corréler mutations génétiques, morphologie et expression.

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Confocale images ont été obtenues à l&#39;Université de l&#39;Iowa Carver Centre d&#39;Imagerie. Le financement a été fourni par une subvention SBIR (MH079805) à BF soutien supplémentaire pour la reproduction des souris pour ce projet a été fourni par NIDCD (5R01DC00559007) au BF

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

Souris tissus ont été recueillis en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université de l&#39;Iowa Soins des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation (ACURF 0804066).

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour combiner quatre techniques en vue de maximiser la collecte des données et la cohésion en corrélant les données au sein d&#39;un animal donné (figure 3). Cette approche permettra de réduire le montant de l&#39;élevage et donc du temps nécessaire pour obtenir des données publiables, tout en améliorant l&#39;information sur la co-localisation et des effets corrélatifs de mutants. Bien que les souris embryonnaires ont été utilisées dans cette vidéo, souris adultes ainsi que d&#39;autres animaux comme le poulet, xénope, poisson zèbre et peuvent être analysés en utilisant ces techniques aussi bien. Lors de l&#39;utilisation d&#39;autres espèces protéinase K digestion peut être nécessaire de modifier. Ici, nous utilisons différents colorants fluorescents NeuroVue spécifiquement l&#39;étiquette jusqu&#39;à trois populations de neurones d&#39;intérêt. L&#39;avantage de ces colorants est qu&#39;elles peuvent être utilisées dans des souris mutantes, qui peut être problématique lorsque s&#39;appuyant uniquement sur ​​l&#39;immunohistochimie qui peuvent ou peuvent ne pas être affectés par les mutations à analyser, et ils l&#39;étiquette neurones rétrograde et anterogradely 5. Une étude récente a également augmenté le nombre de populations de neurones qui peuvent être étiquetés simultanément à six 2. Après, le colorant lipophile traçage du même tissu d&#39;intérêt peuvent alors être analysés en utilisant l&#39;hybridation in situ, pour l&#39;analyse de la transcription du gène et peuvent être ensuite analysées par immunohistochimie pour la distribution des protéines. Cette dernière analyse peut être complétée par l&#39;histologie détaillée qui peut ajouter à la caractérisation phénotypique 6. Cette analyse multifactorielle a le potentiel d&#39;acquérir de nouvelles connaissances à travers l&#39;analyse corrélative au sein du même animal qui pourrait autrement être improbable ou moins dans le besoin de protocoles plus vaste et la reproduction de la souris.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; Hybridation :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC DIG lavage + blocage tampon ensemble</td><td>Roche Group</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Tampon SSC 20x pré-mélangé</td><td>Roche Group</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Diéthyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Dextrane sulfate</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple </td><td>Roche Group</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Fragments Fab anti-Dig-AP</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>enzyme RNase A 10 mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>ADN de sperme de saumon 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration Stericup 0,22&amp;mu;m ; 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Disques filtrants 0,2&amp;mu;m ; 25 mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Sachets de solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Immunohistochimie :&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst Colorant</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Histologie :&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu d'inclusion Poly/Bed 812/DMP-30 </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde 50 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage DPX</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur rotatif</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur réglé à 60&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Traçage par colorant&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microciseaux</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>Colorant NeuroVue : Marron, Rouge, Jade</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Dissection du champ d'application</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur réglé à 36&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Lames porte-lames</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>Glycérol</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (4 % et 0,4 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

combinant colorant lipophile, in situ</emhybridation>, immunohistochimie et l&#39;histologie

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Au-delà de la fonction du gène simple de couper profondément dans les réseaux de régulation génétique nécessite de multiples mutations combinées dans un seul animal. Une telle analyse de deux ou plusieurs gènes doit être complétée par hybridation in situ d&#39;autres gènes, ou immunohistochimie de leurs protéines, en tout monté organes en développement ou des sections pour la résolution détaillée des altérations de l&#39;expression cellulaire et tissulaire. Combinant des altérations de gènes multiples nécessite l&#39;utilisation de la CRE ou au conditionnel flipase supprimer les gènes et d&#39;éviter la létalité embryonnaire. Les schémas de sélection requis améliorer considérablement les efforts et le coût proportionnel au nombre de gènes mutés, avec un résultat de très peu d&#39;animaux avec le répertoire complet des modifications génétiques souhaitées. Amortir la vaste quantité d&#39;efforts et de temps pour obtenir ces quelques spécimens précieux, qui sont porteuses de mutations multiples nécessite l&#39;optimisation des tissus. Par ailleurs, une enquête sur un seul animal avec des techniques multiples, il est plus facile de mettre en corrélation des défauts délétion du gène avec des profils d&#39;expression. Nous avons développé une technique pour obtenir une analyse plus approfondie d&#39;un animal donné, avec la capacité d&#39;analyser plusieurs structures histologiquement identifiable ainsi que l&#39;expression des gènes et des protéines tout à partir du même échantillon dans les deux organes tout monté et sections. Bien que les souris ont été utilisés pour démontrer l&#39;efficacité de cette technique, il peut être appliqué à un large éventail d&#39;animaux. Pour ce faire, nous combinons lipophiles colorant de traçage, monter toute l&#39;hybridation in situ, immunohistochimie et l&#39;histologie pour extraire la quantité maximale possible de données.

Une combinaison de différentes techniques pour optimiser la collecte des données à partir de tissus de la souris est présentée.

Combinant colorant lipophile, In situ</emHybridation>, immunohistochimie et l&#39;histologie

Pour aller au-delà de la fonction d'un seul gène et approfondir l'étude des réseaux de régulation génique, il est nécessaire de combiner plusieurs mutations chez un même animal. Une telle analyse de...

Aller au-delà de la fonction d'un seul gène et analyser les réseaux de régulation génique nécessite plusieurs mutations dans un même animal. Dans ce système, nous optimisons la quantité de données générées à partir d'un seul tissu afin de corréler les mutations génétiques avec les profils morphologiques et d'expression. Cela est réalisé en injectant d'abord un colorant lipophile pour visualiser plusieurs populations neuronales distinctes.L'hybridation in situ double est réalisée afin de visualiser le profil spatio-temporel des transcrits géniques. Alors que l'immunohistochimie reflète des profils spécifiques d'expression protéique, la dimension supplémentaire apportée par l'histologie en coupes contribue à la caractérisation du phénotype. Ce système expérimental permet d'analyser plusieurs structures histologiquement reconnaissables, ainsi que l'expression des gènes et des protéines, à partir d'un même spécimen, aussi bien en préparations entières montées qu'en coupes. Nous décrivons un système combinant le traçage par colorant lipophile et l'hybridation C double, l'immunohistochimie et l'histologie.Cette technique permet de maximiser l'information obtenue à partir d'un seul spécimen tout en corrélant la morphologie à l'expression des gènes et des protéines. Pour toutes les dissections et manipulations de tissus, fixer les animaux dans du paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate 0,1 molaire par perfusion transcardiale à l’aide de pompes péristaltiques équipées d’aiguilles de taille appropriée. Étant donné que les DY sont photosensibles, les conserver dans un compartiment fermé et à l’abri de la lumière, et pour éviter toute contamination croisée, réserver un jeu d’instruments distinct pour manipuler chaque colorant sous un microscope stéréoscopique.Déterminez un site d'application du colorant pour marquer de façon sélective la population neuronale considérée, sans affecter d'autres structures accessoires. Retirez les tissus accessoires afin de confirmer visuellement le site choisi et d'assurer un accès permettant le positionnement du colorant. Découpez maintenant les bandes de filtre préchargées en colorant Neuro View en morceaux triangulaires de taille appropriée à l’aide de ciseaux microchirurgicaux.Veillez à découper un morceau aussi petit que possible afin d'éviter l'étiquetage d'autres structures lors de l'insertion dans les tissus mous, comme le cerveau directement. Insérez le filtre en utilisant une pointe du triangle du filtre pour percer le tissu. Pour les tissus plus rigides, faites une incision afin de faciliter l'insertion du D. N'utilisez pas une aiguille de dissection pour enfoncer le filtre dans le tissu.Placer les échantillons dans un flacon fermé hermétiquement contenant du paraformaldéhyde à 4 % et incuber à 36 degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant deux à quatorze jours, selon l'âge et la distance de diffusion à parcourir. À l'aide d'un microscope stéréoscopique avec fluorescence épi, vérifier que le colorant a diffusé jusqu'à l'emplacement souhaité, puis disséquer le tissu d'intérêt. Montrer l'échantillon sur une lame à l'aide de glycérine pour l'observation au microscope confocal.Après l'acquisition d'images des yeux lipophiles sur le microscope confocal, transférez les échantillons dans un tube eppendorf de deux millilitres sans ARN contenant du PBS sans ARN, afin de rincer systématiquement le glycérol. Traitez les échantillons par déshydratation et réhydratation à l'aide d'une série progressive de méthanol à quatre degrés Celsius. Commencez par une incubation dans du méthanol à 100 % pendant au moins une heure, puis réduisez progressivement jusqu'à 25 % de méthanol pendant 15 minutes.Laver trois fois dans du PBS 1x pendant cinq minutes chaque fois. Digérer le tissu avec deux microlitres de protéinase K à 20 milligrammes par millilitre en solution mère dans deux millilitres de PBS frais. Surveiller la réaction de digestion par le changement d'opacité du tissu, passant d'un aspect opaque à presque transparent.Afin d'arrêter la digestion enzymatique, incuber les échantillons dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant cinq minutes. Rincer ensuite une fois avec du PBS pendant une minute, suivie de trois rinçages de cinq minutes chacun. Jeter le dernier rinçage au PBS en veillant particulièrement à éliminer autant que possible le liquide, comme étape préalable à l'hybridation.Incuber les échantillons dans 1,8 millilitre d'hybridation. Mélanger pendant une heure à 60 degrés Celsius sur un inverseur, dénaturer l'ADN de sperme de saumon par incubation à 85 degrés Celsius pendant 10 minutes puis placer sur de la glace, ajouter 200 microlitres d'ADN simple brin dénaturé et environ 100 nanogrammes de riba marquée par DIG. Ajouter la sonde à chaque échantillon et réaliser l'hybridation toute la nuit à 60 degrés Celsius dans un four d'hybridation.Traitez les échantillons par trois lavages de 10 minutes chacun avec du SSC 2× à 60 degrés Celsius dans l’étuve d’hybridation. Il est important d’éliminer toute activité de phosphatase alcaline endogène par un lavage avec du SSC 2× pendant 60 minutes à 70 degrés Celsius dans un bloc chauffant à température contrôlée. Lavez les échantillons avec du PBS pendant cinq minutes.Remplacez maintenant le PBS et ajoutez un microlitre de 10 milligrammes par millilitre d'ARNs A, puis incubez pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius dans un bloc chauffant ISO temp. Éliminez le PBS contenant les ARNs A et lavez trois fois avec la solution de lavage, 10 minutes à chaque fois.Enfin, chauffez et activez les ARN restants par une incubation de 60 minutes à 70 degrés Celsius dans un bloc chauffant ISO. La dernière étape consiste à visualiser la sonde ribo. Incubez les échantillons dans un tampon de blocage à une fois pendant une heure.Jetez le tampon de blocage et ajoutez deux millilitres de tampon de blocage contenant un microlitre d'anticorps anti-ditch à chaque échantillon. Incubez toute la nuit, puis lavez plusieurs fois avec du tampon de lavage à une fois, comme indiqué. Incubez ensuite les échantillons dans du tampon de lavage à une fois pendant toute la nuit.Rincez les échantillons avec du tampon de détection 1 fois pendant 10 minutes et transférez les échantillons dans une plaque de culture. Jetez le tampon et révélez la couleur avec BM purple, car BM.Purple est sensible à la lumière. Couvrez avec du papier d’aluminium ou une boîte lorsque l’intensité du signal souhaitée est obtenue.Rincez les échantillons avec un volume de tampon de détection dans les puits pendant cinq minutes. Observez les échantillons par microscopie en transmission ou conservez-les dans du paraformaldéhyde 4 % à quatre degrés Celsius. Éliminez les colorants lipophiles du tissu à l’aide d’une série graduée d’éthanol si nécessaire.Ensuite, réhydratez le tissu en ajoutant progressivement du PBS pendant cinq à dix minutes. Bloquez maintenant le tissu pendant une heure dans un mélange contenant 2,5 % de sérum de chèvre normal et 0,5 % de Triton X-100, à température ambiante, sur un agitateur. Incubez avec l'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage pendant 48 heures à quatre degrés Celsius sur un agitateur. Lavez trois fois avec du PBS, une heure à chaque fois. Bloquez à nouveau les échantillons, puis incubez avec l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome, dilué dans la solution de blocage, pendant 12 à 24 heures à quatre degrés Celsius sur un agitateur. À partir de ce stade, il convient de protéger les échantillons de la lumière, car les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière.À nouveau, lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant une heure chacun. Enfin, analysez les spécimens par imagerie en microscopie épifluorescente et confocale. L'inclusion en résine époxy et la sectionnement nécessitent une fixation du tissu dans du GLUTARALDÉHYDE 2,5 % et du PFA 1 % dans un tampon phosphate 0,1 M, généralement toute une nuit dans un flacon d'échantillonnage en verre ; déshydratez le tissu par des incubations dans de l'éthanol à concentrations croissantes, puis passez aux solvants par une incubation dans un mélange un pour un d'éthanol absolu et d'oxyde de propylène pendant cinq minutes, suivie de cinq lavages de dix minutes dans de l'oxyde de propylène seul ; ensuite, infiltrez l'échantillon avec de la résine par une simple incubation dans un mélange un pour un d'oxyde de propylène et de résine, toute une nuit sur un agitateur.Verser la solution contenant l'échantillon dans un moule d'inclusion plat et laisser reposer sur le plan de travail pendant quatre à six heures afin que l'oxyde de propylène s'évapore. Transférer les échantillons dans de la résine à 100 % pendant quatre heures dans le moule final. Inclure les échantillons dans la résine et apposer une étiquette.Laisser polymériser la résine en incubant à 60 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Afin de minimiser l'excès de résine, façonner le bloc de résine avec une lame de rasoir selon les besoins. Sur un ultramicrotome.Découpez des sections séries d'un à deux micromètres, montez-les et observez les échantillons à l'aide d'une microscopie en transmission et en épifluorescence. Différentes longueurs d'onde de colorants lipophiles peuvent faciliter la visualisation des projections centrales de trois nerfs crâniens distincts. Ici, le colorant lipophile est déposé dans les parties périphériques des nerfs trijumeau, glossopharyngien et vague.Après une incubation permettant la diffusion du colorant, les prolongements centraux du nerf vers le tronc cérébral sont visualisés par microscopie en champ clair. Lorsque le cerveau postérieur est disséqué et monté à plat, un marquage de certains prolongements centraux des trois nerfs marqués est clairement visible. En microscopie en champ clair, le microscope confocal permet une visualisation en trois dimensions où des structures spécifiques sont illuminées, et l'utilisation de trois colorants différents permet d'évaluer la répartition de chacune des populations.Par rapport aux autres, ici, les afférents de l'oreille interne sont tracés chez une souris nouveau-née par neurovision. En rouge dans C, une hybridation in situ pour Prox1, et une combinaison d'immunoréactivité anti-tubuline et anti-Prox1 permettent de visualiser les afférents.En outre, une coupe d'épaisseur de deux micromètres en résine époxy permet d'obtenir une image de l'oreille interne en coupe transversale. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de choisir soigneusement l'emplacement du colorant lipophile. Une bonne compréhension de la neuroanatomie sera utile dans ce processus ; veillez également à être prudent lors de toutes les étapes sensibles à la lumière.Cette procédure réduira la quantité de reproduction et le temps nécessaire pour obtenir des données publiables, tout en améliorant les informations sur la colocalisation et les effets de recouvrement chez les mutants.

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