Name: Isolement mitochondriale du muscle squelettique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Apprenez l'isolement des mitochondries du muscle squelettique chez le rat et la mesure de leur respiration par polygraphie. Cette méthode permet d'évaluer la consommation d'oxygène dans différents états respiratoires.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Institut national des yeux (R01 EY12998) à FH Andrade.

1. Préparation des tampons <ol><li> Allumez 5804R centrifugeuse et fixé à 4 ° C. Tourner sur le bain d'eau Isotemp 3006D et mettre à 37 ° C. </li><li> Préparer les solutions suivantes avant l'isolement du muscle: <ul><li> PBS: dissoudre tampon phosphate salin (PBS) comprimés dans de l'eau distillée (5 comprimés / litre). Mélangez bien. </li><li> PBS + 10 mM EDTA: Pour préparer une solution de 100 ml, ajouter 2 ml d'EDTA 500 mM à 98 ml de PBS. </li><li> 8X tampon Mitochondries: 10,28 g de saccharose pour une concentration finale de 0,6 M, 400 mg d'acides gras libres de sérum albumine bovine (BSA) pour une concentration finale de 0,8%, 2,08 g d'HEPES pour une concentration finale de 160 mM, pH à 7,4 et QS à 50 ml d'eau distillée. </li><li> Une mémoire tampon d'isolement (IB1): Ajouter 200 ul d'EDTA 500 mM pour une concentration finale de 10 mM, 0,392 g de D-mannitol pour une concentration finale de 215 mM, 1,25 ml de 8X, pH à 7,4 mitochondries et QS à 10 ml d'eau distillée. </li><li> 2 tampons Isolement (IB2): Ajouter 60 ul de 500 mM EGTA pour une concentration finale de 3 mM, 0,392 g de D-mannitol pour une concentration finale de 215 mM, 1,25 ml de 8X, pH à 7,4 mitochondries et QS à 10 ml d'eau distillée. </li><li> Tampon expérimental (EB): Ajouter 100 ul de 500 mM de MgCl 2 pour une concentration finale de 5 mM, 0,392 g de D-mannitol pour une concentration finale de 215 mm, 25 pl de 2,5 mM KH 2 PO 4 pour une concentration finale de 6,25 uM, 2 pl de 100 mM EGTA pour une concentration finale de 20 uM, 1,25 ml de tampon mitochondrial, le pH à 7,4 et QS à 10 ml d'eau distillée. </li></ul></li></ol> 2. Isolement du muscle <ol><li> Dans un seau à glace, mettre trois béchers 10 ml, broyeurs tissus Potter Elvehjem et tous les autres instruments nécessaires / fournitures sur la glace. Tout doit rester glacée toute l'expérience. </li><li> Placez IB1 et IB2 dans un seau à glace et EB dans le bain d'eau chaude lorsque vous avez terminé. </li><li> Dans les trois béchers 10 ml, les solutions suivantes doivent être ajoutées: <ul><li> Bécher 1: 10 ml de PBS </li><li> Bécher 2: 10 ml de PBS / EDTA </li><li> Bécher 3: 3 ml de IB1 </li></ul></li><li> Tuer un rat humainement approuvé par votre soin des animaux et du Comité institutionnel local utilisation. </li><li> Isoler rapidement 250-500 mg de muscle squelettique, rincer dans le bécher 1, puis transfert à Bécher 2. </li></ol> 3. Homogénéisation / Isolement mitochondriale <ol><li> Transfert de muscle pour bécher de 3 et finement hachée le muscle avec des ciseaux. </li><li> Transférer la solution dans l'homogénéisateur Potter-Elvehjem. Homogénéiser le muscle à l'aide d'un pilon motorisé (une perceuse va faire le travail) 10 fois gardant le tube dans la glace en tout temps. </li><li> Transfert homogénat de pré-réfrigérée microtubes de 2 ml et centrifuger à 700 g pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouvelle. Jeter granulés. </li><li> Centrifuger le surnageant au 10500 g pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouvelle et SN1 étiquette (numéro de surnageant 1) et le type de muscle. </li><li> Re-suspendre le culot dans 500 ul de IB2. </li><li> Centrifuger à 10500 g pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouvelle et SN2 étiquette (numéro de surnageant 2) et le type de muscle. </li><li> Suspendre finale mitochondriale culot dans 100 ul d'IB2. </li><li> Re-spin suspension finale mitochondrial dans Minifuge pendant quelques secondes. S'il ya une boulette, le transfert surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouveau et jeter le culot. </li><li> Déterminer la concentration de protéines en utilisant le dosage de Bradford 8. </li></ol> 4. Étalonnage de l'électrode REMARQUE: étalonnage de l'électrode complète lors de l'isolement des mitochondries. <ol><li> Ajouter 100 ml d'eau distillée à 250 ml flacon. Agiter vigoureusement pendant 20 minutes pour équilibrer l'eau avec du gaz dans l'atmosphère. </li><li> Ajouter quelques gouttes de 50% de KCl à l'électrode oxygraphe. </li><li> Placer un petit morceau de papier à rouler Rizla bleu sur le dessus de l'électrode. </li><li> Placer un morceau de membrane en PTFE sur le dessus du papier à rouler. </li><li> Appliquer la bague intérieure en utilisant l'applicateur anneau et ensuite placer la bague extérieure dans le sillon de l'électrode. </li><li> Connectez-électrodes et montons le reste de l'équipement: plus grand anneau de plastique de base, la chambre des mitochondries, et les tuyaux d'eau. </li><li> Mettez les boîtes oxygraphe et lancer le logiciel oxygraphe. </li><li> Ajouter l'eau équilibrée à la chambre des mitochondries. </li><li> Ajouter le barreau d'agitation et tourner à une vitesse de 60. </li><li> Commencer une nouvelle expérience. </li><li> Cliquez sur l'étalonnage et de calibration, puis en phase liquide pour l'encadré 1. Changement de température à 37 ° C et cliquez sur "OK" deux fois. </li><li> Quand "Override" changements "OK" cliquer dessus et ouvrir le réservoir d'azote. </li><li> Placez la pointe connectéau réservoir d'azote dans la chambre de l'oxygène et d'établir à zéro. Cliquez sur "OK" quand il passe de "neutralisation". </li><li> Aspirer l'eau et ajouter 500 ul de tampon EB aux chambres mitochondriale. </li><li> Chambre d'étanchéité avec le piston. </li><li> Si vous utilisez plusieurs boîtes, répétez les étapes 11 à 15 pour l'étalonnage de l'encadré 2. </li></ol> 5. Respiration mitochondriale <ol><li> Démarrer une nouvelle expérience; le laisser fonctionner pendant environ 1 minute pour stabiliser le signal. </li><li> Ajouter le volume nécessaire de la suspension mitochondriale (étape 3.11) pour 150 g dans chaque chambre, un événement marque, et le laisser tourner pendant 1 minute. </li><li> Ajouter 10 ul d'eau tiède 250 mM glutamate mM/125 / malate pour une concentration finale de 5 mM mM/2.5. Mark et de laisser fonctionner pendant 1 minute. Ceci est défini comme l'État 2. </li><li> Ajouter 7,5 ul de 10 mM d'ADP pour une concentration finale de 150 uM, marque, et laissez fonctionner pendant 30 secondes. Ceci est défini comme l'État 3. </li><li> Ajouter un autre ul 7.5 de 10 mM d'ADP, marque, et laissez fonctionner pendant 1,5 minutes. </li><li> Ajouter 0,5 ul de froid 10 mM oligomycine pour une concentration finale de 1 uM, marque, et laisser courir pendant 3 minutes. Ceci est défini comme l'État 4. </li><li> Ajouter 1 ul de froid 0,1 mM FCCP pour une concentration finale de 0,2 uM, marque, et laisser courir pendant 3 minutes. Ceci est défini comme l'État 5. </li><li> Lorsque vous avez terminé, fin expérimenter et sauver. </li><li> Acquérir des taux de respiration en utilisant le logiciel oxygraphe. </li><li> Entrez le facteur de normalisation: si l'ajout de 150 ug de protéine mitochondriale, le facteur de normalisation sera de 0,15. </li><li> Calculer le taux de respiration normalisé pour les états de respiration différente. </li><li> Calculer le rapport de contrôle respiratoire (RCR), en divisant l'État par État 3 4. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Montre un représentant de traçage de la consommation d'oxygène par les muscles squelettiques mitochondries. Après le signal de l'électrode est stabilisée, l'échantillon mitochondries est ajouté à la chambre oxygraphe. Etat 2 la respiration commence avec l'ajout de glutamate et le malate. Ajout d'ADP augmente la consommation d'oxygène, en définissant l'état 3 respiration. ATP synthase est bloquée par addition de oligomycine pour obtenir l'état 4 respiration. Enfin, FCCP est ajouté à découpler la respiration mitochondriale (état 5). Le tableau 1 montre les taux de consommation d'oxygène représentant des États-2, 3, 4 et 5. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR) est calculé pour chaque expérience. RCR ≥ 4 est considéré comme une preuve d'une préparation viables mitochondries. <table border="1"><tbody><tr><td> Etats </td><td> Tarifs normalisé </td></tr><tr><td> État 2 </td><td> 34,74 </td></tr><tr><td> État 3 </td><td> 153,40 </td></tr><tr><td> État 4 </td><td> 16,49 </td></tr><tr><td> État 5 </td><td> 143,70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9,30 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Taux de respiration mitochondriale. Representativeoxygen taux de consommation du muscle squelettique mitochondries. Les valeurs sont normalisées à la quantité de mitochondries ajouté à la chambre. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR) est déterminé en divisant l'état 3 par l'Etat 4. Un RCR ≥ 4 représente une préparation viables mitochondries.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

Nous présentons un protocole pour isoler les mitochondries viables à partir des muscles squelettiques. Si le rendement est un problème, le protocole peut être modifié en incubant le muscle isolé dans 5 ml de trypsine EDTA/0.01% PBS/10mM pendant 30 minutes dans la glace. Pour assurer la digestion complète du muscle à la trypsine, le muscle doit être pleinement hachée. Après l&#39;incubation de 30 minutes, la solution de trypsine PBS/10mM EDTA/0.01% doit être entièrement remplacé par 3 ml de tampon d&#39;isolement 1 (IB1)...

<table><tbody><tr><td>95 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; mélange</td><td>Fournisseur local de gaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&amp;#8242;-diphosphate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre bleu Rizla</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Dosage protéique de Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanure de p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azote comprimé</td><td>Fournisseur local de gaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylène-glycol-bis-tétraacétique (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin liée aux acides gras libres</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Acide glutamique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Rats mâles Sprague Dawley</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Acide malique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Disque d'électrode à oxygène</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraphe</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Oxygraph Plus V1.01</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ph-mètre</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateurs Potter-Elvehjem</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>Mémbbrane en PTFE (0,0125 mm &amp;#215; 25 mm)</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse à colonne SKIL 3320</td><td>Magasin de quincaillerie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement mitochondriale du muscle squelettique

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Les mitochondries sont des organites le contrôle de la vie et la mort de la cellule. Ils participent à des réactions métaboliques clés, synthétiser plus de l&#39;ATP, et de réglementer un certain nombre de cascades de signalisation 2,3. Les chercheurs actuels et passés ont mitochondries isolées à partir des tissus de rats et de souris, comme le foie, le cerveau et le coeur 4,5. Ces dernières années, de nombreux chercheurs se sont concentrés sur l&#39;étude de la fonction mitochondriale des muscles squelettiques. Ici, nous décrivons une méthode que nous avons utilisé avec succès pour l&#39;isolement des mitochondries des muscles squelettiques 6. Notre procédure exige que tous les tampons et les réactifs sont frais et ont besoin d&#39;environ 250-500 mg de muscle squelettique. Nous avons étudié les mitochondries isolées de rat et de souris gastrocnémien et le diaphragme et les muscles extraoculaires chez le rat. Concentration de la protéine mitochondriale est mesurée avec le dosage de Bradford. Il est important que les échantillons mitochondriale être conservés glacée pendant la préparation et que des études fonctionnelles être effectuée dans un temps relativement court (~ 1 h). Respiration mitochondriale est mesurée en utilisant la polarographie avec une électrode de type Clark (système oxygraphe) à 37 ° C 7. Calibrage de l&#39;électrode à oxygène est une étape clé dans ce protocole et elle doit être effectuée quotidiennement. Mitochondries isolées (150 ug) sont ajoutés à 0,5 ml de tampon expérimental (EB). Etat 2 la respiration commence avec l&#39;ajout de glutamate (5mm) et malate (2,5 mM). Ensuite, l&#39;adénosine diphosphate (ADP) (150 uM) est ajouté pour commencer l&#39;état 3. Oligomycine (1 pM), un bloqueur synthase ATPase, est utilisé pour estimer l&#39;état 4. Enfin, le cyanure de p-carbonyle [trifluorométhoxy]-phényl-hydrazone (FCCP, 0,2 M) est ajouté à measurestate 5, ou la respiration découplée 6. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR), le ratio de l&#39;état 3 à l&#39;état 4, est calculé après chaque expérience. Un RCR ≥ 4 est considéré comme une preuve d&#39;une préparation viables mitochondries. En résumé, nous présentons une méthode pour l&#39;isolement des mitochondries viables à partir des muscles squelettiques qui peuvent être utilisés dans biochimiques (par exemple une activité enzymatique, immunodétection, protéomique), des études et fonctionnels (respiration mitochondriale).

Ce protocole décrit une procédure pour étudier la respiration des mitochondries isolées de muscles squelettiques. Cette méthode a été adaptée à partir Scorrano<em&gt; Et al.</em&gt; (2007). La procédure d&#39;isolement des mitochondries nécessite environ 2 heures. La respiration mitochondriale peut être complété en environ 1 heure.

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

Les mitochondries sont des organites contrôlant la vie et la mort de la cellule. Elles participent à des réactions métaboliques clés, synthétisent la majeure partie de l'ATP et ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des mitochondries et de mesurer la respiration mitochondriale. Cette opération s'effectue tout d'abord en isolant le muscle squelettique de rats spray dly. Ensuite, le muscle est homogénéisé et les mitochondries sont isolées par centrifugation.La concentration en protéines est ensuite déterminée à l'aide du test de Bradford. Enfin, la respiration mitochondriale est mesurée par polygraphie. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la consommation d'oxygène au cours des différents états de la respiration mitochondriale.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du muscle squelettique, telles que l'effet de différentes interventions sur la fonction mitochondriale. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le métabolisme du muscle squelettique, elle peut également être appliquée à d'autres organes tels que le foie, le cerveau, le rein ou presque n'importe quel tissu avant le début de la procédure. Pour isoler le muscle squelettique, préparez les solutions suivantes : P-B-S-P-B-S plus 10 millimolaire de EDTA, huit fois le tampon d'isolement des mitochondries, tampon d'

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Méthodes pour la biopsie du vaste externe, préparation de mitochondries purifiées, et le profilage respirométrique sont décrits. L'utilisation de petit volume musculaire rend cette technique convient pour des applications de recherche clinique.

Préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique Obtenu par biopsie percutanée aiguille

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Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris et l’analyse ultérieure de la respiration par taux de consommation d’oxygène (OCR) à l’aide de tests respirométriques sur microplaques. Ce pipeline peut être appliqué pour étudier les effets de multiples interventions environnementales ou génétiques sur le métabolisme mitochondrial.

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