Isolement mitochondriale du muscle squelettique

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les mitochondries et d’effectuer une respiration mitochondriale. Ceci est accompli en isolant d’abord le muscle squelettique des rats pulvérisés. Ensuite, le muscle est homogénéisé et les mitochondries sont isolées par centrifugation.

La concentration en protéines est ensuite déterminée à l’aide du test Bradford. Enfin, la respiration mitochondriale est mesurée par polygraphie. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la consommation d’oxygène à travers les différents états de respiration mitochondriale.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des muscles squelettiques, telles que l’effet de différentes interventions sur la fonction mitochondriale. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du métabolisme des muscles squelettiques, elle peut également être appliquée à d’autres organes tels que le foie, le cerveau, les reins ou presque tous les tissus avant de commencer la procédure. Pour isoler le muscle squelettique, préparez les solutions suivantes : P-B-S-P-B-S plus 10 millimolaires d’EDTA, huit fois le tampon d’isolement des mitochondries un ou IB un, le tampon d’isolement deux ou IB deux et le tampon expérimental ou eb.

Voir le protocole écrit ci-joint pour les instructions. Ensuite, allumez la centrifugeuse et réglez-la à quatre degrés Celsius. Allumez un bain-marie et réglez-le à 37 degrés Celsius.

Dans un joli seau, mettez trois béchers de 10 millilitres, un coude de potier, des broyeurs de tissus de pierres précieuses, de petits ciseaux chirurgicaux et 10 micro tubes de centrifugation sur de la glace. Tout doit rester glacé tout au long de l’expérience. Placez IB un et IB deux sur de la glace et EB dans un bain d’eau chaude.

Ajoutez ensuite les solutions suivantes aux trois béchers sur bécher à glace : un bécher de 10 millilitres de PBS, deux de 10 millilitres de bécher P-B-S-E-D-T-A. Trois. Trois millilitres d’ib. On euthanasie un rat selon les procédures approuvées par le comité local de soins aux animaux et de jus de fruits.

Ensuite, isolez rapidement 250 à 500 milligrammes de muscle squelettique avec des pinces et des ciseaux Mayo Clinic. Rincez-le dans le beca un, puis transférez-le dans le beca deux, pour homogénéiser le muscle. Tout d’abord, transférez-le dans le bécher trois, puis hachez-le avec des ciseaux.

Transférez la solution dans l’homogénéisateur de gemmes Elva, homogénéisez le muscle à l’aide d’un pilon motorisé 10 fois, en gardant le tube dans la glace à tout moment. Ensuite, transférez l’homogénat dans une microcentrifugeuse pré-refroidie de deux millilitres, des tubes et une centrifugeuse à 700 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant S dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse pré-rempli et jetez la centrifugeuse à granulés.

Le surnageant S à 10, 500 G pendant 10 minutes À quatre degrés Celsius, transférez le SNAT dans un nouveau microtube de centrifugation pré-rempli et étiquetez-le avec SN un et le type musculaire Reese. Suspendre la pastille dans 500 microlitres d’IB deux, puis centrifuger à 10, 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le supinate dans un nouveau microtube de centrifugation prérempli et étiquetez-le avec SN deux et le type de muscle.

Suspendre la dernière pastille mitochondriale dans 100 microlitres d’IB deux. Faites-le tourner dans une mini fuge pendant quelques secondes. S’il y a une pastille, transférez le supinate dans un nouveau microtube de centrifugation prérempli et jetez la pastille. L’étalonnage de l’électrode d’oxygène est une étape clé de ce protocole et doit être effectué quotidiennement.

L’étalonnage de l’électrode peut être effectué pendant l’isolement mitochondrial. Pour commencer, ajoutez vigoureusement 100 millilitres d’eau distillée dans une fiole de 250 millilitres pendant 20 minutes. Pour équilibrer l’eau avec les gaz atmosphériques, couvrez l’électrode GRAT avec quelques gouttes de chlorure de potassium à 50 %.

Placez ensuite un petit morceau de papier à rouler rizla bleu sur l’électrode. Puis un morceau de membrane PTFE. Sur le papier à rouler.

Appliquez l’anneau intérieur à l’aide de l’applicateur annulaire, puis placez l’anneau extérieur dans la rainure de l’électrode. Connectez les électrodes et assemblez la plus grande base annulaire en plastique, la chambre mitochondriale et les tuyaux d’eau. Allumez les boîtes GRAT et démarrez le logiciel GAS.

Ajoutez l’eau équilibrée dans la chambre mitochondriale. Ajoutez ensuite une barre d’agitation pour allumer la barre d’agitation. Cliquez sur le matériel.

Puis remuez une vitesse. Réglez la vitesse sur 60 et cliquez sur. Ensuite, commencez une nouvelle expérience.

Cliquez sur calibrer puis sur étalonnage en phase liquide. Pour la première boîte, réglez la température à 37 degrés Celsius et cliquez deux fois sur OK. Lorsque le remplacement passe, d’accord, cliquez dessus et ouvrez le réservoir d’azote gazeux.

Placez l’embout connecté au réservoir d’azote dans la chambre et établissez zéro oxygène. Cliquez sur OK lorsqu’il passe de la fonction de remplacement. Aspirez l’eau et ajoutez 500 microlitres d’EB dans les chambres mitochondriales.

Scellez la chambre à l’aide d’un piston. Si vous utilisez plusieurs boîtes, répétez l’opération à partir de l’étape d’étalonnage pour chaque boîte. Démarrez une nouvelle expérience et laissez-la s’exécuter pendant environ une minute.

Pour stabiliser le signal, ajoutez le volume nécessaire de suspension mitochondriale pour arriver à 150 microgrammes dans chaque chambre. Marquez l’événement et laissez-le s’exécuter. Pendant une minute, ajoutez 10 microlitres de glutamate chaud de 250 millimolaires, 125 millimolaires de malate pour une concentration finale de cinq millimolaires de glutamate, 2,5 millimolaires de malate, et laissez-le fonctionner pendant une minute.

Ceci est défini comme l’état deux. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres de 10 millimolaires a DP pour une concentration finale de 150 micromolaires. Ensuite, marquez et laissez-le fonctionner pendant 30 secondes.

Ceci est défini comme l’état trois. Ajoutez encore 7,5 microlitres de 10 millimolaires à une marque DP et laissez-le fonctionner pendant 1,5 minute. Ajoutez 0,5 microlitre d’oligomycine froide de 10 millimolaires pour une concentration finale d’une marque micromolaire, et laissez agir pendant trois minutes.

Ceci est défini comme l’état quatre. Ajoutez un microlitre de FCCP froid de 0,1 millimolaire pour une concentration finale de 0,2 marque micromolaire, et laissez RUM pendant trois minutes. Ceci est défini comme l’état cinq.

Une fois terminé, terminez l’expérience et enregistrez-la. Acquérez les fréquences respiratoires à l’aide du logiciel de radeau. Entrez le facteur de normalisation.

Si vous ajoutez 150 microgrammes de protéine mitochondriale, le facteur de normalisation sera de 0,15. Calculez les fréquences respiratoires normalisées pour les différents états respiratoires. Calculez le rapport de contrôle respiratoire ou RCR en divisant l’état trois par l’état quatre.

Cette figure montre un traçage représentatif de la consommation d’oxygène par le muscle squelettique. Mitochondrie. Une fois le signal de l’électrode stabilisé, l’échantillon de mitochondries est ajouté à la chambre GRAT. Deuxième état, la respiration commence par l’ajout de glutamate et de malate.

L’ajout d’un DP augmente la consommation d’oxygène. Définition de l’état trois. Respiration Une syntase TP est bloquée par l’ajout d’une mycine liga pour obtenir l’état quatre de respiration.

Enfin, le FCCP est ajouté pour découpler la respiration mitochondriale. Ce diagramme montre les taux représentatifs de consommation d’oxygène pour les états 2, 3, 4 et cinq. Le rapport de contrôle respiratoire ou RCR est calculé pour chaque expérience.

Un RCR supérieur à quatre est considéré comme la preuve d’une préparation viable des mitochondries lors de la tentative de cette procédure. Il est important de garder les échantillons mitochondriaux dans la glace en tout temps. En suivant cette procédure.

D’autres méthodes comme les Western blots peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le contenu des protéines mitochondriales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les mitochondries du muscle squelettique ainsi que la respiration mitochondriale.