Développement des méthodes de transport des macrophages par le sang des Nanoformulated médicaments antirétroviraux

L'objectif de cette procédure est de produire et d'évaluer l'absorption cellulaire, la sécrétion et les propriétés antirétrovirales de nanoparticules cristallines antirétrovirales, que nous appelons nano art. Cela est réalisé en premier lieu en traitant les médicaments antirétroviraux par homogénéisation par sonication ou broyage humide. La deuxième étape de la procédure consiste à caractériser les propriétés physiques des particules nano art après l'isolement des monocytes primaires par centrifugation en contre-courant.

Ils sont cultivés pendant sept jours dans du DMEM contenant le facteur de stimulation des colonies de macrophages, ou MCSF, qui induit leur différenciation en macrophages dérivés de monocytes. La troisième étape consiste à évaluer l'absorption, la rétention et la libération du nano ART dans des macrophages humains dérivés de monocytes. La dernière étape de la procédure consiste à tester l'efficacité antirétrovirale in vitro du nano ART dans des macrophages dérivés de monocytes.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant une absorption facilitée et une libération lente des nanomédicaments par les cellules, ainsi qu'une efficacité antirétrovirale robuste. Ces résultats sont déterminés par la mesure des concentrations de médicament, par chromatographie liquide à haute performance ou HPLC, et par l'analyse de surnageants de cultures infectées grâce à la mesure de l'activité de la transcriptase inverse. Bonjour, je suis Hanta Aldi et je suis chercheuse postdoctorale au laboratoire du Dr Howard Gelman au centre médical de l'Université du Nebraska.

Les méthodes que nous présentons peuvent aider à répondre à des questions clés en nanomédecine, notamment sur la manière dont les systèmes de délivrance de médicaments basés sur les cellules peuvent être utilisés pour développer des activités de recherche translationnelle. Cela peut être réalisé en utilisant une thérapie antirétrovirale formulée sous forme nano avec des demi-vies prolongées. Nos études soutiennent le potentiel d'utilisation du nano art à des fins cliniques.

Bonjour, je m'appelle Ari Noche et je suis étudiant boursier MD PhD travaillant au sein du laboratoire émergent de neurosciences Carol Schwartz. Sous la direction du Dr Gendelman, les implications des techniques que nous vous présentons ici s'étendent à la thérapie antirétrovirale, car les composés formulés sous forme nano peuvent simultanément améliorer la biodisponibilité et la pharmacocinétique tout en réduisant les effets secondaires liés aux médicaments. En reprenant des médicaments antirétroviraux déjà disponibles cliniquement et en les reconditionnant sous forme de nanoparticules, nous pourrions améliorer l'observance thérapeutique et influencer positivement l'évolution de la maladie.

Bonjour, je suis le Dr Howard Gendelman. Je suis médecin chercheur, professeur et chef du Département de pharmacologie et de neurosciences expérimentales au sein du centre médical de l'Université du Nebraska. Notre objectif global est de simplifier les médicaments antirétroviraux afin de les rendre plus facilement accessibles et d'améliorer leur biodistribution et leurs propriétés pharmacocinétiques.

Maintenant, je vous laisse en compagnie d'Ari et Sean, qui vous emmèneront dans le laboratoire de recherche et vous montreront comment s'effectuent la fabrication et le développement de ces nanoparticules. Utilité clinique et développement ici au Centre médical de l'Université du Nebraska. Pour fabriquer des nano-objets par broyage humide, commencez par peser les cristaux du médicament et les différents tensioactifs qui seront utilisés pour élaborer les formulations nano, puis mélangez-les avec un tampon heis 10 millimolaire, pH 7,8, à l’aide d’un mixeur T 18 Ultra Turx, jusqu’à obtention d’une dispersion complète. Le pourcentage de médicament dans la formulation doit se situer entre 1 et 2 % pour un broyage continu.

Veillez à ce que le refroidisseur et le compresseur soient allumés et que la pression de sortie soit d'environ 100 psi. Configurez maintenant le système afin de pouvoir charger le milieu de broyage dans le réservoir, puis ajoutez 50 millilitres de billes dans la chambre de broyage. À l’aide d’un entonnoir, assurez-vous qu’aucune bille ne se trouve sur les filetages ni ailleurs en dehors de la chambre de broyage afin d’éviter toute fuite au niveau du joint mécanique. Vérifiez maintenant que le joint torique est bien en place sur la chambre de broyage.

Ensuite, sélectionnez une taille de maille de tamis appropriée et fixez les couvercles en resserrant les écrous. La taille de la maille du tamis doit être d'au moins la moitié de celle des billes. Utilisez une taille de maille de tamis plus grande pour éviter que le produit n'obstrue le filtre pendant le broyage continu.

Après avoir abaissé la chambre de broyage, ajoutez la suspension du médicament contenant différentes quantités de tensioactifs à l'entrée du produit. Le volume minimal de la suspension doit être de 100 millilitres. Cela permettra d'éviter la surchauffe de la chambre de broyage et de réduire la contamination par les billes en diminuant l'usure des pièces.

Ensuite, démarrez la pompe. À l’aide de l’unité de commande, faites varier le débit selon les besoins de votre formulation. Puis, mettez en marche l’agitateur et réglez la vitesse sur l’unité de commande.

La vitesse peut être augmentée de 600 tours par minute à 4 320 tours par minute. Sur un micro-sur, surveillez la température à l’aide du thermomètre fixé en haut de la chambre de broyage afin de vous assurer qu’il n’y a pas de surchauffe. Broyez maintenant l’échantillon à différentes vitesses et débits, puis prélevez de petites aliquotes d’environ un millilitre de la formulation pour mesurer la taille et la charge à l’aide d’un zétamètre Malvern par diffusion de la lumière.

Une fois la taille souhaitée obtenue, arrêtez le broyage à l’aide de l’unité de commande et, tout en laissant la pompe en marche, recueillez l’échantillon dans un flacon, en permettant au médicament de s’écouler complètement. Pensez à éteindre la pompe une fois l’opération terminée, puis retirez et nettoyez les billes. Transférez maintenant la suspension du broyeur dans des tubes centrifugeuses de 50 millilitres et réglez la centrifugeuse à 10 000 tours par minute pendant 30 minutes.

Une fois le cycle de centrifugation terminé, mesurez la quantité de sate et remplacez-la par une quantité équivalente de solution de tensioactif fraîche. Une fois la suspension Resus terminée, transférez la suspension dans la chambre de broyage et broyez pendant 10 minutes. Prélevez un aliquot d'environ un millilitre et mesurez à nouveau la taille et la charge de l'échantillon à l'aide du zétamètre.

Enfin, mesurez la concentration des formulations de nano art à l’aide de HBLC pour fabriquer du nano art par homogénéisation. À l’aide de l’Avastin Emulex C cinq, préparez les cristaux de médicament et divers tensioactifs comme décrit précédemment, puis transférez la suspension dans le récipient d’homogénéisation et commencez la recirculation. Assurez-vous que le refroidisseur est allumé avant de commencer l’homogénéisation de l’échantillon.

Augmentez progressivement la pression jusqu'à ce que le manomètre indique 20 000 ± 2000 psi, puis poursuivez l'homogénéisation jusqu'à l'obtention de la taille de particule cible. Cela prend généralement entre 45 et 60 minutes. Prélevez périodiquement un échantillon d'environ un millilitre et mesurez la taille et la charge de l'échantillon à l'aide d'une centrifugeuse zétamétrique, comme décrit précédemment pour la suspension homogénéisée.

Ensuite, après la suspension de Resus, transférez la suspension vers l'homogénéisateur C cinq. Redémarrez la circulation et rétablissez la pression d'homogénéisation à 20 000 ± 2000 psi, puis homogénéisez pendant 30 minutes pour fabriquer par sonication en utilisant le processeur ultrasonique Palmer froid. Versez la solution de chlorométhane PLGA et de médicament dans une solution de surfactant PVA à 1 % et placez-la dans un bain de glace sous ultrasons.

Commencez la sonication à une amplitude de 50 %, bien que l'amplitude puisse être réduite à environ 30 % pour de plus petits lots d'échantillons ; soniquez l'échantillon pendant 10 minutes. Prélevez un petit aliquot pour l'analyse de la taille des particules. Si la taille des particules est supérieure à 1,5 micron, soniquez les échantillons par intervalles de deux minutes jusqu'à un maximum de 16 minutes au total.

Observer les échantillons au microscope avec un grossissement de 20 fois et documenter les observations. Utiliser un agitateur magnétique pour créer un vortex adéquat pour la suspension et poursuivre le mélange toute la nuit à température ambiante. Recueillir la suspension après 24 heures et verser dans des tubes de centrifugation de 50 millilitres.

Centrifuger les échantillons à une vitesse de 8 000 tours par minute pendant 20 minutes à cinq degrés SIU, décanté le surnageant et resuspendre une moitié de l'échantillon dans 75 millilitres d'eau osmosée filtrée et l'autre moitié dans 75 millilitres de solution de bromure de triméthylammonium de CTAB à 0,5 %. Centrifuger à nouveau les échantillons à une vitesse de 8 000 tours par minute pendant 20 minutes à cinq degrés Celsius et resuspendre chaque culot avec un total de 20 millilitres de solution de mannitol. Enfin, pour les particules fabriquées par homogénéisation ou sonication, mesurer la taille des particules à l’aide du zeta sizer et déterminer la concentration des échantillons par HPLC.

Pour préparer la visualisation par microscopie, prenez les suspensions d'œuvres nanométriques préparées et soumettez-les à une sonication pendant 10 secondes à une amplitude de 20 % à l’aide d’une sonde de sonication. Prenez une lame de microscope avec une lamelle et placez-la sur un microscope inversé. Sur la lamelle.

Mélangez 15 microlitres de la suspension de nano-objets avec 100 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate et mélangez en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Ensuite, visualisez les nanoparticules à l’aide d’un objectif de 20 fois pour observer la morphologie. Les échantillons peuvent également être préparés pour la visualisation par microscopie électronique à balayage.

Ici, nous observons des images obtenues à partir d'un microscope électronique à balayage à émission de champ à basse tension A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F après l'isolement de monocytes sanguins par centrifugation de monocytes purifiés à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans du DMEM supplémenté avec les additifs suivants. Ensuite, déposer 2 × 10⁶ cellules par puits dans des plaques de 6 puits dans une atmosphère humidifiée, supplémentée avec 5 % de dioxyde de carbone, et cultiver pendant sept jours afin de permettre aux monocytes de se différencier en macrophages pour analyser l'absorption cellulaire et la collecte. Mélanger le nano art avec le milieu de culture à une concentration finale de 100 micromolaire et ajouter un millilitre de milieu de traitement dans chaque puits au point temporel souhaité ou lorsque les cellules sont complètement chargées en nano art.

Retirez tout le milieu de traitement et lavez les cellules trois fois avec un millilitre de PBS afin d'éliminer les particules qui n'ont pas été internalisées par les cellules. Détachez les cellules adhérentes du fond de la cavité à l'aide d'un grattoir à cellules et transférez-les dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Centrifugez ensuite les cellules à 1000 RCF à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Retirez le surnageant et ajoutez 200 microlitres de méthanol à 100 % aux cellules afin de dissoudre les nano-ART en soumettant brièvement le culot à une sonication au moyen d'une sonde à une amplitude de 20 % pendant deux à cinq secondes. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de l'analyse de la teneur en médicament. La rétention intracellulaire des nano-ART peut également être visualisée par microscopie électronique en transmission après préparation des coupes au microtome, comme illustré ici.

Voir le texte accompagnant cet article pour les détails permettant d'analyser la libération d'arches nano en traitant les cellules comme décrit précédemment pour l'analyse de l'absorption cellulaire et la collecte. Toutefois, au lieu de collecter les cellules après lavage, remplacer le PBS par deux millilitres de milieu de culture cellulaire sans MCSF et sans nano art aux jours indiqués ou lorsque le milieu devient jaune, échanger la moitié du milieu au jour souhaité. Prélever un millilitre du milieu cellulaire ainsi que les cellules en réplicat et procéder à l'analyse du médicament.

Pour visualiser en temps réel l'absorption des nano ART par microscopie bifocale, commencez par prendre un DRE tel que Vibrant et ajoutez-le au milieu. Conformément aux instructions du fabricant, ajoutez le milieu contenant le colorant aux macrophages matures dérivés de monocytes, puis rincez les cellules trois fois à l'aide d'un millilitre de milieu de culture afin d'éliminer tout excès de colorant. Mélangez ensuite les nano ART avec le milieu de culture en utilisant des nano ART marquées par fluorescence, et ajoutez le milieu de traitement contenant les nano ART marquées. Juste avant l'imagerie au microscope confocal, capturez une image toutes les 30 secondes pendant quatre heures à l'aide d'un objectif de 60 fois.

Enfin, des tests d'infection et d'infectiosité par le VIH-1 peuvent être réalisés. Tout d'abord, traitez les cellules comme décrit pour la visualisation de la libération d'ART. Ensuite, aux jours souhaités, retirez tout le milieu et remplacez-le par un milieu ne contenant pas de M-CSF, mais contenant le VIH-1 à une multiplicité d'infection de 0,01 particule virale par cellule, puis incubez pendant 24 heures.

Ensuite, retirez le milieu viral et remplacez-le par un milieu frais, sans virus, pendant 10 jours, en renouvelant la moitié du milieu tous les deux jours ou selon les besoins afin de maintenir les cellules vivantes pendant 10 jours après l'infection. Prélevez 10 microlitres de milieu de chaque puits et placez-les dans une plaque de 96 puits ; conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de réaliser l'analyse de la transcriptase inverse. Des détections ultérieures de la protéine P24 du VIH-1 peuvent également être effectuées.

Ici, nous pouvons facilement observer la morphologie des cellules exposées au virus à un indice de multiplicité d'infection de 0,01 un jour après le traitement par nano art. Dans ces macrophages dérivés de monocytes, il n'y a aucune preuve d'infection virale et les nanoparticules sont clairement visibles dans le cytoplasme cellulaire. Ici, les cellules ont été exposées au virus 10 jours après le traitement par nano art.

Certaines de ces cellules ont été infectées, comme en témoignent la coloration P24 et la formation de cellules géantes multinucléées, mais une protection significative persiste par rapport aux cellules non traitées. Remarquez que les nanoparticules restent visibles dans le cytoplasme des cellules en B, bien qu'elles soient moins présentes qu'en a ; ces structures sont absentes chez les cellules non traitées avec le nano art. Sur ces vidéos confocales de cellules vivantes, on observe des macrophages marqués en vert et le nano art marqué en rouge.

Ici, on observe que les cellules accumulent très peu de nanoparticules. Ici, elles accumulent rapidement des particules, comme en témoigne l'augmentation de la fluorescence rouge. Ces différences reflètent les résultats observés lors de l'analyse de l'absorption du médicament par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). En outre, on peut constater que les cellules internalisent activement les particules.

La différence entre les taux d'accumulation cellulaire de nano-objets reflète les effets de caractéristiques physiques telles que la taille, la forme et la charge sur la capacité des macrophages à internaliser et à retenir les nano-objets. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer des nano-objets à l’aide de techniques de broyage humide, d’homogénéisation et de sonication. Ce sont des méthodes efficaces pour produire des nanoparticules antirétrovirales.

Le broyage humide et l'homogénéisation permettent de fractionner des particules cristallines de médicament de grande taille en nanoparticules plus petites au sein de surfactants lipidiques, tandis qu'une technique de sonication produit des gouttelettes individuelles de taille nanométrique dans un polymère. Nous avons également démontré ici comment utiliser des macrophages dérivés de monocytes humains comme plateforme d'essai pour évaluer le transport de nano-objets. Notre méthode d'analyse permet un criblage très simple de la capacité d'une particule à être internalisée, retenue et libérée par les cellules, ainsi que de son aptitude à inhiber la réplication virale.

Cela permet au chercheur d'identifier les nano-objets artistiques qui pourraient avoir les meilleures chances de réussite in vivo et, en fin de compte, d'être utilisés chez des humains infectés. Les résultats complets de ces expériences sont publiés dans notre article en ligne Nano. L'article intitulé Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics paraît dans le Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Merci beaucoup.