Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique

L’objectif global de cette procédure est d’identifier des clones exprimant de la cellulase à partir d’une banque métagénomique. Pour ce faire, on réplique d’abord une banque métagénomique précédemment créée à l’aide d’un robot, après l’incubation de la bibliothèque répliquée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. La croissance des clones d’E coli est mesurée, la lyse, le tampon et le substrat sont ensuite ajoutés à la bibliothèque répliquée.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’activité de la cellulase grâce à des mesures d’absorbance colormétriques à l’aide d’un lecteur de plaques. Bonjour, je m’appelle Keith et je travaille dans le laboratoire de Steven Hallam au Département de microbiologie et d’immunologie de l’Université de la Colombie-Britannique. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de criblage fonctionnel à haut débit de banques métagénomiques.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l’activité de la cellulase biomin à partir de banques métagénomiques. Alors commençons. Avant de commencer ce protocole, préparez une banque métagénomique stockée dans un format de plaque à 384 puits.

Cette étude a utilisé le vecteur SMID de contrôle de copie PCC en combinaison avec des cellules TRANSFECT max EPI 300 T résistantes de Farge T comme hôte de la banque pour démarrer cette procédure, retirer les plaques contenant la bibliothèque à moins 80 degrés Celsius et les décongeler à 37 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Pendant ce temps, utilisez la fonction de stérilisation à la lumière UV sur le QIX two pour stériliser le robot pendant 15 minutes. Installez le Q fill three selon les instructions du fabricant avec le flacon de milieu fixé au collecteur via le programme de tubulure stérile.

Le Q en remplit trois pour la quantité appropriée de support et le règle pour remplir un volume de 45 microlitres. Dans chacun, purgez bien l’air du tube et du collecteur à l’aide de la fonction de purge du robot jusqu’à ce que le support soit visible. À chaque goupille du collecteur, remplissez le nombre souhaité de plaques avec du média LB à l’aide du Q fill three.

Chaque assiette prend environ 20 secondes à remplir. Ensuite, chargez les assiettes de bibliothèque et les assiettes fraîches dans les zones appropriées des pics Q. Pour que le robot remplisse les bains de nettoyage avec les réactifs appropriés.

2 % de micro 90 dans le bain arrière, de l’eau distillée en autoclave dans le bain central et 80 % d’éthanol dans le bain avant. À l’aide du programme de réplication du qix two, sélectionnez la tête appropriée ainsi que le nombre et les types de plaques source et de destination. Configurez également la tête pour qu’elle nettoie entre les réplications.

Habituellement, six cycles dans chaque bain suffisent. La capacité de la machine est de 10 plaques à la fois. Réglez la machine pour qu’elle fonctionne.

Il vous faudra environ 15 minutes pour le reproduire. Pleine capacité avec une tête de 384 broches. Une fois les plaques reproduites, cultivez-les à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans une boîte d’humidité.

Le long temps d’incubation est nécessaire car un nombre élevé de copies de smid est induit avec l’ajout d’arabinose. Pendant ce temps, nettoyez le robot Q fill three comme décrit dans le protocole écrit. Après l’incubation, retirez les plaques de l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Mettez les couvercles de côté et placez les plaques sur la plate-forme de chargement du chargeur fournie avec l’empilement rapide. Assurez-vous de garder une trace de l’ordre des plaques car le logiciel ne le fait pas. Les plaques au bas de la pile seront lues.

Tout d’abord, retirez un chargeur de la pile rapide. Assurez-vous qu’il est vide et poussez-le sur la pile de plaques à lire. Saisissez le chargeur par la poignée et la plaque devrait se charger dans le magasin.

Chargez le chargeur dans la pile rapide dans le bon sens. Ouvrez l’analyse de son programme sur l’ordinateur connecté. Sélectionnez une nouvelle session et nommez-la de manière appropriée.

Choisissez d’appeler plat fond 384 Puits plaque comme la plaque. Tapez dans la zone de disposition de la plaque. Sélectionnez le bouton de l’assistant et choisissez-le pour ajouter 384 inconnues à la plaque.

Dans la zone de protocole, sélectionnez l’option de boucle de puits et entrez pour 384 puits. Une icône de boucle de puits apparaîtra dans l’arborescence de flux sur le côté gauche de l’écran. Sélectionnez l’icône et cliquez pour ajouter une mesure photométrique.

Réglez-le pour qu’il lise à 600 nanomètres. Enregistrez le protocole avec un nom unique et fermez l’analyse de son reprogramme. Ouvrez ensuite le programme polara RS.

Sur la page principale se trouve un tableau répertoriant les instruments connectés au dispositif d’empilement rapide sous la rubrique de balayage VARI, cliquez sur l’option exécuter la session. La fenêtre de test doit alors apparaître avec un organigramme au milieu. Sélectionnez l’élément Exécuter la session, puis recherchez le nom de l’analyse enregistrée.

Il s’exécute à nouveau dans le menu déroulant qui apparaît sur le côté droit de l’écran. Une fois le protocole sélectionné, cliquez sur Exécuter. Cette boîte de test apparaîtra demandant quel magazine utiliser comme source et quel magazine est vide.

La boîte inférieure sur l’écran correspond au magazine zine avant. Assurez-vous que la pile rapide et l’analyse Vario sont activées, puis cliquez sur Démarrer. L’empilement rapide chargera automatiquement les plaques dans le lecteur de plaques, ce qui permettra des mesures continues des plaques.

Observez le chargement de la première plaque dans le balayage Vario pour assurer un bon alignement des machines à lire. 25 plaques prennent environ 50 minutes. Une fois le balayage Barrios terminé, retirez le chargeur complet et placez-le sur la plate-forme de chargement du magasin.

Soulevez le rectangle extérieur de la plate-forme et le chargeur devrait glisser, laissant les plaques en pile au milieu. Enfin, remplacez les couvercles sur les plaques par un tamis à base de solution. Pour l’activité cellulosique d’abord, préparez le mélange d’essai en utilisant un stock préfabriqué de 10 fois de lyse.

Incorporer un tampon d’acétate de potassium de 50 millimolaires à pH 5,5 comme décrit dans le protocole écrit. Préparez ensuite un stock de jusqu’à 75 milligrammes par millilitre, substrat biocide cellulaire chromogène DIPHÉNYLE ou DNP dans le DMSO, en vous assurant que le substrat est complètement dissous. Ajouter la solution mère de biocide cellulaire DNP au mélange de dosage jusqu’à une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre.

Gardez à l’esprit que chaque plaque utilise environ 20 millilitres de solution et qu’un supplément de 50 millilitres est nécessaire pour tenir compte du volume mort. Réglez le Q fill three comme précédemment au niveau du dosage du mélange sur chaque plaque à l’aide du Q fill three. Chaque assiette prend environ 20 secondes à remplir.

Une fois le mélange de test ajouté, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Dans une boîte humide, retirez les plaques de l’incubateur à 37 degrés Celsius. Rangez les couvercles et placez les plaques sur la plate-forme de chargement du magasin fournie avec l’empilement rapide de la même manière que précédemment.

Ouvrez le reprogramme de balayage et configurez-le comme fait précédemment, à l’exception de la mesure photométrique, qui doit être réglée pour lire à 400 nanomètres. Entrez ensuite les paramètres dans le programme POLARA RS. Comme nous l’avons démontré précédemment.

Laissez le Vario scan lire les plaques. Après la course, retirez et jetez les plaques. Pour exporter les lectures d’absorbance, ouvrez-le, scannez-le dans le logiciel et choisissez.

Ouvrez un fichier existant. Sélectionnez le répertoire dans lequel la session a été enregistrée et appuyez sur l’icône plus pour développer la liste. Sous l’en-tête du titre se trouveront les options étiquetées conteneur un à conteneur N.Selon le nombre de plaques, sélectionnez la première plaque à analyser dans la barre de menu en haut de la page, sélectionnez exportation du rapport de données.

Choisissez les options d’exportation, telles que la disposition des plaques et les données photométriques. Cliquez sur Afficher le rapport, puis sur Enregistrer le fichier. Choisissez le répertoire souhaité.

Le format de sortie est une feuille de calcul Microsoft Excel. Ici, les lectures d’absorbance d’un seul 384. Plaque de puits contenant un clone positif comme indiqué, les clones positifs présentent une augmentation marquée de l’absorbance par rapport aux clones n’exprimant pas d’activité cellulase.

Les différences dans le temps de dosage, l’emplacement sur la plaque ou la concentration de DNP peuvent affecter les lectures d’absorbance absolue. Les lectures d’absorbance relative, telles que la différence d’absorbance au-dessus de la moyenne sur plaque ou de la moyenne sur colonne, constituent une méthode plus robuste pour identifier les clones positifs à la cellulase. Nous venons de vous montrer comment identifier des clones positifs à la cellulase à partir d’une bibliothèque métagénomique.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de dissoudre votre bioface des cellules DNP dans du DMSO et d’incuber vos plaques dans une chambre d’humidité. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.