Identifier les effets des mutations du gène BRCA1 sur la recombinaison homologue en utilisant les cellules qui expriment endogène de type sauvage du gène BRCA1

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester des variants spécifiques de la protéine BRCA1 à l'aide d'un test de recombinaison homologue in vitro. Cette approche consiste à remplacer la protéine BRCA1 de type sauvage endogène par le variant à tester, en transfectant d'abord des ARN interférents courts spécifiques de BRCA1 ainsi qu'un plasmide permettant la réexpression des variants protéiques BRCA1 à tester. Dans une deuxième étape, l'ARN interférent court et le plasmide exprimant la protéine BRCA1 mutante sont réintroduits, en plus d'un plasmide exprimant la protéine ISCE1, qui induit un dommage de l'ADN au niveau d'un site spécifique du génome de la cellule test. Ensuite, les cellules sont incubées pendant deux à trois jours afin de permettre l'induction des lésions et la réparation de l'ADN. Les résultats obtenus indiquent si des variants protéiques spécifiques de la protéine BRCA1 participent à la réparation de l'ADN par recombinaison homologue, selon une analyse par cytométrie en flux des cellules exprimant la GFP.

Cette technique combine deux méthodes établies afin de créer un système polyvalent pour analyser des variants spécifiques de protéines dans la réparation des lésions de l'ADN par recombinaison homologue. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les méthodes précédemment établies reposaient sur des lignées cellulaires présentant une invalidation génétique de BRCA1. Nous utilisons une lignée cellulaire plus facile à manipuler, dérivée de cellules HELOC, qui permet une diminution de BRCA1 par interférence ARN de la protéine endogène et la réintroduction d'une protéine témoin dans ces cellules.

Maintenant que nous exprimons une variante de la protéine BRC1, nous pouvons tester la recombinaison homologue. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison d'une mort cellulaire excessive durant la procédure. Il est important de bien définir les conditions de transfection afin de maximiser l'effet de la réaction de recombinaison tout en limitant la cytotoxicité.

Avant le début de ce protocole, la lignée cellulaire HeLa DR13-9 a été établie en transfectant des cellules HeLa avec le plasmide P-D-R-G-F-P. Maintenir la lignée cellulaire sur des boîtes de Pétri de 10 centimètres en présence de puromycine pour la sélection des cellules transfectées de manière stable. Le substrat de recombinaison présent dans le plasmide P-D-R-G-F-P et dans les transformants stables contient deux allèles inactifs de la GFP. Un de ces allèles est inactif en raison de l'insertion d'un site de reconnaissance de 18 paires de bases pour l'enzyme de restriction I-SceI.

Dans sa séquence codante, l'expression de ISCE1 dans ces cellules crée une cassure double brin de l'ADN, ou DSB, sur le deuxième allèle de GFP inactif. La portion de sa séquence corrélée au site I-SCE1 du premier allèle est de type sauvage. Ce deuxième allèle GFP peut fonctionner comme donneur de séquence pour la réparation par recombinaison homologue du DSB et conduirait à un allèle GFP actif, facilement détectable par cytométrie en flux le jour précédant le premier transfectant.

Obtenez une plaque de 10 centimètres contenant des cellules HeLa DR-GFP qui sont confluentes à au moins 90 %. Incubez les cellules avec 1 millilitre de trypsine pendant deux à trois minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant 9 millilitres de DMEM-FBS et mélangez bien la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette. Ajoutez 40 microlitres de cellules trypsinisées par puits dans une plaque de 24 puits, dans 0,5 millilitre de DMEM-FBS. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Le premier jour, les cellules doivent être confluentes à entre 40 et 50 %. Commencer la transfection en mélangeant à la fois l'ARNi destiné à épuiser le b RCA endogène un et le plasmide exprimant le mutant B RCA un dans le milieu optimal. Puis combiner les acides nucléiques avec le lipide dans le milieu optimal.

Procédez à la transfection par lipofection conformément aux instructions du fabricant après la transfection. Remettez les cellules en incubation. Remplacez le milieu quatre à six heures plus tard par un milieu ne contenant pas d'antibiotiques.

Remettre les cellules en incubation pendant la nuit le deuxième jour. Détacher les cellules en ajoutant 0,3 millilitre de réactif trypsine triple dans chaque puits après une brève incubation à 37 degrés Celsius, puis détacher les cellules en pipetant plusieurs fois le réactif trypsine vers le haut et vers le bas. Une fois la trypsine ajoutée, transférer les cellules de la plaque 24 puits vers une plaque 6 puits contenant deux millilitres de D-M-E-M-F-B-S afin d'arrêter l'activité de la trypsine.

Laisser la plaque à six puits incuber toute la nuit dans les mêmes conditions qu’auparavant, deux jours après la transfection initiale. Préparer le SIR A, l’ADN plasmidique exprimant la mutation BRCA1 et le plasmide exprimant ISCE1 dans 62,5 microlitres d’Optum. Mélanger cette solution avec 2,5 microlitres de LIPECTOMY 2060 et 2,5 microlitres d’Optum.

Procédez à la transfection des cellules après une incubation de quatre à six heures. Remplacez le milieu par du D-M-E-M-F-P-S sans antibiotiques. Replacez les cellules dans l'incubateur au jour six.

La trypsine est ajoutée aux cellules de chaque puits en ajoutant 0,5 millilitre de réactif trypsine. Arrêter la réaction en ajoutant deux millilitres de D-M-E-M-F-B-S, puis recueillir les cellules par centrifugation à 1000 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Resuspendre les cellules dans un millilitre de D-M-E-M-F-B-S frais et analyser 10 000 cellules par puits pour l'expression de la GFP.

Par cytométrie en flux, les cellules uniques vivantes sont sélectionnées à l’aide des paramètres de diffusion avant et de taille. Les cellules positives pour la GFP sont détectées à l’aide du détecteur de fluorescence de la GFP, et les résultats sont présentés sous forme d’histogramme. Les cellules restantes peuvent être replaquées pour être photographiées en fluorescence.

La microscopie du BRCA1 souhaité régule la voie de réparation des cassures double brin de l'ADN par recombinaison homologue. Les cellules ayant subi une réparation par recombinaison homologue sont facilement détectées par microscopie fluorescente. L'épuisement du BRCA1 par ARNi entraîne une forte diminution du nombre de cellules positives pour la GFP détectées.

Le résultat obtenu à partir de la FCA est un histogramme présentant l'intensité de la GFP par cellule sur l'axe des abscisses et le nombre de cellules sur l'axe des ordonnées. En l'absence de plasmide transfecté exprimant I-SCE1, aucune cellule positive pour la GFP n'est détectée.

Les résultats des colonnes deux à six ont tous été obtenus à partir de cellules dans lesquelles un plasmide exprimant ISC un a été transfecté au jour trois. Dans un ensemble typique de résultats provenant d'une seule expérience, 15,5 % des cellules sont positives pour GFP après l'expression de ISC un et la déplétion par ARNi contrôle d'un gène sans rapport ; par comparaison, la déplétion de BRCA un et l'ajout d'un vecteur plasmidique vide réduit la conversion GFP à 0,7 %. L'ajout d'une BRCA un exogène de type sauvage restaure complètement la recombinaison homologue, comme détecté par l'obtention de 15 à 16 % de cellules GFP positives.

De même, l'expression d'une autre variante de signification inconnue. La mutation BRCA1 I21B a entièrement restauré la fonction de recombinaison homologue dépendante de BRCA1. La réintroduction du mutant BRCA1 M18T a eu un effet similaire à celui du contrôle par vecteur.

Étant donné que cette variante s'exprime à des niveaux similaires à ceux de la protéine endogène, cela suggère que la variante BRCA1 M18T est non fonctionnelle dans la recombinaison homologue. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller la croissance des cellules, de noter que les cellules se divisent lentement et avec une faible confluence, et de réduire la quantité de mélange de transfection utilisée. Il est également essentiel d'éliminer le milieu de transfection en temps voulu.

Nous constatons que dans les jours suivant la transfection, il existe un taux élevé de cytotoxicité si des antibiotiques sont inclus dans le milieu. Pour cette raison, tous les milieux utilisés après le premier jour ne contiennent pas d'antibiotiques après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer du sein pour explorer la génétique des variants de BRCA1 dont la signification clinique est inconnue dans les cliniques spécialisées en oncologie.

Nous espérons que le test fonctionnel BRC un développé dans cette étude permettra une meilleure prédiction des effets des variants de BRC un sur la prédisposition au cancer.