Purifiant l'ADN plasmidique des colonies bactériennes en utilisant le kit Qiagen Miniprep Kit

Je viens du laboratoire de Mike Halen, Département de physiologie et de biophysique, université de Californie, Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment utiliser le mini tissu en collagène pour purifier l'ADN à partir de bactéries. Je réalise cette étape dans le cadre d'une expérience de mutagenèse dirigée sur site.

Après avoir obtenu le plasmide, je séquencerai l'insert pour vérifier que les clones sélectionnés contiennent les mutations souhaitées. Avant de réaliser la minipréparation, présentons brièvement ce que nous avons fait hier. Afin de faire croître les bactéries, je dois d'abord ensemencer cinq millilitres d'un milieu LB A, dans des tubes individuels.

Et comme vous pouvez le constater, avant d'ajouter des bactéries dans le tube, le milieu est clair. Ensuite, j'utilise un embout stérile pour inoculer une colonie isolée à partir d'une boîte de gélose aérienne, et je change d'embout à chaque fois afin d'éviter toute contamination. Puis, je place les tubes dans un agitateur et les fais croître à 300 tr/min pendant au moins huit heures, ce qui se fait généralement pendant la nuit.

Il existe trois tampons importants provenant du kit de mini-préparation de collagène : P un, P deux et N trois. Nous mettons généralement P un à quatre degrés car il contient des ARN ; P deux est conservé à température ambiante ; quant à N trois, nous le préparons juste avant l'expérience, après huit heures.

Comme vous pouvez le constater, le milieu est désormais trouble car des bactéries se développent à l'intérieur, et je vais déposer cinq microlitres du milieu sur une autre boîte. Ainsi, une fois que j'aurai vérifié les clones, je pourrai revenir directement aux bactéries sans avoir besoin de faire une autre transformation. Après avoir centrifugé le milieu, vous pouvez observer un joli culot bactérien au fond du tube, et nous allons retirer le surnageant pour le verser dans de l'eau de Javel afin d'éviter toute contamination de l'environnement, tandis que le culot reste en place.

Je vais maintenant ajouter le tampon P1 sur les pastilles de bactéries. Le tampon P1 est un tampon de resuspension destiné à resuspendre les bactéries. Ensuite, je vais pipeter la solution plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de mélanger les bactéries avec le tampon.

À ce stade, vous ne devez observer aucune palette de bactéries dans la solution. Je vais maintenant transférer les bactéries resus bender dans un nouveau tube appol. J'étiquette toujours mes tubes afin de pouvoir les suivre et savoir quelle solution provient de quel clone.

Maintenant, j'ai ajouté le tampon P2 dans chaque tube, et le tampon P2 est un tampon de lyse destiné à lyser les bactéries. Après l'ajout du tampon P2, on observe que la solution n'est toujours pas limpide. À présent, j'inverse tous les tubes plusieurs fois afin d'assurer un bon mélange de la solution.

Et maintenant, vous pouvez constater que la solution devient limpide. J'ajoute maintenant le tampon N trois, et dans chaque tube, le tampon M trois est le tampon de neutralisation. Dès que j'ajoute le tampon N trois, je constate immédiatement la précipitation des protéines, mais j'effectue tout de même plusieurs inversions pour bien homogénéiser la solution.

Après avoir bien mélangé la solution. Voici à quoi elle doit ressembler une fois que j'ai ajouté le tampon et le trois. Maintenant, je vais utiliser l'appareil sge pour faire précipiter les protéines par centrifugation pendant 10 minutes. J'ai assemblé un Cal VAC six s.

J'assemble tous les éléments dans l'ordre, puis je les relie à un système sous vide. À présent, j'aide le dispositif de préparation du cal, la sangle au collecteur. Aujourd'hui, nous n'en ferons qu'un, donc je bloque les autres emplacements.

Nous avons donc un bon vide. Comme vous pouvez le voir, j'ai étiqueté la bande selon mes tubes et, une fois que j'active le vide, j'obtiens un bon niveau de vide. Bon, après avoir centrifugé le tube, vous pouvez observer le culot protéique au fond, tandis que l'ADN devrait rester dissous dans le surnageant.

Maintenant, notre transfert, le surnageant, qui contient de l'ADN, vers les bandes de préparation pour vache, je devrais mentionner que nous devons toujours changer les pointes afin de prévenir la contamination croisée. J'active maintenant l'aspiration. J'arrête maintenant l'aspiration et j'ajoute le tampon PB pour laver la bande, qui contient actuellement de l'ADN sur le filtre.

Maintenant, j'ajoute la solution PB sur la bande pour la laver, et les bandes contiennent encore de l'ADN sur le filtre. Cette fois, je n'ai pas besoin de changer les embouts si je ne touche pas la bande. Maintenant, j'ajoute le tampon P sur la bande de la même manière que j'ai fait pour le tampon PB.

Et je répèterai cette opération deux fois après avoir mis en marche le vide. Comme vous pouvez le voir, la solution P traverse actuellement la bandelette, et nous maintiendrons le vide pendant encore cinq minutes afin de nous assurer que le filtre sera bien sec. Après cinq minutes sous vide, sortez la bandelette de la boîte, puis enveloppez-la dans un essuie-tout Kim. Tapez-la contre la table pour éliminer le tampon P résiduel.

Et maintenant, vous pouvez constater qu’il y a peu de gouttes de couvercle de tampon P, et l’ADN devrait toujours être dans le filtre. Voici les microtubes de collecte. Je les ai étiquetés conformément à la bande.

Maintenant, j'ouvre le vide de la voiture et je le réassemble avec les microtubes de collecte, en m'assurant que les attaches correspondent aux microtubes. Voici à quoi devrait ressembler le bloc collecteur actuellement. Voici l'aspect du bloc sous vide, préparé pour éluer l'ADN depuis la bande vers le microtube.

La bande est en haut et le tube est juste en dessous, étiqueté de la même manière. Ajoutez maintenant de l'eau stérile sur la bande sans appliquer de vide et laissez reposer pendant une minute. Cette fois, lorsque le vide est appliqué longtemps, comme vous pouvez le voir, l'eau traverse la bande et pénètre dans les microtubes de collecte.

L'eau contient l'ADN. Je laisse également le vide activé pendant un certain temps pour m'assurer que toute l'eau sera collectée. Voici les microtubes de collecte contenant la solution d'ADN après cette étape.

Bonjour, je viens de vous montrer comment utiliser un kit de minipréparation au calcium pour purifier l'ADN à partir de bactéries. À présent, j'ai séquencé l'insert pour vérifier les clones corrects, et je devrais mentionner l'utilisation de cette méthode. La quantité d'ADN obtenue est généralement de l'ordre du microgramme.

Bonne chance dans vos expériences. Merci d'avoir regardé.