Name: Lutilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour Staphylococcus aureus Analyse du biofilm (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Apprenez à cultiver des biofilms bactériens avec des réacteurs à flux de goutte et à disque rotatif pour Staphylococcus aureus. Ces méthodes permettent d'étudier la morphologie et la résistance des biofilms.

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NIAID octroi K22AI081748.

1. Le réacteur à biofilm goutte débit <ol><li> Le réacteur à biofilm au goutte à goutte de débit (disponible à partir des technologies Biosurface ou personnalisée des versions conçues peuvent généralement être faites par les ateliers d'usinage université, voir figure 1) est assemblé et autoclavés. Assemblée implique l'apposition des coupons dans les chambres et les couvercles de chambre de fixation. La chambre, avec support du biofilm (bouillon trypticase soja 2 grammes / L et la glycémie 2 grammes / L), et influent tube nutriments sont stérilisés par autoclavage. </li><li> L'inoculation du réacteur à écoulement goutte à goutte est préformé en plaçant le réacteur sur une surface plane, les lignes de serrage tube effluents, remplissant chaque chambre avec 10 ml de bouillon de soja tryptique et l'ajout de 10 uL d'un S. la culture aureus cultivées pendant une nuit dans du bouillon de trypticase soja. Le réacteur est ensuite inoculé dans un incubateur à 37 ° C pendant 18 heures. </li><li> Après 18 heures d'incubation, les tubes de l'effluent est desserré et le réacteur est placé sur un bloc de bois coupé à un angle de 10 °. </li><li> Aseptiquement raccorder le tuyau influents de nutriments dans la bouteille contenant le bouillon flux continu en nutriments. Flux de la ligne tube à travers la pompe et les tubes Premier en exécutant la pompe à une vitesse maximale (varie selon le modèle de pompe). </li><li> Une fois le tuyau influent est amorcée arrêter la pompe et attacher aiguilles connecter (calibre 22, 1 po) à l'extrémité de chaque tube. Essuyez le bouchon d'entrée de chambre avec un mélange éthanol essuyer et aseptiquement insérer les aiguilles à travers le bouchon d'entrée. </li><li> Tournez sur la pompe et permettre aux médias de goutte à goutte lentement (débit ~ 125 pi / min) sur les coupons. Les médias devraient flux descendant le long du coupon à partir du port d'entrée un bouchon sur le port des effluents. Fonctionner le réacteur en flux continu pendant 2-5 jours (selon l'application), parfois vérifier le réacteur pour un bon drainage. </li><li> Pour récolter les biofilms goutte à goutte de flux réacteur, arrêter la pompe et retirez soigneusement les aiguilles du réacteur. Le réacteur peut alors être placé sur une surface plane et les coupons peuvent être retirés de façon aseptique en utilisant des pinces stériles. Si la microscopie est souhaitée, les coupons peuvent désormais être traitées en conséquence (figure 2B est une micrographie électronique à balayage d'un biofilm de S. aureus cultivées dans un réacteur à biofilm goutte à goutte). Si la quantification de la biomasse ou d'études de physiologie du biofilm sont l'objectif de l'étude, le biofilm peut être retiré de le coupon à l'aide d'un grattoir cellulaire. Tout en maintenant les coupons avec une pince, grattez délicatement le biofilm hors coupon dans un tube conique contenant tampon phosphate salin à l'aide d'un grattoir cellulaire. Remarque: pour quantifier les unités formant colonie dans les biofilms, il est nécessaire d'homogénéiser les biofilms récoltées avec un tissu homogénéisateur de désagréger touffes et forment une suspension homogène. Différents modèles de homogénéisateurs tissus sont adaptés à cette application. Nous utilisons un Fisher Scientific Tissuemiser Homogénéisateur (produit # 15-338-420) à pleine vitesse pendant 1 minute pour homogénéiser les échantillons de biofilms. Le défaut d'homogénéiser le biofilm se traduira par une sous-estimation des unités formant colonie présents dans l'échantillon. </li></ol> 2. Le réacteur à disque rotatif biofilm <ol><li> Le réacteur à disque tournant biofilm (disponible à partir de technologies disponibles Biosurface ou peut être fait sur mesure, voir figure 3) est assemblé et autoclavés. Assemblez le réacteur par la première place de la filature coupons le disque dans les fentes du disque tournant et en le plaçant dans un bécher de verre de 1 litre équipé d'un port de débordement. Un numéro de 15 bouchon en caoutchouc avec des trous percés dans ce pour permettre l'écoulement des médias et l'aération est utilisée comme le bouchon du réacteur. Le réacteur, le biofilm des médias (bouillon trypticase soja 2 g / L et la glycémie à 2 g / L), et les tubes d'entrée sont ensuite stérilisés par autoclavage. </li><li> Le réacteur à disque tournant biofilm est inoculé en plaçant 250 ml de milieu stérile dans le réacteur, et l'ajout de 0,5 mL d'une nuit S. la culture aureus cultivées en bouillon trypticase soja. Le réacteur est ensuite placé sur une plaque d'agitation réglée sur 250 rpm et incubée une nuit à la température désirée. </li><li> Après 16 heures d'incubation raccorder le tuyau d'entrée au port sur le réservoir moyen et le connecter à la pompe péristaltique. La pompe est ensuite activer et de flux mis à ~ 0,25 mL / min (débit peut être modifié en fonction du taux de croissance souhaité). </li><li> Après 24 heures d'arrêt du réacteur et aseptiquement retirer le disque sans toucher les coupons biofilm. Retirer les coupons en utilisant une pince stérile et trempette chacun en tampon phosphate salin pour éliminer toute bactérie lâchement. </li><li> Pour tester composé antimicrobien, les puces peuvent être placés dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits contenant des composés d'intérêt. Après incubation, les copeaux sont transférés dans des microtubes 1,5 ml contenant 1 ml de tampon phosphate salin et homogénéisé avec un tissu homogénéisateur pour disperser le biofilm intact. </li><li> Les cellules sont ensuite diluées en série et étalées sur milieu nutritif gélosé pour déterminer colonie viable Formiunités ng. </li><li> Remarque: de nombreuses variantes peuvent être faites sur le protocole ci-dessus. Par exemple, des coupons disque rotatif peut être enduit avec ou fabriqués à partir de potentiel anti-biofilm composés à tester l'efficacité. Dispersants biofilm peut également être évaluée incuber les coupons en composés dispersants et les bactéries quantifier fixé par rapport détaché. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Un exemple de mise en place réacteur à flux goutte à goutte est affiché si la figure 1. Après trois jours de l'écoulement de grandes quantités d'un biofilm s'accumule sur la surface du coupon, la figure 2A. La biomasse totale varie selon les souches bactériennes et les conditions de croissance précis. Un microscope électronique à balayage d'un S. biofilm aureus cultivés dans le réacteur de flux goutte à goutte est montré dans la figure 2B. Un réacteur à disque tournant est montré dans la figure 3A. Le protocole décrit peut être adapté aux exigences spécifiques de manière générale tout micro-organisme capable de former un biofilm. La figure 3B montre le disque en rotation avec 18 disques de plastique apposés. Ces biofilms disque cultivées sont particulièrement bien adaptés pour les tests antimicrobiens et produire des résultats hautement reproductible 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. La configuration de réacteur au goutte à goutte de flux. Les éléments importants sont étiquetés. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Exemple d'un écoulement goutte à goutte S. biofilm aureus. A) Ce biofilm a été cultivé pendant trois jours suivant le protocole décrit. Couvercles des deux premières chambres du réacteur sont enlevés pour montrer le jaune S. biomasse biofilm aureus. B) Sacnning Micrographie électronique d'un S. biofilm aureus cultivés dans le réacteur de flux goutte à goutte. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Le réacteur à disque tournant. A) Exemple d'un réacteur à disque rotatif en marche. Composante clé sont étiquetés. B) Gros plan sur un disque rotatif.

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</ol>

Les biofilms cultivés dans différents réacteurs auront souvent des caractéristiques différentes et chaque réacteur a des applications différentes. Dans ce travail, nous décrivons l&#39;utilisation de deux réacteurs à film biologique: un réacteur à biofilm au goutte à goutte de débit et d&#39;un réacteur à disque tournant. Réacteurs à écoulement goutte à goutte sont utiles pour la croissance faible des biofilms de cisaillement à l&#39;interface air-liquide et sont adaptables à une variété de conditions. Nous les trouvons...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>Réacteurs à écoulement par goutte à goutte</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>Réacteurs à disque tournant</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour staphylococcus aureus analyse du biofilm

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

La plupart des microbes dans la nature on pense qu&#39;il existe en tant que surface associé les communautés dans les biofilms. 1 biofilms bactériens sont encastrés dans une matrice et attaché à une surface. 2 La formation du biofilm et de développement sont souvent étudiés en laboratoire en utilisant des systèmes discontinus tels que des plaques de microtitration ou de débit systèmes, tels que le flux de cellules. Ces méthodologies sont utiles pour le criblage de mutants et chimiques (plaques de microtitration) 3 ou en croissance des biofilms pour la visualisation (cellules d&#39;écoulement) 4. Nous présentons ici des protocoles détaillés pour Staphylococcus aureus croissante dans deux autres types de biofilms système de flux: le flux de réacteur à biofilm au goutte à goutte et le réacteur à disque tournant biofilm. Réacteurs goutte de flux biofilm sont conçus pour l&#39;étude des biofilms cultivés dans des conditions de faible cisaillement. 5 Le réacteur à flux goutte à goutte se compose de quatre canaux de test en parallèle, chacune capable de tenir un coupon standard de lame de verre de microscope entreprises, ou d&#39;une longueur de cathéter ou relais. Le réacteur à flux goutte à goutte est idéal pour la surveillance de microcapteurs, des études générales biofilm, des échantillons de biofilm cryosectioning, forte production de biomasse, les évaluations du matériel médical et des tests de dispositifs médicaux à demeure. 6,7,8,9 Le réacteur à disque tournant est constitué d&#39;un disque en téflon contenant des évidements pour les coupons amovibles. 10 Les coupons amovible peut par fabriqués à partir de tout matériel usinable. Le fond de rotation du disque contient une barre aimantée pour permettre la rotation du disque à créer de cisaillement sur la surface de la surface du liquide, rincer coupons. La totalité du disque contenant 18 coupons est placée dans un récipient en verre 1000 ml réacteur bras latéral. Un milieu de croissance liquide est distribué à travers le vaisseau tandis que le disque est en rotation par un agitateur magnétique. Les coupons sont retirés de la cuve du réacteur et ensuite raclé pour prélever l&#39;échantillon de biofilm pour la poursuite des études ou l&#39;imagerie microscopique. Réacteurs disque rotatif sont conçus pour des évaluations en laboratoire de l&#39;efficacité biocide, l&#39;élimination du biofilm et la performance des matériaux anti-fouling. 9,11,12,13

Les protocoles pour l&#39;utilisation ouverte biofilms débit du système avec des réacteurs à écoulement goutte à goutte et la rotation du disque réacteurs sont présentés en détail.

L&#39;utilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour Staphylococcus aureus Analyse du biofilm

On considère que la plupart des microbes dans la nature existent sous forme de communautés associées à des surfaces au sein de biofilms.1 Les biofilms bactériens sont enfermés dans une matrice et attachés...

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des biofilms bactériens sous une force de cisaillement faible ou modérée, en utilisant soit un réacteur à écoulement par goutte à goutte, soit un réacteur à disque tournant. Les coupons présents dans le réacteur de biofilm sont d'abord inoculés avec des bactéries et incubés à 37 degrés Celsius afin de permettre aux cellules bactériennes d'adhérer aux surfaces de croissance. Une fois que les cellules se sont fixées sur les coupons, un écoulement de milieu de croissance est initié, générant une force de cisaillement qui agit durant le développement du biofilm.Les biofilms matures peuvent ensuite être récoltés pour analyse et observation. Une microscopie électronique à balayage peut être réalisée afin de déterminer l'ultrastructure des biofilms produits. Je suis Blaze Balls.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les cellules d'écoulement, réside dans la production élevée de biomasse et l'obtention facile de biofilms multiples et identiques. Cette procédure sera démontrée par Rachel Stevenson et Kelly Schwartz, respectivement technicienne et étudiante diplômante de mon laboratoire. Le réacteur de biofilm à écoulement goutte à goutte se compose de quatre chambres munies d'orifices d'entrée pour le milieu et d'orifices de sortie pour les déchets.À l'intérieur de chaque chambre se trouve un coupon amovible sur lequel se développe le biofilm. Pour assembler le réacteur de biofilm à écoulement par goutte à goutte, placez les coupons dans chaque chambre parallèle et fixez les couvercles des chambres. Stérilisez le réacteur assemblé ainsi que le tube d'entrée des nutriments en les passant à l'autoclave avant utilisation.Autoclavez également le milieu de croissance pour biofilm afin d'ensemencer le réacteur à écoulement par gouttelettes stérilisé. Placez l'appareil sur une surface plane et fixez les lignes de sortie à l'aide de pinces. Ensuite, remplissez chaque chambre avec 10 millilitres de milieu de croissance stérile à base de bouillon de soja triptyque, puis ajoutez 100 microlitres de staphylococcus aureus.Culture de nuit cultivée dans le même milieu, ajoutée séparément dans chaque chambre. Placer le réacteur inoculé dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 18 heures afin de permettre aux cellules d'adhérer à la surface du coupon. Après l'incubation, démonter l'attache UNC du tube d'effluent et placer le réacteur sur un bloc en bois incliné à un angle de 10 degrés, de manière aseptique.Connectez le tube de nutriment fluide à une bouteille contenant un bouillon nutritif à écoulement continu. Faites passer le tube à travers la pompe et purgez le tube en faisant fonctionner la pompe à pleine vitesse. Une fois le tube fluide purgé, arrêtez la pompe et fixez des aiguilles de calibre 22 d'un pouce à l'extrémité de chaque tube.Essuyez le bouchon d'entrée de la chambre avec un lingette imprégné d'éthanol de manière aseptique. Insérez les aiguilles à travers le bouchon d'entrée. Mettez la pompe en marche et laissez le milieu s'écouler goutte à goutte sur les coupons.À un débit d'environ 125 microlitres par minute, le milieu doit s'écouler vers le bas depuis le port d'entrée jusqu'au port de sortie. Faites fonctionner le réacteur en écoulement continu pendant trois jours. Vérifiez occasionnellement que le réacteur s'écoule correctement.Le drainage est vérifié par inspection visuelle des chambres afin de s'assurer que le milieu ne s'accumule pas dans les chambres. Si le milieu s'accumule, pincer le tube de sortie favorisera généralement un drainage adéquat. Pour récolter les biofilms, arrêter la pompe et retirer les aiguilles du réacteur. Ensuite, placer le réacteur sur une surface plane.Après trois jours d'écoulement continu, les biofilms de staphylococcus aureus apparaissent comme une biomasse jaune répartie sur toute la longueur des coupons inoculés. Une micrographie électronique à balayage du biofilm révèle la présence de staphylococcus aureus recouvrant le coupon en une communauté de biofilm associée à la surface. Afin de quantifier la biomasse obtenue, utilisez des pinces stériles pour retirer les coupons de manière aussi aseptique que possible, récoltez les bactéries à l’aide d’un grattoir à cellules, puis transférez-les dans un tube conique contenant cinq millilitres de PBS stérile.À l’aide d’un tissu, désagréger les agrégats bactériens à l’aide d’un homogénéisateur jusqu’à obtention d’une suspension homogène. Les unités formant des colonies sont quantifiées par ensemencement de dilutions sérielles sur des boîtes de gélose triptyque, suivies d’une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et du comptage des colonies. Le réacteur à biofilm à disque tournant est composé d’un chimostat à travers lequel un milieu de croissance est pompé.Un disque rotatif équipé d'une barre en forme d'étoile et de 18 éprouvettes conçues pour s'insérer dans le disque rotatif. Pour monter le réacteur, insérez d'abord les éprouvettes dans les fentes du disque rotatif. Ensuite, placez le disque chargé à l'intérieur d'un bécher en verre d'un litre muni d'un orifice de trop-plein, puis fermez le réacteur avec un bouchon en caoutchouc numéro 15 comportant un trou pour l'écoulement du milieu et un trou pour l'aération.Stériliser le système en autoclave, y compris le réacteur assemblé et les tubulures d'entrée. Pour ensemencer le réacteur, remplir le bécher avec 250 millilitres de milieu de culture stérile et ajouter 500 microlitres d'une culture de S. aureus réalisée sur bouillon trypticasé soja et incubée toute la nuit. Placer le réacteur sur un agitateur magnétique réglé à 250 tours par minute et l'incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius afin de permettre l'adhésion des cellules aux coupons.Après l'incubation nocturne, reliez le tube d'entrée au port du réservoir de milieu et à la pompe péristaltique. Mettez la pompe en marche et réglez le débit à 0,25 millilitre par minute. Laissez le réacteur fonctionner pendant 24 heures à 37 degrés Celsius afin de récolter les biofilms obtenus.Arrêtez le réacteur de manière aseptique. Retirez le disque sans toucher les coupons. À l’aide de pinces stériles, retirez les coupons et plongez soigneusement chacun d’eux dans du PBS stérile pour éliminer les bactéries faiblement attachées avant le test du composé antimicrobien.De manière aseptique, placer les coupons dans des puits individuels d'une plaque 96 puits contenant les composés d'intérêt. Incuber la plaque pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, transférer les coupons dans des tubes micro-centrifuge de 1,5 millilitre contenant du PBS 1× et disperser les biofilms à l'aide d'un homogénéisateur.Enfin, ensemencer par des dilutions sériées les cellules sur un milieu gélosé nutritif afin de déterminer le nombre d'unités formant des colonies viables par échantillon, comme décrit précédemment. Ce graphique montre le nombre d'unités formant des colonies dans les biofilms préparés à l'aide du réacteur à disque tournant et exposés au peroxyde d'hydrogène, démontrant la capacité de produire jusqu'à 18 biofilms identiques. L'utilisation du réacteur à disque tournant rend cette technique idéale pour les tests de composés antimicrobiens.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en œuvre des biofilms en réacteur à écoulement par goutte-à-goutte et en réacteur à disque tournant. Ces réacteurs à biofilm offrent des alternatives aux biofilms en cellule d'écoulement et en plaque de microtitration, et sont idéaux lorsque l'on a besoin d'une grande quantité de biomasse de biofilm ou lorsque l'on souhaite réaliser des tests antimicrobiens sur des biofilms établis.

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