L'utilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour Staphylococcus aureus Analyse du biofilm

L’objectif global de cette procédure est de faire croître des biofilms bactériens sous une force faible ou modérée à l’aide d’un réacteur à biofilm à écoulement goutte à goutte ou d’un réacteur à disque rotatif. Les coupons dans le biofilm réagissent car ils sont d’abord inoculés avec des bactéries et incubés à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules bactériennes d’adhérer aux surfaces de croissance. Une fois que les cellules se sont fixées aux coupons, un flux de milieux de croissance est commencé à produire une force pure qui opère pendant le développement du biofilm.

Les biofilms matures peuvent ensuite être récoltés pour l’analyse et l’observation des biofilms. L’utilisation de la microscopie électronique à balayage peut être réalisée pour déterminer l’ultrastructure des biofilms produits. Je suis Blaze Balls.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les cellules à flux est qu’une production élevée de biomasse et plusieurs biofilms identiques sont facilement obtenus. Rachel Stevenson et Kelly Schwartz, une technicienne et étudiante diplômée de mon laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Le réacteur à biofilm à flux goutte à goutte se compose de quatre chambres avec des orifices d’entrée pour l’entrée et de sortie des déchets.

À l’intérieur de chaque chambre se trouve un coupon amovible sur lequel le biofilm se développe. Pour assembler le réacteur à biofilm à goutte à goutte, placez les coupons dans chaque chambre parallèle et fixez les couvercles de la chambre. Autoclavez le réacteur assemblé ainsi que la tubulure nutritive influente pour stériliser le système avant utilisation.

De plus, autoclavez le milieu de croissance du biofilm pour inoculer le réacteur à goutte à goutte stérilisé. Placez l’appareil sur une surface plane et fixez les conduites d’effluent. Ensuite, remplissez chaque chambre avec 10 millilitres de milieu de croissance stérile à base de bouillon de soja triptyque et ajoutez 100 microlitres de staphylocoque doré.

Culture de nuit cultivée dans le même milieu dans chaque chambre séparément. Placez le réacteur inoculé dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 18 heures pour permettre aux cellules d’adhérer à la surface du coupon. Après l’incubation, l’UNC serre le tube d’effluent et place le réacteur sur une fraise à blocs de bois inclinée à un angle de 10 degrés. Aseptiquement.

Connectez le tube nutritif fluide à une bouteille contenant du bouillon nutritif à flux continu. Faites passer la conduite de tubulure à travers la pompe et amorcez la tubulure en faisant fonctionner la pompe à pleine vitesse. Une fois le tube fluide amorcé, arrêtez la pompe et fixez des aiguilles de calibre 22 d’un pouce à l’extrémité de chaque tube.

Essuyez le bouchon d’entrée de la chambre avec une lingette à l’éthanol et de manière aseptique. Insérez les aiguilles à travers le bouchon d’entrée. Allumez la pompe et laissez le fluide s’égoutter sur les coupons.

À un débit d’environ 125 microlitres par minute, le média doit s’écouler vers le bas de l’orifice d’arrêt d’entrée à l’orifice d’effluent. Faire fonctionner le réacteur en flux continu pendant trois jours. Vérifier de temps en temps que le réacteur est correctement drainé.

Le drainage est vérifié par une inspection visuelle des chambres pour s’assurer qu’il n’y a pas d’accumulation de fluide dans les chambres. Si le média s’accumule, se pince, le tube d’évacuation favorisera généralement un drainage adéquat pour récolter les biofilms, arrêter la pompe et retirer les aiguilles du réacteur. Placez ensuite le réacteur sur une surface plane.

Après trois jours d’écoulement continu, les biofilms de staphylocoque doré apparaissent sous forme de biomasse jaune répartie sur toute la longueur des coupons inoculés. Une micrographie électronique à balayage du biofilm révèle que le staphylocoque doré recouvre le coupon dans une communauté de biofilm associée à la surface. Afin de quantifier la biomasse obtenue, utilisez des pinces stériles pour extraire les coupons, récoltez les bactéries à l’aide d’un grattoir cellulaire, puis transférez-les dans un tube conique contenant cinq millilitres de PBS stérile.

À l’aide d’un mouchoir, l’homogénéisateur désagrège les amas bactériens jusqu’à l’obtention d’une suspension uniforme. Les unités formant colonies sont quantifiées en plaquant des dilutions en série sur des plaques de sogar triptyques, en incubant pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et en comptant les colonies. Le réacteur à biofilm à disque rotatif est composé d’un stat de chimiothérapie à travers lequel le milieu de croissance est pompé.

Un disque rotatif avec une barre étoile et 18 coupons conçus pour s’adapter au disque rotatif. Pour assembler d’abord le réacteur, chargez les coupons du disque rotatif dans les fentes du disque rotatif. Ensuite, placez le disque chargé à l’intérieur d’un bécher en verre d’un litre avec un orifice de trop-plein et bouchez le réacteur avec un bouchon en caoutchouc numéro 15 avec un trou pour l’écoulement du fluide et un trou pour l’aération.

L’autoclave, le réacteur assemblé et la tuyauterie d’entrée pour stériliser le système. Pour inoculer le réacteur, remplissez le bécher avec 250 millilitres de milieu de culture stérile et ajoutez 500 microlitres d’une culture nocturne de staphylocoque doré cultivé dans un bouillon de soja triptyque. Placez le réacteur sur une plaque d’agitation réglée à 250 rotations par minute et incubez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules d’adhérer aux coupons.

Après l’incubation pendant la nuit, raccorder la tubulure d’entrée à l’orifice du réservoir moyen et à la pompe péristaltique. Allumez la pompe et réglez le débit à 0,25 millilitre par minute. Laissez le réacteur fonctionner pendant 24 heures à 37 degrés Celsius pour récolter les biofilms résultants.

Arrêter le réacteur et de manière aseptique. Retirez le disque sans toucher les coupons. À l’aide d’une pince stérile, retirez les coupons et trempez-les soigneusement dans du PBS stérile afin d’éliminer les bactéries mal fixées pour l’analyse des composés antimicrobiens.

De manière aseptique, placez les coupons dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits contenant des composés d’intérêt. Incuber l’assiette pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, transférez les coupons dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre contenant une fois du PBS et dispersez les biofilms à l’aide d’un homogénéisateur.

Enfin, des dilutions en série des cellules sur une gélose nutritive permettent de déterminer le nombre d’unités viables formant des colonies par échantillon, comme décrit précédemment. Ce graphique montre le nombre d’unités formant des colonies dans les biofilms préparés à l’aide du réacteur à disques rotatifs et exposés au peroxyde d’hydrogène, la capacité de produire jusqu’à 18 biofilms identiques. L’utilisation du réacteur à disque rotatif rend cette technique idéale pour les tests de composés antimicrobiens.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire fonctionner des biofilms de réacteur à goutte et à disque rotatif. Ces réacteurs à biofilm offrent des alternatives aux biofilms à cellules d’écoulement et aux plaques de microtitration, et sont idéaux lorsqu’une grande quantité de biomasse de biofilm est nécessaire ou que des tests antimicrobiens sur des biofilms établis sont souhaités.