L'utilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour Staphylococcus aureus Analyse du biofilm

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des biofilms bactériens sous une force de cisaillement faible ou modérée, en utilisant soit un réacteur de biofilm à écoulement par goutte à goutte, soit un réacteur à disque tournant. Les coupons présents dans le réacteur de biofilm sont d'abord inoculés avec des bactéries et incubés à 37 degrés Celsius afin de permettre aux cellules bactériennes d'adhérer aux surfaces de croissance. Une fois que les cellules se sont fixées sur les coupons, un écoulement de milieu de croissance est initié, générant une force de cisaillement qui agit tout au long du développement du biofilm.

Les biofilms matures peuvent ensuite être récoltés pour analyse et observation. Une microscopie électronique à balayage peut être réalisée afin de déterminer l'ultrastructure des biofilms produits. Je suis Blaze Balls.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les cellules d'écoulement, réside dans le fait qu'elle permet facilement d'obtenir une forte production de biomasse et de multiples biofilms identiques. Cette procédure sera démontrée par Rachel Stevenson et Kelly Schwartz, respectivement technicienne et étudiante diplômante de mon laboratoire. Le réacteur de biofilm à écoulement goutte à goutte se compose de quatre chambres munies d'orifices d'entrée pour le milieu et d'orifices de sortie pour les déchets.

À l'intérieur de chaque chambre se trouve un coupon amovible sur lequel se développe le biofilm. Pour assembler le réacteur de biofilm à écoulement goutte à goutte, placez les coupons dans chacune des chambres parallèles et fixez les couvercles des chambres. Stérilisez le réacteur assemblé ainsi que le tube d'entrée de nutriments en les passant à l'autoclave avant utilisation.

Autoclavez également le milieu de croissance pour biofilm afin d'ensemencer le réacteur à écoulement par gouttelettes stérilisé. Placez l'appareil sur une surface plane et fixez les lignes de sortie à l'aide de pinces. Ensuite, remplissez chaque chambre avec 10 millilitres de milieu de croissance stérile à base de bouillon de soja triptyque, puis ajoutez 100 microlitres de staphylococcus aureus.

Culture de nuit cultivée dans le même milieu, ajoutée séparément dans chaque chambre. Placer le réacteur inoculé dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 18 heures afin de permettre aux cellules d'adhérer à la surface du coupon. Après l'incubation, bloquer aseptiquement le tube de sortie et placer le réacteur sur un bloc en bois incliné à un angle de 10 degrés.

Connectez le tube de nutriment fluide à une bouteille contenant un bouillon nutritif à écoulement continu. Passez le tube dans la pompe et purgez-le en faisant fonctionner la pompe à pleine vitesse. Une fois le tube de perfusion purgé, arrêtez la pompe et fixez des aiguilles de calibre 22 d'un pouce à l'extrémité de chaque tube.

Essuyez le bouchon d'entrée de la chambre avec une lingette imbibée d'éthanol, de manière aseptique. Insérez les aiguilles à travers le bouchon d'entrée. Mettez la pompe en marche et laissez le milieu s'écouler goutte à goutte sur les coupons.

À un débit d'environ 125 microlitres par minute, le milieu doit s'écouler vers le bas depuis le port d'entrée jusqu'au port de sortie. Faites fonctionner le réacteur en écoulement continu pendant trois jours. Vérifiez occasionnellement que le réacteur s'écoule correctement.

Le drainage est vérifié par inspection visuelle des chambres afin de s'assurer que le milieu n'accumule pas dans les chambres. Si le milieu s'accumule, pincer le tube de sortie favorisera généralement un drainage adéquat ; puis arrêter la pompe et retirer les aiguilles du réacteur. Ensuite, placer le réacteur sur une surface plane.

Après trois jours d'écoulement continu, les biofilms de staphylococcus aureus apparaissent comme une biomasse jaune répartie sur toute la longueur des coupons inoculés. Une micrographie électronique à balayage du biofilm révèle la présence de staphylococcus aureus recouvrant le coupon en une communauté de biofilm associée à la surface. Afin de quantifier la biomasse obtenue, utilisez des pinces stériles pour retirer les coupons de manière aussi aseptique que possible, récoltez les bactéries à l’aide d’un grattoir à cellules, puis transférez-les dans un tube conique contenant cinq millilitres de PBS stérile.

À l'aide d'un tissu, désagréger les agrégats bactériens à l'aide d'un homogénéisateur jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Les unités formant des colonies sont quantifiées par ensemencement de dilutions sérielles sur des boîtes de gélose triptyque, suivies d'une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et du dénombrement des colonies. Le réacteur à biofilm à disque tournant est composé d'un chimostat à travers lequel un milieu de croissance est pompé.

Un disque tournant équipé d'une barre en forme d'étoile et de 18 éprouvettes conçues pour s'insérer dans le disque tournant. Pour monter le réacteur, insérez d'abord les éprouvettes dans les fentes du disque tournant. Ensuite, placez le disque chargé à l'intérieur d'un bécher en verre d'un litre muni d'un orifice de trop-plein et fermez le réacteur avec un bouchon en caoutchouc numéro 15 comportant un trou pour l'écoulement du milieu et un trou pour l'aération.

Stériliser le système en autoclave avec le réacteur assemblé et les tubulures d'entrée. Pour ensemencer le réacteur, remplir le bécher avec 250 millilitres de milieu de culture stérile et ajouter 500 microlitres d'une culture de Staphylococcus aureus réalisée au cours de la nuit dans un bouillon de soja triptyque. Placer le réacteur sur un agitateur magnétique réglé à 250 tours par minute et l'incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius afin de permettre l'adhésion des cellules aux coupons.

Après l'incubation nocturne, reliez le tube d'entrée au raccord du réservoir de milieu et à la pompe péristaltique. Allumez la pompe et réglez le débit à 0,25 millilitre par minute. Laissez le réacteur fonctionner pendant 24 heures à 37 degrés Celsius afin de récolter les biofilms obtenus.

Arrêtez le réacteur de manière aseptique. Retirez le disque sans toucher les coupons. À l’aide de pinces stériles, retirez les coupons et plongez soigneusement chacun d’eux dans du PBS stérile pour éliminer les bactéries faiblement adhérentes avant le test du composé antimicrobien.

Placer de manière aseptique les coupons dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits contenant les composés d'intérêt. Incuber la plaque pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, transférer les coupons dans des tubes micro-centrifuge de 1,5 millilitre contenant du PBS 1x et disperser les biofilms à l'aide d'un homogénéisateur.

Enfin, ensemencez par des dilutions sériées les cellules sur un milieu gélosé nutritif afin de déterminer le nombre d'unités formant colonies viables par échantillon, comme décrit précédemment. Ce graphique montre le nombre d'unités formant colonies dans les biofilms préparés à l'aide du réacteur à disque tournant et exposés au peroxyde d'hydrogène, démontrant la capacité de produire jusqu'à 18 biofilms identiques. L'utilisation du réacteur à disque tournant rend cette technique idéale pour les tests de composés antimicrobiens.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en œuvre des biofilms dans des réacteurs à écoulement goutte à goutte et dans des réacteurs à disque tournant. Ces réacteurs à biofilm offrent des alternatives aux biofilms cultivés en cellule d'écoulement ou en plaque microtitration, et sont idéaux lorsque l'on a besoin d'une grande quantité de biomasse de biofilm ou lorsque l'on souhaite effectuer des tests antimicrobiens sur des biofilms établis.