Name: Lisolement des cellules souches de la souris salivaires Gland (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules souches de glandes salivaires murines par digestion enzymatique et mécanique. Cette méthode permet la culture de salisphères avec applications thérapeutiques pour traiter la xérostomie.

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1. Préparation Régent <ol><li> Tampon: 1% (p / v) de sérum albumine bovine dans une solution saline équilibrée de Hank </li><li> Reconstituer les enzymes. L'enzyme hyaluronidase: 40mg / ml, dissous dans du tampon. Collagénase II: 23 mg / mL, dissous dans du tampon. Utiliser des solutions fraîchement préparées enzyme fraîche pour chaque isolement. Une fois dissous, conserver à 4 ° C jusqu'à leur utilisation pour la digestion. </li><li> 50 mM de chlorure de calcium dans l'eau distillée. Stériliser par filtration à travers un filtre de 0,2 uM taille des pores. </li><li> Souris moyennes salivaires des glandes de la culture (MSG): DMEM: F12 avec de la pénicilline (100 UI / ml), streptomycine (100 ug / ml), glutamax (2 mM), facteur de croissance épidermique-2 (20 ng / ml), facteur de croissance des fibroblastes l'insuline -2 (20 ng / ml), N2 complément (1%), (10 pg / ml) et la dexaméthasone (1 uM). </li></ol> 2. Digestion des tissus mécanique et enzymatique <ol><li> Peser les glandes salivaires disséquées. </li><li> Hacher les glandes en une pâte homogène à l'aide des ciseaux de dissection stériles courbes dans une petite boîte de Petri. </li><li> Recueillir tissus hachés dans 14 ml tubes, en utilisant 1 ml de tampon par les tissus sous-maxillaire 80mg. Rincez les boîtes de Pétri nettoyage de tissus en utilisant certains des tampons. </li><li> Ajouter un autre 1 mL de tampon par 80 mg de tissu, suivis de 25 uL solution de collagénase enzyme II, 25 uL solution enzyme hyaluronidase et 250 uL solution de chlorure de calcium par 80 mg de tissu. Si vous travaillez avec de grandes quantités de tissu, les étapes 2.4 à 2.9 peuvent être effectuées dans des flacons T25 culture de tissu pour plus de commodité. </li><li> Incuber dans un bain-marie secouant fixée à 37 ° C pendant 20 minutes. Retirer les tubes et les triturent à la pipette pour mélanger soigneusement l'enzyme à travers le tissu nouveau. </li><li> Remplacer dans un autre bain-marie pendant 20 min. </li><li> Recueillir les tissus par centrifugation à 400 xg, pendant 8 minutes. Rejeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension dans 2 mL de tampon pour chaque tissu de 80 mg, et répétez l'enzyme et l'ajout de chlorure de calcium comme ci-dessus. Incuber 20 minutes en secouant bain-marie. Retirer les tubes et les triturent à la pipette pour mélanger soigneusement les enzymes. </li><li> Incuber pour la finale de 20 min en secouant bain-marie. Recueillir les cellules par centrifugation comme ci-dessus, éliminer le surnageant. </li></ol> 3. Étapes de lavage <ol><li> Resuspendre chaque 80 mg de tissu en 2 mL de tampon et une pipette de laver le tissu sans enzymes. </li><li> Centrifuger comme précédemment à collecter. Rejeter le surnageant. </li><li> Répétez les laver en utilisant une mémoire tampon mL par 80 mg de tissu. Centrifugeuse à recueillir, éliminer le surnageant. </li></ol> 4. Filtrage <ol><li> Solution de tissus Remettre en suspension dans 1 ml de tampon par 80 mg de tissu. </li><li> Ajouter la solution à 100 um taille des pores du filtre placé sur le tube Falcon de 50 ml. Ne pas appliquer plus de 3 ml de solution tissus hachés par colonne, comme des filtres peuvent être bloquées. Laisser s'infiltrer à travers. Enlever la matière filtrée accroché sur le dessous du filtre à la pipette, et ajouter à filtrat. </li><li> Utilisez une seringue avec une aiguille de calibre 26 pour prendre filtrat de 50 ml tubes et d'appliquer des filtres à 50 um taille des pores sur les tubes de 5 ml. Laisser filtrer à travers, en aidant en desserrant les couvercles si nécessaire. </li><li> Tubes à centrifuger comme précédemment à collecter. Rejeter le surnageant. </li></ol> 5. Placage et moyennes <ol><li> Combiner tous les pastilles dans un seul volume. Comptez utilisant compteur de cellules automatisé ou hémocytomètre. </li><li> Cellules de la plaque à une densité de 0,4 x 10 6 cellules par puits de 12 puits plaque, ou 2,67 x 10 6 cellules par flacon de culture tissulaire T25. Ajouter une moyenne MSG ml à chaque puits ou 6 ml dans chaque flacon T25. </li><li> Incuber à 37 ° C. Sphères doit être clairement visible par jour 2. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Après deux à trois jours de culture, de petits agrégats de cellules (salispheres) sera apparente dans les cultures. Salispheres va continuer à croître en taille, sur une période de dix jours dans la culture. Représentant des images de microscopie à contraste de phase d'salispheres sont présentés dans la figure 1. Les cellules en prolifération exprimant des protéines marqueurs de cellules souches associées peuvent être isolés à partir de ces sphères, de manière optimale entre l'isolement jours après 3-5, et sont capables de différenciation en cellules fonctionnelles salive, acineuses produisant. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Salisphere la formation in vitro. Après la digestion mécanique et enzymatique en utilisant le protocole actuel, les sphères de la taille croissante peut être trouvé dans les cultures flottant. Les panneaux sont représentatives d'images de microscopie à contraste de phase de sphères de quelques jours 0 (A), 4 (B), 7 (C) et 10 (D). Barre d'échelle = 50 microns.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

La méthode de culture de tissus décrit ici représente un protocole reproductible pour l&#39;isolement des cellules souches contenant salispheres des glandes salivaires de souris. Les études utilisant des cellules isolées de cette manière ont mis en évidence la capacité de régénération de la glande salivaire cellules souches 9. La transplantation d&#39;une centaine de c-kit + cellules dérivées de la salispheres induite récupération fonctionnelle des glandes salivaires de souris irradiées. Ces données sont intéressantes et fournissent un point de départ pour l&#39;enquête sur les cellules souches pour la thérapie basée xérostomie. Beaucoup de pistes restent à explorer cependant, y compris le profil d&#39;expression marqueur protéique complète des cellules souches, la capacité des glandes sous-maxillaires pour sauver la fonction des glandes parotides irradiés salivaires et vice versa, et la caractérisation de la putatifs dans une niche de cellules souches in vivo des les cellules. Finalement, la traduction de ce protocole d&#39;échantillons de tissus humains et le potentiel ultérieur pour le traitement de la xérostomie chez les patients humains en utilisant des cellules isolées est l&#39;application la plus excitante de la méthode décrite.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Conserver à &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Collagénase II</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Conserver à 4 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Préparer un stock de 10 &amp;#x03BC;g / mL dans du tampon salin phosphate (PBS). Conserver à &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C en aliquots à usage unique.</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Préparer un stock de 25 &amp;#x03BC;g / mL dans du PBS. Conserver à &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C en aliquots à usage unique.</td></tr><tr><td>Supplément N2</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Suivre les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Préparer un stock de 2 mg / mL dans de l’eau du robinet. Ajuster le pH de l’eau à 2-3 à l’aide d’acide acétique glacial avant de dissoudre.</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Filtres stériles pour cellules, taille de pore 100 &amp;mu;M</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubes ronds en polystyrène avec bouchons filtre (taille de pore 50 &amp;mu;M)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement des cellules souches de la souris salivaires gland

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature glandes salivaires d&#39;origine à la fois humains et de souris comprendre un minimum de cinq types de cellules, chacune d&#39;elles facilite la production et l&#39;excrétion de salive dans la cavité buccale. Cellules acineuses séreuses et muqueuses sont les protéines et les muqueuses des usines produisant de la glande, respectivement, et de représenter l&#39;origine de la production de salive. Une fois synthétisés, les différentes enzymatiques et d&#39;autres composants protéiques de la salive sont sécrétées par une série de cellules canalaires portant épithéliales de type morphologique, jusqu&#39;à l&#39;expulsion éventuelle de la salive à travers un conduit d&#39;importants dans la cavité de la bouche. La composition de la salive est également modifié par les cellules canalaires pendant ce processus. Dans la manifestation de maladies telles que le syndrome de Sjögren, et dans certaines situations cliniques telles que la radiothérapie pour les cancers de la tête et du cou, la production de salive par les glandes est considérablement réduite 1,2. La xérostomie qui en résulte, une sensation subjective de bouche sèche, affecte non seulement la capacité du patient à avaler et à parler, mais encourage également le développement de la carie dentaire et peut être socialement invalidante pour celui qui souffre. La restauration de la production de salive dans les conditions ci-dessus cliniques représente donc un besoin clinique non satisfait, et comme tel, plusieurs études ont démontré la capacité de régénération des glandes salivaires 3-5. Suite à l&#39;isolement des cellules souches, comme les populations de cellules de différents tissus au sein de la souris et le corps humains 6-8, nous avons montré en utilisant la méthode décrite que les cellules souches isolées à partir de glandes salivaires de souris peut être utilisée pour sauver la production de salive dans salivaires irradiées glandes 9,10. Cette découverte ouvre la voie pour le développement de base de cellules souches thérapies pour le traitement de la xérostomie conditions chez les humains, et aussi pour l&#39;exploration de la glande salivaire comme un microenvironnement des cellules contenant des multipotentes auto-renouvellement des capacités.

Un protocole optimisé pour l&#39;isolement des cellules souches de la glande salivaire de souris est décrite. La méthode emploie digestion enzymatique et mécanique, et permet d&#39;isoler les cellules contenant salispheres avec des caractéristiques de cellules souches.

L&#39;isolement des cellules souches de la souris salivaires Gland

Les glandes salivaires matures, tant d'origine humaine que murine, comprennent au minimum cinq types cellulaires, chacun d'eux facilitant la production et l'excrétion de ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'isolement de cellules souches putatives à partir de glandes SIV neuronales. Cela est réalisé en premier lieu par la récolte de glandes salivaires sous-mandibulaires chez des souris adultes. La deuxième étape de la procédure consiste à utiliser des ciseaux courbes pour transformer le tissu en une pulpe homogène.La troisième étape de la procédure consiste à poursuivre la digestion du tissu à l'aide de collagénase et d'enzymes liase plus actives. Il convient de veiller à ne pas trop digérer le tissu. Étant donné qu'une suspension cellulaire complète ne donne que peu de sphéroïdes, des agrégats de deux à trois cellules sont optimaux.La dernière étape de la procédure consiste à filtrer l'homogénat à travers des filtres de 100 microns et de 50 microns. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant la culture et l'isolement de cellules souches des glandes SIV grâce à l'utilisation combinée d'une digestion mécanique et enzymatique de glandes SIV entières. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement de la xérostomie, également connue sous le nom de bouche sèche, qui peut résulter d'un traitement par radiothérapie.Les cellules souches des glandes salivaires peuvent être utilisées pour traiter la xérostomie chez les patients atteints de cancers de la tête et du cou. Avant de commencer cette procédure, préparez les tampons, la souris, la culture de glande salive, les milieux et les solutions enzymatiques. Conformément au protocole écrit joint, toutes les étapes de dissection et de culture tissulaire doivent être réalisées dans une hotte stérile de culture tissulaire.Après avoir isolé et disséqué les glandes salivaires de la souris, peser le tissu glandulaire sur une balance et noter le poids. Utiliser une spatule pour transférer les glandes salivaires dans une petite boîte de Pétri et, à l’aide de ciseaux de dissection courbes, hacher les glandes en une pulpe homogène. Couper l’extrémité d’une pipette P 1000 pour obtenir une ouverture plus large.Utilisez ceci pour pipeter un millilitre de tampon par 80 milligrammes de tissu dans la boîte de Pétri et transférez l'homogénat dans un tube de centrifugation de 15 millilitres. Ajoutez un autre millilitre de tampon par 80 milligrammes de tissu dans la boîte de Pétri. Pour récupérer les éventuels petits morceaux de tissu restants, ajoutez cette solution au tube de centrifugation.Ensuite, ajouter rapidement 250 microlitres de solution de chlorure de calcium, 25 microlitres de solution d'hyaluronidase et 25 microlitres de solution de collagénase. Deux solutions enzymatiques par 80 milligrammes de tissu. Placer le tube contenant le tissu et le mélange enzymatique dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius et incuber pendant 20 minutes.Après l'incubation, retirez les tubes. Utilisez une pipette P 1000 dont l'extrémité a été préalablement coupée pour mélanger soigneusement le tissu et la solution enzymatique environ 10 fois. Replacez le tube dans le bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes supplémentaires.Après la deuxième période d'incubation, centrifuger l'échantillon à 400 × g pendant huit minutes ; après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre soigneusement le culot dans deux millilitres de tampon par 80 milligrammes de tissu initial. Ajouter ensuite 250 microlitres de solution de chlorure de calcium, 25 microlitres de solution d'hyaluronidase et 25 microlitres de collagénase. Deux solutions enzymatiques par 80 milligrammes de tissu.Et remettre le tube au bain-marie agité à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirer les tissus du bain-marie et répéter les incubations précédentes après incubation. Centrifuger l'échantillon à 400 fois la gravité pendant huit minutes.Encore une fois, puis jetez le surnageant. Le tissu est maintenant prêt à être lavé en vue de la filtration après la centrifugation précédente. Pipetez deux millilitres de tampon dans le tube et triturez soigneusement.Resuspendre le culot palt après la resuspension. Centrifuger l'échantillon à 400 × g pendant huit minutes. Puis éliminer le surnageant à l'aide d'une pipette.Un millilitre de tampon par 80 milligrammes de tissu dans le tube, puis triturer à nouveau. Pour resuspendre le culot. Répéter la centrifugation.Centrifuger à 400 fois la gravité pendant huit minutes. Pendant la centrifugation, préparer l'étape de filtration en plaçant un filtre de taille de pore de 100 micromètres au-dessus d'un tube à centrifuger de 50 millilitres. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter par pipette un millilitre final de tampon par 80 milligrammes de tissu dans le tube. Utiliser une pointe P1000 dont l'extrémité a été coupée, puis pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de garantir une resuspension complète du culot.Ensuite, transférez l'homogénat vers le filtre de taille de pore de 100 microns et laissez-le s'écouler à travers le filtre dans le tube de centrifugation de 50 millilitres. Il est important de ne pas appliquer plus de trois millilitres d'homogénat, car le filtre pourrait s'obstruer. Si ce volume est dépassé, utilisez une pipette P 1000 pour retirer tout tissu accumulé sur la face inférieure du filtre et transférez ce tissu dans le tube de centrifugation de 50 millilitres contenant le filtrat.À l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26, aspirez l’homogénat du tube de centrifugation de 50 millilitres et appliquez-le sur le bouchon filtrant à pores de 50 microns placé sur le tube de cinq millilitres. Laissez l’homogénat s’écouler à travers le filtre. Si la filtration est lente, desserrez légèrement le bouchon filtrant, car il pourrait être trop serré.Un bouchon peut empêcher la filtration lorsque tout l'homogénat est passé à travers le filtre dans le tube. Centrifuger l'échantillon à 400 fois la gravité pendant huit minutes. Après la centrifugation, les cellules en culot sont prêtes à être ensemencées en plaque.Les cellules des glandes salivaires commencent par être resuspendues dans un millilitre de milieu MSG par 80 milligrammes de tissu. Dénombrer les cellules selon les protocoles standard. Ici, un compteur automatique de cellules est utilisé pour déterminer le nombre de cellules.Calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour obtenir 0,4 fois 10 à la puissance 6 cellules, puis déterminez le nombre de puits pouvant être ensemencés. Ajoutez un millilitre de milieu MSG par puits dans une plaque de culture de 12 puits. Assurez-vous que la suspension cellulaire est bien homogénéisée, puis ajoutez à chacun des puits le volume requis de suspension cellulaire pour obtenir 0,4 fois 10 à la puissance 6 cellules.Transférez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après deux jours d'incubation, examinez les cultures pour la présence de sphères SLO et pour l'absence d'ace dans nos cellules. Ceci est un exemple de tissu de glande salivaire de souris traité comme décrit et visualisé par microscopie de contraste de phase, de zéro à 10 jours en culture ; les petits agrégats cellulaires sont des sphères SLO, qui augmentent de taille tout au long de cette période.On voit ici une coloration immuno de cultures sphériques d'organoides salivaires (SLO) représentatives de trois à cinq jours pour le marqueur des cellules souches. Kit protéine C. Analyse par cytométrie en flux, l'expression du marqueur « sea kit » confirme la présence de cellules souches putatives dans les cultures de SLO. Les sphères de SLO âgées de trois à cinq jours peuvent également être différenciées pour former des structures semblables à des acini et des canaux, avec une morphologie similaire à celle observée dans la glande salivaire native.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les glandes salivaires et les cellules souches des glandes salivaires murines.

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