Name: Manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Apprenez à étendre des axones tout en mesurant les forces impliquées grâce à des aiguilles en verre calibrées. Cette méthode permet d'étudier la biophysique du développement neuronal avec précision.

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Nous tenons à souligner la contribution importante de M. Robert E. Buxbaum dans le développement de cette méthodologie.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Techniques d&#39;appliquer et de mesurer les forces cellulaires ont une longue histoire 9. Notre méthode a été initialement motivé par le travail de Dennis Bray, qui ont utilisé des aiguilles de verre semblable à la nôtre de «tracter» les neurones à un taux constant en utilisant un dispositif motorisé hydraulique 10. Il ya de nombreux moyens alternatifs d&#39;application de forces pour les cellules qui comprennent: moteurs pas à pas 11, 12 billes magnétiques, les poutres 13 et...

<table><tbody><tr><td>Tube cap. R-6</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>Tube en verre R-6, diamètre extérieur 0,9 mm, diamètre intérieur 0,6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>Tireur BB-CH</td><td>Mecanex S.A., Genève, Suisse</td><td>BB-CH puller</td><td>Utiliser le mode 4 Alt avec CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>Fil Chromel 0,001&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>Fil thermocouple non gainé, bobine de 50 pieds, maintenant appelé Chromega</td></tr><tr><td>Fil Constantan 0,003&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>Fil thermocouple non gainé, bobine de 50 pieds</td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox n°5</td></tr><tr><td>Support universel pour microscope sur bras articulé</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 ou 90430</td><td>La plupart des marques ou types de supports sur bras articulé conviendront pour cet usage</td></tr><tr><td>Micromanipulateur mécanique</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>Micromanipulateur grossier à entraînement direct, trois axes</td></tr><tr><td>Micromanipulateur hydraulique</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>Actuellement disponible sous la référence MMO-203, type à trois axes mobiles</td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>Ensemble de 3</td></tr><tr><td>Support simple pour instrument</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>Support double pour instrument</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur mécanique</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>Monture sur tige, 1 support de sonde, modèle droit 430001</td></tr><tr><td>Micromanipulateur mécanique à manette</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscope inversé</td></tr><tr><td>Table d'isolation Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td>Série 1200</td><td>Notre modèle est le 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubateur</td><td>Construit maison (voir référence 19)</td><td></td><td>Référence 19, nécessite le contrôleur mis à jour indiqué ci-dessous</td></tr><tr><td>Contrôleur de température programmable</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>Remplace le contrôleur de température obsolète PXV3</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Microscope inversé, vers 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10, binoculaire pour dissection</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Autres microscopes de dissection peuvent convenir</td></tr></tbody></table>

manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Manipulations de cellules et d&#39;extension des axones neuronaux qui peut être accompli avec le verre calibrées de micro-fibres capables de mesurer et d&#39;appliquer des forces dans la gamme de 1,2 10-1000 μdyne. Les mesures de force sont obtenues par l&#39;observation de la flexion Hooke des aiguilles de verre, qui sont calibrés par une méthode directe et empirique 3. Équipement requis et les procédures de fabrication, d&#39;étalonnage, le traitement et l&#39;utilisation des aiguilles sur les cellules sont entièrement décrits. La force de régimes types cellulaires différents utilisés précédemment et dans laquelle ces techniques ont été appliquées démontrer la flexibilité de la méthodologie et sont donnés comme exemples d&#39;une enquête future 4-6. Les avantages techniques sont l&#39;continu &quot;visualisation&quot; des forces produites par les manipulations et la capacité d&#39;intervenir directement dans une variété d&#39;événements cellulaires. Il s&#39;agit notamment de la stimulation directe et la régulation de la croissance axonale et la rétraction 7, ainsi que le détachement et mesures mécaniques sur tout type de cellule cultivée 8.

Mesures d&#39;application directe et des forces sur les neurones dans la gamme 2000-1000 Microdyne sont atteints avec une grande précision en utilisant des aiguilles de verre calibré. Cette méthodologie peut être utilisée pour contrôler et mesurer plusieurs aspects du développement axonal, y compris l&#39;initiation axonale, la tension axonale, la vitesse d&#39;élongation des axones, et les vecteurs de la force.

Manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale

Les manipulations cellulaires et l'extension des axones neuronaux peuvent être réalisées à l'aide de microfibres de verre calibrées, capables de mesurer et d'appliquer des forces dans le...

L'objectif de cette expérience est d'étirer un axone tout en mesurant précisément les forces. Pour ce faire, une aiguille de référence en fil métallique est fabriquée et directement étalonnée ; ensuite, des aiguilles de référence en fil, étalonnées, intermédiaires et de travail sont préparées dans la plage de forces souhaitée. Puis, les cônes de croissance sont tractés à l'aide d'une aiguille de travail afin d'allonger un axone.L'allongement axonal résultant est enregistré et les forces sont mesurées en fonction de la flexion de l'aiguille étalonnée. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles concernant la biophysique de l'allongement de l'axone. Commencez cette procédure en utilisant un tireur d'aiguilles micrométrique réglable et des tubes capillaires en verre pour fabriquer des aiguilles à extrémités effilées d'environ quatre millimètres de longueur.Conserver les aiguilles dans une boîte de Pétri de 160 millimètres couverte. Ensuite, fabriquer une aiguille de calibration en fil en insérant un fil en chromel de 0,001 pouce à l'intérieur d'une aiguille en verre dont la pointe a été cassée. Extraire le fil par la pointe sur une longueur de 26 millimètres et le fixer en place avec de la colle cyanoacrylate.Courbez le dernier millimètre du fil en forme de crochet. Ensuite, fabriquez de micro-poids à partir d'un mètre de fil de diamètre constant de 0,003 pouces. Pour mesurer le fil, fixez-le avec du ruban adhésif sur une règle graduée d'un mètre.Pour l'aider à être aussi droite que possible, pesez le fil d'un mètre et coupez-le précisément en morceaux d'un centimètre. Courbez plusieurs morceaux du fil en forme de vase.Étaloner les aiguilles en fil métallique nécessite un microscope stéréoscopique équipé d'une échelle verticale de mesure et d'un micromanipulateur. Le microscope est incliné de 90 degrés sur le côté. On utilise un support universel à bras articulé afin d'observer la déflexion vers le bas de l'aiguille en fil métallique.Monter l'aiguille métallique dans un porte-outil sur un micromanipulateur de manière qu'elle soit perpendiculaire à l'axe optique du microscope. Aligner le crochet de l'aiguille métallique avec une marque radiale. Accrocher le micro-poids d'un centimètre au crochet et enregistrer la déflexion.La constante de flexion du fil de référence est égale à la masse du micro-poids divisée par la déflexion observée. Après l'étalonnage, préparez l'aiguille pour l'étape suivante en coupant le crochet au point de passage avec la lame de rasoir afin d'étalonner les aiguilles intermédiaires en verre. Un microscope inversé équipé d'un oculaire micrométrique est nécessaire.D'un côté de la platine du microscope se trouve un micromanipulateur mécanique utilisé pour maintenir l'aiguille métallique. De l'autre côté se trouve un micromanipulateur hydraulique utilisé pour déplacer l'aiguille intermédiaire en verre. À l'aide des micromanipulateurs, rapprocher les deux aiguilles au centre du champ optique selon un angle de 45 degrés, dans une boîte de Pétri de 160 millimètres sur 30 millimètres contenant de l'eau, sous un grossissement 10 x. Ensuite, effectuer une série de déflexions pour chacune de ces déflexions.Notez la quantité initiale déviée et la position finale à charge nulle de l'aiguille de verre après relâchement. Cela crée 10 paires de points de données. Pour préparer les 10 paires de données destinées à une régression linéaire, la déviation initiale est soustraite du second nombre des paires enregistrées.Ajoutez cinq paires de contrôle de zéro zéro aux 10 paires de données expérimentales afin d'ancrer la régression linéaire à zéro, ce qui correspond à une déflexion nulle, en l'absence de force. Calculez la régression linéaire à l'aide de ces 15 paires de données.La constante de raideur de l'aiguille intermédiaire en verre est égale à la constante de flexion connue des aiguilles métalliques divisée par la pente de la droite de régression. Étalonner ensuite les aiguilles en verre de travail par rapport à l'aiguille intermédiaire en verre comme décrit ci-dessus. Les aiguilles en verre dont la valeur est inférieure à deux micromètres par micromètre peuvent être légèrement raccourcies afin de les amener dans une plage de rigidité appropriée.Appuyez les aiguilles à revêtir contre le côté d'un morceau d'argile tenu au-dessus d'un bécher de 10 millilitres contenant la solution de facteur d'attachement, de sorte que seule la pointe de l'aiguille soit immergée dans la solution de manière séquentielle. Plongez les aiguilles dans une solution de polylysine à 0,1 % pendant 30 minutes. Ensuite, plongez les aiguilles dans conval et a pendant 30 minutes tout en traitant l'aiguille avec des facteurs d'attachement.Activez le système de chauffage de l'incubateur ou de la platine du microscope afin que la platine atteigne un équilibre thermique. La station de travail de traction, installée sur une table d'isolation des vibrations, se compose d'un microscope inversé équipé d'un manipulateur hydraulique qui maintient une extension personnalisée en équilibre, dans laquelle est inséré le support double pour outils.Insérez une aiguille de référence non étalonnée dans un porte-aiguille de manière à ce qu'elle dépasse au maximum. Placez cet ensemble dans le côté droit du porte-outil double. Ensuite, insérez l'aiguille de travail traitée dans un porte-aiguille de sorte qu'elle dépasse de moitié par rapport à l'aiguille de référence, et placez-la dans le côté gauche du porte-outil double.Régler au préalable le micromanipulateur hydraulique de manière à ce que le contrôle vertical soit complètement relevé. Rapprocher ensuite les deux pointes d'aiguille à l'aide de la vis de réglage latérale. Positionner l'aiguille.Ainsi, examinez visuellement la paire de pointes par le côté et utilisez la vis droite haut-bas pour amener les pointes dans le même plan. Balancez le porte-outil et placez les extrémités de l'aiguille dans le trajet lumineux au-dessus de la surface du milieu. Inclinez-les fortement vers le bas.Serrer la vis de la rotule à la base. Faire la mise au point vers le haut au-dessus des cellules, sur le fond de la boîte, en utilisant l'objectif 10 x. Abaisser les aiguilles dans le milieu pour localiser les extrémités des aiguilles dans le champ visuel du microscope.Avant de les enfoncer trop profondément dans la boîte de culture. Déplacez l'aiguille de côté à côté, vers l'arrière ou vers l'avant, et observez leur ombre. Dès qu'une aiguille est visible, tournez la vis de déplacement latéral pour déterminer quelle aiguille a été repérée.S'il bouge avec la vis, il s'agit de l'aiguille de référence. S'il ne bouge pas, c'est l'aiguille étalonnée. Une fois les deux aiguilles localisées, utilisez les commandes fines du porte-outil double pour les aligner.L'objectif est d'espacer les extrémités des aiguilles d'environ 50 micromètres, soit environ un pouce sur l'écran. La référence doit se situer plus haut au-dessus de la boîte de culture et être donc légèrement floue. Lorsque l'aiguille de traction est au point sur la boîte, enregistrez l'image de cette position finale ajustée.La séparation des aiguilles constitue la distance de référence zéro. Soulevez les aiguilles au-dessus du plan de l'échantillon et placez-les en bordure du champ visuel. Sélectionnez un axone expérimental en suivant les directives du protocole écrit.Rapprochez les aiguilles près du cône de croissance de l'axone et enregistrez à nouveau la distance zéro. Ensuite, mettez sous pression l'enceinte antivibrations pour manipuler un cône de croissance vers l'aiguille. Placez l'aiguille de remorquage à côté du cône de croissance en dessous de celui-ci, puis abaissez l'aiguille contre le fond de la boîte.Cela provoquera une déviation vers le haut de l’aiguille, qui fléchira et glissera le long de la boîte en pénétrant dans le cône de croissance, puis détachera le cône de croissance et le déplacera vers le haut. Appuyez l’aiguille contre le fond de la boîte suffisamment pour que le cône de croissance s’accroche à l’extrémité de l’aiguille, mais pas trop fort afin qu’il ne glisse pas par-dessus l’aiguille et ne recule pas. Attendez 20 minutes pour permettre à l’adhérence de se stabiliser.Lorsque le cône de croissance est sur l'aiguille, appliquez une légère tension en déplaçant l'aiguille vers la droite et en la relevant légèrement. Compensez le mouvement vers le bas de l'aiguille en la déplaçant un peu vers l'avant lorsqu'elle est relevée. Relevez l'aiguille par étapes jusqu'à ce que le prolongement attaché s'étende perpendiculairement à l'aiguille et au-dessus de la surface de la boîte. Le remorquage s'effectue en éloignant les aiguilles du corps cellulaire.Par petits accroissements, les forces sont observées sous la forme d'un écart croissant entre les aiguilles, tandis que la tension augmente progressivement. Observer attentivement tout signe de détachement du cône de croissance par rapport à l'aiguille. Maintenir le niveau du milieu dans la boîte en ajoutant de l'eau chaque heure afin de compenser l'évaporation.À l’aide d’un repère sur le côté de la cuve indiquant la profondeur initiale, ajoutez lentement de l’eau sur le côté de la cuve à l’aide d’une pipette, en vous éloignant des aiguilles, à la fin d’une expérience. Avant de retirer les aiguilles de la cuve, vérifiez à nouveau la distance zéro. Lisez les positions des aiguilles le long de l’axe horizontal sur l’écran.Enregistrez également la position du corps cellulaire et les moments où la distance de séparation des aiguilles, moins la distance nulle non chargée, multipliée par la constante de flexion de l'aiguille, est égale aux microns de force appliquée. Voici un exemple de champ de cellules avec plusieurs choix possibles pour contrôler le développement axonal. L'axone horizontal doté d'un gros cône de croissance constitue un bon choix.Le corps cellulaire est positionné près du bord de l'écran et les aiguilles sont rapprochées du cône de croissance. Une image est prise de la séparation des aiguilles non chargées, qui correspond à la distance zéro. Avant le début de l'expérience, l'aiguille de traction est positionnée contre le cône de croissance afin de vérifier si un attachement spontané peut être obtenu.Ensuite, l'aiguille est un peu plus enfoncée dans le cône de croissance. La manœuvre de poussée vers le haut est réalisée en abaissant l'aiguille contre le fond de la boîte, ce qui provoque la flexion de l'aiguille et son glissement dans le cône de croissance, le détachant ainsi. Un léger accroissement de tension vers l'avant a également été appliqué.Après 15 minutes, l'axone semble s'être étendu avec le mouvement vers l'avant de l'aiguille. Ensuite, une tension supplémentaire est appliquée à l'aiguille de remorquage et le relèvement de l'aiguille commence. Une tension supplémentaire est ajoutée, indiquée par l'augmentation de l'écartement entre les aiguilles.À ce stade, l'axone s'étend clairement. L'aiguille de référence n'a pas avancé, mais l'axone a poussé vers elle, réduisant ainsi la tension. En outre, les aiguilles ont été légèrement relevées.Ici encore, une tension supplémentaire est appliquée à l'aiguille de traction. Une croissance significative s'est produite en réponse à la tension appliquée à l'aiguille de traction fléchie. À la fin de l'expérience, un dernier contrôle à zéro est effectué.L'ensemble du processus est illustré dans cette séquence en accéléré. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étalonner les aiguilles, manipuler le cône de croissance sur une aiguille et mesurer les forces tout en allongeant un axone.

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