Name: Manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Apprenez à étendre des axones tout en mesurant les forces impliquées grâce à des aiguilles en verre calibrées. Cette méthode permet d'étudier la biophysique du développement neuronal avec précision.

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Nous tenons à souligner la contribution importante de M. Robert E. Buxbaum dans le développement de cette méthodologie.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Techniques d&#39;appliquer et de mesurer les forces cellulaires ont une longue histoire 9. Notre méthode a été initialement motivé par le travail de Dennis Bray, qui ont utilisé des aiguilles de verre semblable à la nôtre de «tracter» les neurones à un taux constant en utilisant un dispositif motorisé hydraulique 10. Il ya de nombreux moyens alternatifs d&#39;application de forces pour les cellules qui comprennent: moteurs pas à pas 11, 12 billes magnétiques, les poutres 13 et...

<table><tbody><tr><td>Tube cap. R-6</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>Tube en verre R-6, diamètre extérieur 0,9 mm, diamètre intérieur 0,6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>Tireur BB-CH</td><td>Mecanex S.A., Genève, Suisse</td><td>BB-CH puller</td><td>Utiliser le mode 4 Alt avec CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>Fil Chromel 0,001&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>Fil thermocouple non gainé, bobine de 50 pieds, maintenant appelé Chromega</td></tr><tr><td>Fil Constantan 0,003&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>Fil thermocouple non gainé, bobine de 50 pieds</td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox n°5</td></tr><tr><td>Support universel pour microscope sur bras articulé</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 ou 90430</td><td>La plupart des marques ou types de supports sur bras articulé conviendront pour cet usage</td></tr><tr><td>Micromanipulateur mécanique</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>Micromanipulateur grossier à entraînement direct, trois axes</td></tr><tr><td>Micromanipulateur hydraulique</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>Actuellement disponible sous la référence MMO-203, type à trois axes mobiles</td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>Ensemble de 3</td></tr><tr><td>Support simple pour instrument</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>Support double pour instrument</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur mécanique</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>Monture sur tige, 1 support de sonde, modèle droit 430001</td></tr><tr><td>Micromanipulateur mécanique à manette</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscope inversé</td></tr><tr><td>Table d'isolation Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td>Série 1200</td><td>Notre modèle est le 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubateur</td><td>Construit maison (voir référence 19)</td><td></td><td>Référence 19, nécessite le contrôleur mis à jour indiqué ci-dessous</td></tr><tr><td>Contrôleur de température programmable</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>Remplace le contrôleur de température obsolète PXV3</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Microscope inversé, vers 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10, binoculaire pour dissection</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Autres microscopes de dissection peuvent convenir</td></tr></tbody></table>

manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Manipulations de cellules et d&#39;extension des axones neuronaux qui peut être accompli avec le verre calibrées de micro-fibres capables de mesurer et d&#39;appliquer des forces dans la gamme de 1,2 10-1000 μdyne. Les mesures de force sont obtenues par l&#39;observation de la flexion Hooke des aiguilles de verre, qui sont calibrés par une méthode directe et empirique 3. Équipement requis et les procédures de fabrication, d&#39;étalonnage, le traitement et l&#39;utilisation des aiguilles sur les cellules sont entièrement décrits. La force de régimes types cellulaires différents utilisés précédemment et dans laquelle ces techniques ont été appliquées démontrer la flexibilité de la méthodologie et sont donnés comme exemples d&#39;une enquête future 4-6. Les avantages techniques sont l&#39;continu &quot;visualisation&quot; des forces produites par les manipulations et la capacité d&#39;intervenir directement dans une variété d&#39;événements cellulaires. Il s&#39;agit notamment de la stimulation directe et la régulation de la croissance axonale et la rétraction 7, ainsi que le détachement et mesures mécaniques sur tout type de cellule cultivée 8.

Mesures d&#39;application directe et des forces sur les neurones dans la gamme 2000-1000 Microdyne sont atteints avec une grande précision en utilisant des aiguilles de verre calibré. Cette méthodologie peut être utilisée pour contrôler et mesurer plusieurs aspects du développement axonal, y compris l&#39;initiation axonale, la tension axonale, la vitesse d&#39;élongation des axones, et les vecteurs de la force.

Manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale

Les manipulations cellulaires et l'extension des axones neuronaux peuvent être réalisées à l'aide de microfibres de verre calibrées, capables de mesurer et d'appliquer des forces dans le...

L'objectif de cette expérience est d'étirer un axone tout en mesurant précisément les forces. Pour ce faire, une aiguille de référence en fil métallique est fabriquée et directement étalonnée ; ensuite, des aiguilles de référence en fil, étalonnées, intermédiaires et de travail sont préparées dans la plage de forces souhaitée. Puis, les cônes de croissance sont tractés à l'aide d'une aiguille de travail afin d'allonger un axone.L'allongement axonal résultant est enregistré et les forces sont mesurées en fonction de la flexion de l'aiguille étalonnée. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles concernant la biophysique de l'allongement de l'axone. Commencez cette procédure en utilisant un tireur d'aiguilles micrométrique réglable et des tubes capillaires en verre pour fabriquer des aiguilles à extrémités effilées d'environ quatre millimètres de longueur.Conserver les aiguilles dans une boîte de Pétri de 160 millimètres couverte. Ensuite, fabriquer une aiguille de calibration en fil en insérant un fil en chromel de 0,001 pouce à l'intérieur d'une aiguille en verre dont la pointe a été cassée. Extraire le fil par la pointe sur une longueur de 26 millimètres et le fi

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Une méthode d'ingénierie des tissus uniques a été développée pour allonger les fibres nerveuses dans la culture de nombreux en récapitulant la croissance des axones s'étendent; une forme de croissance des nerfs du système nerveux où s'allongent en conjonction avec la croissance du corps agrandissement.

Croissance stretch Axon: La mécanotransduction de croissance neuronale

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Imagerie à deux photons, couplé à nanodissection laser, sont des outils utiles pour étudier les processus dégénératifs et régénératifs dans le système nerveux central avec une résolution subcellulaire. Ce protocole indique comment étiqueter, image, et disséquer fibres grimpantes simples dans le cortex cérébelleux in vivo.

Laser nanochirurgie de cervelet axones<em&gt; In Vivo</em

Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

Ce protocole décrit l’isolement des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) isolés de rats et la culture de neurones DRG sur un système de culture cellulaire statique pré-étiré pour améliorer l’alignement axonal, avec co-culture ultérieure de cellules de Schwann (SC) pour favoriser la myélinisation.

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Ce manuscrit détaille la fabrication de réseaux de neurones fabriqués par micro-tissus: des constructions tridimensionnelles de taille de micromètre composées de trajets axonaux longs alignés couvrant une ou plusieurs populations neuronales agrégées enfermées dans un hydrogel tubulaire. Ces échafaudages vivants peuvent servir de relais fonctionnels pour reconstruire ou moduler les circuits neuronaux ou comme bancs biofidéliques imitant la neuroanatomie de la matière grise et blanche.

Réseaux de neurones conçus par micro-tissus tridimensionnels inspirés anatomiquement pour la reconstruction, la modulation et la modélisation du système nerveux

Cette procédure décrit comment lancer rapidement, étendre et connecter des neurites organisées dans des chambres microfluidiques en utilisant des billes revêtues de poly-D-lysine fixées sur des micropipettes qui guident l'allongement des neurites.

Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle

Les tests de croissance des neurites fournissent une valeur quantitative sur les processus neuronaux régénératifs. L’avantage de ce logiciel semi-automatique est qu’il segmente les corps cellulaires et les neurites séparément en créant un masque et mesure divers paramètres tels que la longueur des neurites, le nombre de points de branchement, la surface des grappes de corps cellulaires et le nombre de grappes de cellules.

Standardisation d’un nouveau logiciel semi-automatique pour la mesure de l’excroissance des neurites 

Ce protocole décrit un système microfluidique modélisant la dynamique métabolique neuronale post-lésion axonale, permettant l’imagerie, l’analyse multi-omique et les études mécanistes du remodelage métabolique intrinsèque.

Construction de modèles de puce microfluidique pour la construction et l’analyse multi-omique

Apprenez à étendre des axones tout en mesurant les forces impliquées grâce à des aiguilles en verre calibrées. Cette méthode permet d'étudier la biophysique du développement neuronal avec précision.

Manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale

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