Expérience profil bioénergétique utilisant cellules C2C12 de myoblastes

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester l'état fonctionnel des mitochondries dans des cellules vivantes et des mitochondries isolées en mesurant plusieurs paramètres du métabolisme oxydatif à l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire XF 96. Ces paramètres sont la respiration basale, le renouvellement de l'ATP, la fuite de protons et la respiration maximale ou la capacité respiratoire de réserve. Cela est réalisé en ajoutant de manière séquentielle des modulateurs spécifiques de la respiration mitochondriale à des cellules myoblastiques C2C12, puis en mesurant la variation du taux de consommation d'oxygène, ou OCR, un indicateur de la respiration, ainsi que la conversion du glucose en lactate, qui produit de l'ATP par glycolyse.

L'autre voie énergétique majeure dans les cellules est également mesurée sous forme de RCCE, ou taux de acidification extracellulaire. Des profils mitochondriaux peuvent être obtenus, fournissant des informations sur le rôle central que joue la fonction mitochondriale dans la détermination de la durée de vie des cellules. Bonjour, je m'appelle David Nichols.

J'ai été un artiste des mitochondries tout au long de ma carrière, et l'instrument le plus important que j'ai utilisé dans mes études a été l'électrode à oxygène. Si vous pouvez mesurer la vitesse de consommation d'oxygène dans différentes conditions avec des mitochondries isolées, vous obtenez une information extrêmement importante. Lorsque vous passez aux cellules, en particulier aux cellules cultivées dans une plaque multi-puits ou sur un lamelle, les méthodes classiques ne fonctionnent plus.

Ceci est un problème majeur, qui a été résolu il y a quelques années par le développement d'un test en plaque multipuits permettant d'étudier en parallèle la respiration cellulaire selon un format de plaque multipuits. Ce que vous allez observer aujourd'hui est une expérience très simple mais riche en informations, que nous avons conçue afin de surveiller la fonction bioénergétique mitochondriale de base dans des cellules en culture. Pour commencer, ensemencez les cellules dans des plaques de culture cellulaire XF 96 avec 10 000 cellules par puits dans 100 microlitres de milieu de croissance, puis placez-les dans une incubateur à 37 degrés Celsius avec 10 % de dioxyde de carbone.

Les cellules peuvent être analysées dans le XF 96, 24 heures après leur semis, à l'aide du test. L'assistant crée un modèle comportant la disposition par groupes suivante. Les colonnes de un à douze contiennent toutes 10 000 cellules C deux C 12.

Le groupe un en bleu sert de cellules témoins. Le groupe deux en rouge recevra les médicaments oligo Mycine, FCCP et roone. Ensuite, préparez les composés dans le milieu d'essai X-F-D-M-E-M comme décrit dans la partie écrite du protocole.

Oligomycine, FCCP, rotenone. Ces composés sont prédispensés dans le kit de test de stress mitochondrial XF. À l’aide de la station de préparation XF, remplacez le milieu de croissance par le milieu de fonctionnement DMEM.

Enfin, incuber les cellules dans une étuve à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant 60 minutes afin de permettre aux cellules de pré-équilibrer avec le milieu d'essai avant d'ajouter les composés injectables dans la cartouche capteur à partir des composés portés à 37 degrés Celsius. Ensuite, charger les composés dans les orifices d'injection comme suit. Pour les colonnes une à quatre, charger respectivement 16, 18 et 20 microlitres de milieu d'essai XF ou de DMEM dans les orifices A, B et C.

Pour les colonnes cinq à douze, charger 16 microlitres de tout le liga mycin dans le port A, 18 microlitres de FCCP dans le port B et 20 microlitres de rot connu dans le port C. Ensuite, définir les commandes du protocole : régler la boucle à trois fois. Mélanger pendant trois minutes et mesurer pendant trois minutes. Ensuite, cliquer sur démarrer.

Suivez les instructions à l'écran qui indiqueront à l'utilisateur quand charger la cartouche une fois l'étalonnage terminé. Suivez les invites à l'écran et ajoutez la plaque de cellules pour l'expérience. Cliquez ensuite sur continuer et laissez le test s'exécuter.

Retirez la plaque lorsque l'expérience est terminée. Ce test est dérivé de l'expérience classique permettant d'analyser la fonction mitochondriale et sert de cadre pour concevoir des expériences plus complexes visant à comprendre les effets de divers composés sur le métabolisme cellulaire, la fonction mitochondriale et l'ensemble des activités bioénergétiques. Ici, nous avons observé la réponse attendue en termes de taux de consommation d'oxygène lorsque les cellules ont été traitées par chaque composé successivement.

L'oligomycine entraîne une diminution de la synthèse d'ATP en bloquant la complexe mitochondrial V. Puisque les cellules ne peuvent plus synthétiser de l'ATP par phosphorylation oxydative après un traitement à l'oligomycine, elles recourent à la glycolyse pour satisfaire leur besoin en ATP. Ainsi, nous avons observé une augmentation du taux d'acidification extracellulaire (ECAR), un indicateur de la glycolyse, comme cela avait déjà été montré précédemment. Le FCCP agit comme un agent découplant et supprime la limitation de la réentrée des protons.

La respiration s'accélère et est désormais limitée par le transport d'électrons. Enfin, la roténone inhibe le complexe I mitochondrial, ce qui entraîne l'arrêt du flux d'électrons dans la chaîne de transport d'électrons, et par conséquent, la consommation d'oxygène est fortement réduite. On obtient ainsi des informations sur la respiration basale des cellules, le pourcentage de consommation d'oxygène consacré à la production d'ATP, ainsi que la quantité consacrée au maintien du gradient de protons due à une fuite de protons.

En outre, nous pouvons obtenir la vitesse respiratoire maximale dans des conditions de respiration découplée, parfois appelée capacité respiratoire résiduelle. Et enfin, nous pouvons déterminer la quantité de consommation d'oxygène non attribuable à des processus mitochondriaux. Vous venez de le voir avec le Seahorse.

XF 96, une série d'expériences qui fournissent une quantité considérable d'informations sur la bioénergétique mitochondriale dans la cellule. L'expérience de base, d'une importance capitale, que nous appelons expérience numéro un, fournit des données sur la respiration basale, le renouvellement de l'ATP, la fuite protonique mitochondriale et la capacité respiratoire résiduelle. Ces paramètres offrent des informations fondamentales sur l'état bioénergétique des mitochondries dans la cellule.