Une analyse boîte à outils de l'évaluation biochimique, structurel et transcriptomique globale des biofilms buccaux médiée par Streptococcus mutans

Les biofilms formés à la surface des dents sont très complexes et structurés. Des communautés microbiennes enchevêtrées dans une matrice extracellulaire, qui sont exposées à des défis environnementaux constants. L’objectif global ici est de montrer deux composants spécifiques d’une boîte à outils analytique conçue pour faciliter les études structurales et moléculaires, compte tenu de la nature complexe des biofilms oraux en combinant une nouvelle technique d’imagerie par fluorescence avec un logiciel sur mesure pour le traitement et l’analyse des données.

Pour ce faire, il faut d’abord sélectionner des tests spécifiques pour l’analyse du biofilm, du transcriptome et de la structure, y compris une nouvelle approche d’imagerie confocale pour la visualisation simultanée de l’EPS et des bactéries. La deuxième étape de la procédure consiste à recueillir les données brutes des essais biologiques. La troisième étape consiste à traiter les données brutes à l’aide d’un logiciel spécifique, y compris le duo stat nouvellement développé pour l’analyse de colocalisation.

La dernière étape consiste à analyser les données du processus, y compris l’utilisation d’une puce à microarray, d’un logiciel d’exploration de données et d’organisation, d’un visualiseur de données ou d’un MDV. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent comment les agents pathogènes buccaux modifient leur transcriptome et l’architecture des biofilms en réponse à un régime alimentaire complexe, hébergeant des interactions microbiennes à l’aide de notre boîte à outils analytique intégrée unique, fournissant une analyse plus complète du biofilm et une interprétation des données. Bonjour, je m’appelle Michelle Kuh, professeure agrégée au centre de biologie forale du centre médical Universal of Rochester.

Aujourd’hui, nous présentons une boîte à outils analytique pour l’analyse des biofilms. Cette boîte à outils peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les biofilms, comme la façon dont les cellules du biofilm sont structurées, arrangées avec une matrice extracellulaire et comment elles répondent à des défis environnementaux complexes au niveau transcriptomique. Je m’appelle Jean, elle, je suis postdoc dans le laboratoire de Dr.Ks.

Aujourd’hui, je vais vous montrer la partie imagerie de notre boîte à outils. Bonjour, je m’appelle Aise Klein. Je suis professeur adjoint de recherche au laboratoire Dr.Ks.

Aujourd’hui, je vais présenter le logiciel MDV pour l’analyse de données microrayons. Dans cette procédure, des disques d’appétit hydroxylés recouverts de salive sont utilisés comme substituts de surface dentaire sur lesquels des biofilms sont développés. Tout d’abord, ajoutez 2,8 millilitres de milieu de culture inoculé avec des mutants S dans chaque puits d’une plaque de 24 puits protégeant la plaque de la lumière à la dextrine conjuguée LOR 6 47 colorant dans chaque puits jusqu’à une concentration finale d’une micromolaire et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour mélanger le colorant dans le milieu de culture.

Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, lavez deux fois les disques d’hydroxyapatite recouverts de salive stérile dans un tampon AB stérile pour éliminer tout excès de salive ou tout composant salivaire non lié. Placez ensuite les disques verticalement dans le milieu de culture enrichi en colorants, en vous assurant que chaque disque est complètement immergé. Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium et incubez-la à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 heures pour permettre aux biofilms de se former et à la texture conjuguée d’être incorporée dans les exopolysaccharides produits par les cellules bactériennes.

Pour étiqueter d’abord les cellules bactériennes, préparez une plaque de 24 puits avec 2,8 millilitres d’eau stérile milli Q par puits. Ajoutez 1,5 microlitre de colorant cyto nine dans chaque puits jusqu’à une concentration finale d’une micromolaire et protégez la plaque de la lumière. Une fois le biofilm formé, retirez la plaque contenant les disques de l’incubateur.

Lavez chaque disque dans une solution de chlorure de sodium à 0,89 %. Transférez-les ensuite dans la nouvelle assiette contenant le colorant cyto nine. Couvrez la plaque de papier d’aluminium et incubez-la pendant 30 minutes à température ambiante.

Une fois que les cellules ont été colorées, lavez les biofilms et le chlorure de sodium comme précédemment. Ensuite, à l’aide d’une pince, libérez les biofilms du fil dans une boîte de Pétri contenant du chlorure de sodium. Enveloppez la boîte de Pétri avec du papier d’aluminium.

Les biofilms sont maintenant prêts à être visualisés par microscopie confocale à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Numérisez chaque biofilm à cinq à 10 positions sélectionnées au hasard et générez une série Z à chaque position. Pour permettre des reconstructions 3D, ouvrez les images confocales et traitez-les à l’aide d’un logiciel miroir.

Ce rendu tridimensionnel d’images confocales produites à l’aide du programme, Amira, montre un biofilm de mutants S formé sur la surface apathique en utilisant la procédure démontrée. Les cellules bactériennes et les microcolonies sont visibles en vert et sont intégrées dans la matrice du biofilm contenant des exopolysaccharides. En rouge, une vue rapprochée d’une zone sélectionnée peut être générée, ce qui illustre la relation structurelle spécifique des bactéries EPS à l’échelle microscopique.

Utilisez le programme duos stat pour quantifier la quantité de colocalisation de composants distincts du biofilm tels que les bactéries et les exopolysaccharides. Tout d’abord, configurez le chemin d’accès de la nouvelle statistique duo dans la version 5.1 de MATLAB et ouvrez les dossiers d’images contenant les images de la série Z des deux composants du biofilm. Ensuite, choisissez deux canaux qui seront corrélés et analysés.

Les deux piles d’images doivent avoir des tailles de pixels identiques dans toutes les dimensions et le même nombre d’images dans chaque pile. Définissez les seuils pour chaque canal, suivez les instructions de l’interface du logiciel et saisissez les données dans le fichier de traitement des données pour analyse. Cette figure montre comment Duo Stack interprète quantitativement la relation spatiale entre les bactéries et la SCP.

Dans le biofilm, Duo Stack calcule la distribution verticale des bactéries et des DPS de la surface du disque à la phase fluide, comme on le voit ici sur la ligne verte pour les bactéries et la ligne rouge pour l’EPS. Il calcule également la colocalisation des bactéries et du DPS sur l’épaisseur du biofilm. Comme le montre la ligne jaune, les données montrent des proportions plus élevées d’EPS que de bactéries sur toute la profondeur du biofilm, et la plupart des cellules bactériennes sont associées à l’EPS, en particulier à partir des couches intermédiaires et vers le haut.

Afin de garantir l’obtention d’un ARN de haute qualité à partir de biofilms, nous recommandons que l’extraction de l’ARN soit effectuée selon le protocole spécifique au biofilm décrit dans l’article de Curian KU publié en 2007. Dans la revue, des protocoles standard de biochimie analytique sont utilisés pour la préparation de microréseaux CD NA et les tests PCR quantitatifs en temps réel. Afin de faciliter l’analyse des grands ensembles de données générés par les expériences de microarrays, nous avons conçu un logiciel d’exploration et d’organisation de données, le microarray data visualizer ou MDV, qui est disponible en ligne à www.oralgen.anl.gov.

Avant de soumettre les données à MDV, effectuez une analyse statistique comme un test T apparié avec un modèle de variance aléatoire à l’aide de l’outil de réseau BRB, logiciel disponible en ligne avec une valeur seuil P de 0,001 pour la comparaison de classe. Dans cet exemple d’analyse de moutons, des biofilms cultivés à trois concentrations de sucre distinctes et à quatre points temporels ont été effectués. Des comparaisons appariées ont été effectuées à partir de trois limes BRB : 0,5 % de saccharose plus 1 % d’amidon contre 1 % de saccharose, B 0,5 % de saccharose plus 1 % d’amidon contre 0,5 % de saccharose et l’état C 0,5 % de saccharose contre 1 % de saccharose.

Ce panel représente le nombre de gènes détectés exprimés de manière différentielle dans chaque condition et point temporel évalué par comparaison de classe standard à l’aide de l’outil de tableau BRB, ce qui permet d’obtenir un grand nombre de gènes nommés données brutes BRB. Pour la démonstration de MDV, nous nous concentrerons sur le point temporel de 30 heures à l’aide d’Excel. Convertissez les données brutes BRB en fichiers texte limités à l’onglet MDV.

Assurez-vous de supprimer toutes les lettres accompagnées du numéro d’onglet du locus du gène, par exemple dans le nom SMU point 1432 C.Supprimez la lettre C, ouvrez MDV. Ouvrez le menu Fichier et choisissez Sélectionner la source d’annotation. Sélectionnez l’option de fichier plat lorsqu’une boîte de dialogue apparaît.

Utilisez les boutons de navigation pour choisir les fichiers qui contiennent des annotations pour l’ontologie génétique, le numéro, le chemin, les données de classification fonctionnelle et le nom du gène. Allez dans fichier et importez chacun des fichiers convertis au format MDV. Chaque fichier représente une condition expérimentale.

Comparez les gènes exprimés dans chaque condition expérimentale A par rapport à B par rapport à C.In cet exemple, à l’aide de la fonction de diagramme de Venn. Pour cette démonstration, nous nous concentrons sur les gènes exprimés de manière différentielle qui sont uniquement liés aux influences du saccharose et de l’amidon en combinaison. La fonction basée sur le diagramme de Venn est utilisée pour visualiser le nombre de gènes uniques et partagés exprimés dans ces différentes conditions et nous aide à identifier ceux à sélectionner pour une analyse plus approfondie.

Ici, nous sélectionnons uniquement les gènes exprimés différentiellement qui sont uniques dans les conditions A et ou B, mais pas ceux détectés dans C comme indiqué en gris comme indiqué ici. La MDV a considérablement réduit le nombre total de gènes à analyser, tout en filtrant les gènes non pertinents pour le cas expérimental. Dans le menu Fichier, choisissez l’option d’exportation pour enregistrer les données.

En tant que fichiers à onglet limité, les fichiers peuvent ensuite être ouverts dans Excel où la sortie de données peut être organisée et convertie dans les affichages graphiques souhaités. L’organisation des données dans Excel permet l’affichage graphique de la sortie MDV. Ce graphique montre un aperçu de l’expression différentielle de sous-ensembles fonctionnels uniques de gènes qui sont affectés par la combinaison de l’amidon et du saccharose à des stades distincts du développement du biofilm.

Les influences sur le transcriptome des mutants S sont plus prononcées à 30 heures de développement du biofilm qu’à d’autres points temporels. Les résultats nous ont aidés à identifier précisément des sous-ensembles fonctionnels spécifiques de gènes qui sont pertinents pour notre hypothèse de travail, en tenant compte des effets temporels qui ont facilité la sélection des gènes et le processus de validation. À la suite de cette procédure, des méthodes biochimiques et protéomiques peuvent également être mises en œuvre pour répondre à des questions supplémentaires telles que les réponses physiologiques et métaboliques spécifiques des organismes dans les biofilms.

Une telle analyse complète et intégrée aiderait certainement à mieux comprendre comment les biofilms modulent la pathogénicité dans la cavité intérieure, un environnement très dynamique et complexe. Pour plus de détails, veuillez consulter le fichier PDF joint à cet article vidéo.