L'isolement de la souris les cellules épithéliales respiratoires et l'exposition à la fumée de cigarette expérimentale chez Air interface liquide

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules épithéliales des voies respiratoires afin d'étudier les effets toxiques de l'exposition à la fumée de cigarette. Cela est réalisé en disséquant d'abord les trachées de souris, puis en digérant les trachées dans une solution de pronase. La deuxième étape de la procédure consiste à recueillir les cellules épithéliales et à propager la culture en milieu liquide.

La troisième étape consiste à différencier les cultures à l'interface air-liquide. La dernière étape de la procédure consiste à exposer les cellules épithéliales à de la fumée de cigarette apicale à l'interface air-liquide. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant une monocouche complètement différenciée de cellules épithéliales par microscopie en immunofluorescence.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la maladie pulmonaire obstructive chronique, telles que les effets de l'exposition à la fumée de cigarette sur la morphologie des CLIA et les marqueurs biochimiques induits par la fumée de cigarette témoignant d'une lésion cellulaire. Commencez les préparatifs pour cette procédure un jour avant la dissection en préparant les hams. Milieu F 12 contenant des antibiotiques, hams milieu F 12 contenant des antibiotiques et 20 % F-B-S-M-T-E-C, milieu basique contenant des antibiotiques.

Milieu MTEC contenant 5 % de SBF, solution unique d'acide rétinoïque, solutions mères d'acide rétinoïque et milieu de prolifération MTEC selon les instructions du protocole écrit. Stériliser tous les instruments chirurgicaux destinés à être utilisés lors de la dissection le jour de celle-ci. S'assurer que la zone de dissection est propre et que tous les instruments de dissection sont à portée de main.

Stérilisez la hotte de culture tissulaire. Ensuite, travaillez dans la hotte de culture tissulaire. Préparez une solution de 0,15 % de pronase.

Ajouter 15 milligrammes de pronase à 10 millilitres de milieu Hams F12 contenant des antibiotiques dans un tube conique de 50 millilitres. Placer sur de la glace jusqu'à utilisation.

Les trachées de souris sont disséquées à partir de souris en utilisant des procédures chirurgicales standard, désinfecter le tube contenant les trachées et les placer dans la hotte de culture tissulaire. Transférer le tissu trachéal dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du milieu Ham's F12 additionné d'antibiotiques. Utiliser des pinces chirurgicales stériles pour retirer le tissu conjonctif des trachées.

Transférez ensuite les trachées propres dans la deuxième boîte de Pétri de 100 millimètres contenant le milieu Hams F12 avec des antibiotiques. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper les trachées selon l'axe vertical et exposer la lumière.

Transférez les trachées dans le tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de solution de pronase et placez-les au réfrigérateur pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Enfin, préparez des plaques Transwell traitées au collagène un pour utilisation. Le jour suivant, ajoutez 50 milligrammes de collagène un par millilitre d'acide acétique 0,02 N ; pipetez un millilitre de cette solution dans chaque puits d'une 12.

Puits de la plaque. Enveloppez la plaque dans du film parafilm et laissez reposer toute la nuit à température ambiante dans la hotte de culture tissulaire. Le lendemain.

Retournez doucement le tube contenant les trachées de souris de 10 à 12 fois. Laissez ensuite les contenus du tube incuber pendant 30 à 60 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius. Dans la hotte de culture tissulaire, pipetez 10 millilitres de milieu Hams F12 contenant des antibiotiques et 20 % de FBS dans le tube conique contenant le tissu trachéal digéré, puis retournez le tube 12 fois.

Ensuite, pipeter 10 millilitres de milieu Hams F12 contenant des antibiotiques dans 20 % de FBS dans chacun des trois tubes coniques de 15 millilitres. Utiliser une pipette à pasta stérile pour transférer le tissu trachéal de la solution de pronase vers le premier des tubes contenant le milieu Hams F12 supplémenté.

Placer la solution de pronase sur de la glace, boucher le tube contenant le tissu trachéal et retourner doucement le tube 12 fois pour mélanger. Ensuite, à l’aide de la pipette en plastique, transférer le tissu trachéal dans un second tube conique de 15 millilitres et retourner ce tube 12 fois. Répéter la procédure de transfert et de retournement en utilisant le dernier tube conique de 15 millilitres.

Enfin, utilisez la pipette à pâte pour retirer et jeter le tissu trachéal. Récupérez ensuite la solution de pronase sur la glace et mélangez les trois volumes de 15 millilitres de milieu Hams F12 supplémenté avec la solution de pronase. Centrifugez l'échantillon dans la centrifugeuse réfrigérée à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 1 400 tours par minute ; après la centrifugation, jetez le surnageant, puis ajoutez environ 100 à 200 microlitres de la solution DNase I, une solution par trachée, sur le culot et resuspendez.

Suspendre en tapotant doucement. Incuber les cellules sur de la glace pendant cinq minutes. Centrifuger le tube à 1 400 tours par minute pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et éliminer le surnageant.

Ensuite, pipeter huit millilitres de milieu MTEC contenant 10 % de FBS sur le culot et resuspendre la plaque. Incuber la suspension cellulaire sur une plaque paria à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de 95 % d'air et de 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq à six heures. Cette étape constitue une sélection négative destinée à l'élimination des fibroblastes.

Après l'incubation, recueillir la suspension cellulaire à partir de la plaque paria et prélever à la pipette pour la transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Rincer ensuite la plaque deux fois avec quatre millilitres de milieu MTEC contenant 10 % de FBS. Transférer les deux lavages dans le tube conique de 50 millilitres contenant la suspension cellulaire.

Prélèvez un millilitre de la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette et transférez-le dans un tube Eppendorf. Conservez cet aliquot pour l’analyse par cytocentrifugation et le comptage cellulaire. Centrifugez le tube conique de 50 millilitres contenant les 15 millilitres restants de suspension cellulaire à 1 400 tours par minute à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Pendant la centrifugation, retirez et jetez la solution de collagène du plateau transwell préparé précédemment. Laissez sécher le plateau sous la hotte pendant cinq minutes, puis rincez deux fois avec du PBS après le dernier lavage. Aspirez tout le PBS et ajoutez 1,5 millilitre de milieu de prolifération dans le compartiment basal du transwell après la centrifugation.

Jetez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans un volume approprié de milieu de prolifération afin de faciliter l'ensemencement de 7,5 × 10⁴ à 1 × 10⁵ cellules en 500 microlitres de suspension par puits. Prélevez 500 microlitres de suspension cellulaire et déposez-les sur la surface apicale de la membrane de polycarbonate de l'insert Transwell. Incubez les cultures MTEC immergées à 37 °C dans une étuve humidifiée contenant 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone, pendant sept à dix jours, avec un changement de milieu tous les deux jours.

Mesurez la résistance transépithéliale à l'aide d'un intervalomètre. Lorsque la résistance épithéliale atteint 1000 ohms par centimètre carré et que les cultures apparaissent confluentes, passez à une culture LI en éliminant le milieu apical.

Remplacez également le milieu basal par le milieu basique MTEC contenant 2 % de nouveau sérum et de l'acide rétinoïque. Incubez les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 14 jours afin de permettre la différenciation, en renouvelant le milieu tous les deux jours. Commencez par installer la machine à fumer conformément aux instructions du fabricant.

Enregistrez le poids d'un filtre à membrane neuf. Placez ensuite le filtre dans le support en acier inoxydable en ligne sur le tube d'échantillonnage reliant le port d'échantillonnage de la chambre de combustion à la pompe à débit constant. Connectez l'unité d'échantillonnage au débitmètre gazeux à l'aide d'un tube de sortie dans un système d'exposition par cellule CS.

Exposer la face apicale des cultures transwell à la fumée de cigarette classique provenant de trois cigarettes de référence filtrées R4F à des fins de recherche. Exposer les cellules à la fumée d'une à deux cigarettes. Exposer les cultures témoins à l'air ambiant pendant une durée d'exposition équivalente après l'échantillonnage gazeux et la prise de poids.

Le filtre à air souple est normalisé en fonction de la masse totale de matériau déposé sur le filtre, exprimée en milligrammes. Pour le volume total d'air échantillonné, la fumée provenant d'une à deux cigarettes donne typiquement entre 100 et 200 milligrammes par mètre cube de MPD (matière particulée totale). Après l'exposition à la cigarette, récolter les cellules et le milieu basal pour des analyses ultérieures.

Il s'agit d'un exemple de monocouche saine de cellules épithéliales respiratoires de souris marquées pour les marqueurs nucléaires des cellules épithéliales et les marqueurs C. L'isolement, la prolifération et la différenciation épithéliaux réussis reposent sur une monocouche intacte présentant une morphologie en pavés. Les cultures sont essentiellement dépourvues de fibroblastes.

Ces images de microscopie électronique sont représentatives de cultures saines de MTEC et montrent l'ultrastructure des différents types cellulaires et la morphologie des CILS. Cette vidéo d'imagerie de cellules vivantes montre la morphologie ciliaire saine des cultures de MTEC. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les cellules épithéliales trachéales de souris, de les différencier à une interface air-liquide et de les exposer à la fumée principale de cigarette.