Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

L'objectif général de cette procédure est d'identifier le modèle physique correct décrivant la liaison d'une macromolécule à son ligand et de déterminer les paramètres thermodynamiques associés. Cela est réalisé en préparant d'abord une solution mère de la macromolécule par dialyse prolongée. Le ligand d'intérêt est ensuite dissous dans le tampon de dialyse final, et les concentrations de tous les composants sont déterminées lors d'une deuxième étape.

Les échantillons de macromolécules et de ligands sont soigneusement dilués à une série de concentrations différentes. Ensuite, une série d'expériences de calorimétrie de titrage isotherme, ou ITC, est réalisée à plusieurs concentrations du ligand et de la protéine afin de produire une série d'isothermes ITC à l'étape finale de la procédure. Une analyse globale de la série d'expériences est effectuée à l'aide de différents modèles physiques, et le modèle offrant la meilleure concordance globale est identifié comme étant le modèle correct.

Aujourd'hui, je vais vous présenter une méthode permettant de répondre à des questions biophysiques telles que la manière dont les molécules protéiques se lient à leurs ligands, et fournissant des mesures précises de paramètres d'interaction tels que l'entropie, l'enthalpie et les constantes d'association. Avant le début de ce protocole, purifiez la protéine d'intérêt. La macromolécule utilisée dans cette démonstration est un immuno GLYCOSIDE N six prime, une subtyle transférase un I ou une C six prime un I. Pour commencer, préparez quatre litres de tampon de dialyse et refroidissez à quatre degrés Celsius. Ensuite, dialysez un petit volume d'une solution de macromolécule.

Dans ce cas, cinq millilitres de AAC C six prime à 400 micromolaire, un œil dans 1,3 litre de tampon de dialyse à quatre degrés Celsius. Cette étape peut être réalisée dans une chambre froide ou un réfrigérateur, en renouvelant le tampon frais toutes les huit heures, et en effectuant un total de trois dialyses. Conserver la solution finale de dialyse.

Filtrer 750 millilitres de la solution finale de dialyse à l’aide d’un filtre en cellulose de 0,45 micron et conserver à quatre degrés Celsius. Ce tampon, désormais appelé tampon de lavage, sera utilisé pour les rinçages et comme diluant. Pour les échantillons, rincer soigneusement un filtre à seringue de 0,2 micron avec le tampon de lavage.

Appliquez l'échantillon protéique et filtrez-le. Récupérez délicatement l'échantillon dans un tube conique avant de stocker la solution protéique, puis déterminez la concentration en protéines à l'aide d'un dosage protéique standard. Dans ce cas, la concentration en protéines est mesurée par absorbance à 280 nanomètres et la concentration enzymatique est calculée.

À l'aide d'un coefficient d'extinction généré à partir du serveur protéomique EXI, conserver la protéine de manière à maximiser sa stabilité à long terme. AAC C six prime one eye doit être conservé à quatre degrés Celsius, car il ne conserve pas son activité après congélation et décongélation. Ensuite, dissoudre le ligand et le tampon de migration. Pour cette démonstration, quatre milligrammes d'acétyl-coenzyme A ont été dissous dans 200 microlitres de tampon de migration afin d'obtenir une solution mère à 25 millimolaire.

Ce ligand peut être conservé à moins 78 degrés Celsius jusqu'à son utilisation pour la préparation des échantillons d'ITC. Tout d'abord, calculez la concentration de l'enzyme afin d'obtenir une valeur C de 64, comme décrit dans le protocole écrit pour AAC six prime un I. Ceci correspond à une concentration de 192 micromolaire. Préparez une solution de deux millilitres de la macromolécule à cette concentration, en diluant la solution mère avec le tampon de fonctionnement filtré FIA. Faites décongeler la solution d'acétyl-coenzyme A dans un bain d'eau glacée. Une fois la solution d'acétyl-coenzyme A décongelée, mélangez délicatement, puis calculez la concentration de la solution de ligand en multipliant la concentration de la macromolécule par le nombre de sites de fixation multiplié par 10.

Préparez la solution d'acétyl coenzyme A en ajoutant 80 microlitres de la solution mère d'acétyl coenzyme A à 25 millimolaire à 420 microlitres de tampon de migration et en mélangeant. Transférez la solution d'acétyl coenzyme A diluée dans un tube de remplissage de pipette et remettez le reste de la solution mère à 25 millimolaire à une température de moins 78 degrés Celsius pour stockage. Dégazez les solutions d'a C six prime one eye et d'acétyl coenzyme A sous vide pendant cinq minutes à 19 degrés Celsius, soit un degré Celsius en dessous de la température de fonctionnement expérimentale souhaitée.

Pour installer la seringue d'injection, insérez la seringue dans un support de seringue jusqu'à ce que la pince de seringue préinstallée soit à la même hauteur que le support. Passez la deuxième pince de seringue par-dessus la seringue d'injection jusqu'à ce qu'elle soit fermement appuyée contre le bas du support de seringue. Serrez délicatement la pince à l'aide du tournevis hexagonal de 0,05 pouce fourni.

Ensuite, insérez le support de seringue dans le support de pipette. Faites glisser délicatement l'injecteur de pipette dans la seringue d'injection et assurez-vous que l'extrémité du piston pénètre directement dans l'orifice de la seringue. Une fois l'insertion complète, vissez le collier de verrouillage du support de seringue dans l'injecteur de pipette.

Avant de charger la solution de l'échantillon protéique A a C six prime un œil, utilisez le système de lavage fourni avec l'instrument pour rincer la cuve d'échantillon avec au moins 50 millilitres de tampon de migration. Éliminez le tampon résiduel de la cuve d'échantillon par aspiration à l’aide d’une seringue en verre de 2,5 millilitres munie d'une aiguille longue. Retirez les solutions du vide de dégazage à l’aide d'une deuxième aiguille longue propre et sèche.

Seringue de 2,5 millilitre. Aspirez soigneusement au moins 1,8 millilitre de l'échantillon protéique A a C six prime one œil dans la seringue. Prenez soin d'éviter les bulles d'air.

Une fois la seringue chargée avec l'échantillon de protéine, insérez l'aiguille dans la cellule d'échantillon et touchez délicatement le fond de la cellule. Relevez l'aiguille d'environ un millimètre et injectez doucement l'échantillon dans la cellule jusqu'à ce qu'un excès de liquide soit visible au-dessus du haut de la cellule d'échantillon. Pour chasser les bulles d'air éventuellement piégées, relevez l'aiguille d'environ un centimètre tout en veillant à ce qu'une solution reste dans le débordement, puis retirez et injectez rapidement environ 0,25 millilitre de la solution.

Faites maintenant glisser délicatement l'aiguille vers le haut le long du côté du trop-plein. Dans le puits d'échantillon, l'aiguille heurtera une saillie. Retirez tout le liquide situé au-dessus de cette saillie, car celle-ci indique la hauteur souhaitée pour la solution de migration.

Pour charger la seringue d'injection, fixez la seringue en plastique de gonflage sur le port de remplissage et abaissez l'extrémité du piston jusqu'au sommet du port de remplissage. Placez ensuite le tube de remplissage de la pipette contenant la solution du ligand DGA au fond du support de pipette. Vérifiez que l'extrémité de la seringue ne touche pas le fond du tube de remplissage et aspirez lentement la solution dans la seringue jusqu'à ce qu'une petite quantité pénètre dans le tube de la seringue de chargement.

Ensuite, fermez le port de remplissage en abaissant la pointe du piston. Pour ce faire, cliquez sur le bouton de fermeture du port de remplissage. Puis, éliminez toute bulle d'air qui aurait pu être piégée pendant le chargement.

Purgez et remplissez en cliquant sur le bouton de purge et remplissage. Effectuez ce processus de purge et remplissage un total de trois fois. Une fois le processus de purge et remplissage terminé, retirez le tube de remplissage du support de pipette et essuyez délicatement la pointe de la seringue avec du papier absorbant de laboratoire.

Abaissez maintenant la seringue de l'ensemble de pipette dans l'échantillon. Faites preuve de prudence et avancez lentement, car l'aiguille peut facilement se plier. Assurez-vous que la seringue est complètement insérée en appuyant vers le bas sur la base du collier de verrouillage.

Une fois la seringue fixée, réglez la température de fonctionnement souhaitée et sélectionnez une puissance de référence légèrement supérieure au flux de chaleur maximal attendu lors des injections. Dans cet exemple, 20 degrés Celsius et 20 microcalories par seconde sont utilisés respectivement comme température de fonctionnement et puissance de référence. Programmez ensuite les volumes d'injection et les délais souhaités.

Ici, 28 injections sont utilisées, la première ayant un volume de deux microlitres et un délai de 62 secondes, et les injections suivantes ayant un volume de 10 microlitres avec des délais de 332 secondes. L'expérience décrite ici fournit la base nécessaire pour générer un jeu de données à une concentration unique afin d'obtenir les courbes supplémentaires requises. Répétez ce processus en diminuant les concentrations du macromolécule et du ligand.

Veillez à ce que tous les échantillons de macromolécules et de ligands proviennent de la même solution mère afin de minimiser les erreurs de concentration. On observe ici le tracé brut de calorimétrie de titrage isotherme obtenu lors du titrage de 3,86 millimolaire de ligand, l'acétyl-coenzyme A, dans 192 micromolaire de la micromolécule. A A C six prime un.

Les valeurs intégrées de l’œil ont été utilisées pour déterminer les paramètres de liaison à l’aide d’un ajustement séquentiel à deux sites. Ce graphique représente les isothermes générés par calorimétrie de titrage isotherme (ITC) de concentrations variables de coenzyme A de l’ACE et de l’AAC C six Prime One Eye. Les données expérimentales, représentées par des cercles vides, ont été ajustées à la fois à un modèle indépendant à deux ensembles de sites et à un modèle séquentiel à deux sites.

Un meilleur accord est observé avec le modèle séquentiel à deux sites. Les concentrations en protéines utilisées sont définies dans le texte accompagnant. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'être très précis dans votre dilution, car la variation des concentrations peut avoir un impact considérable sur vos résultats.