Name: Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Découvrez la calorimétrie de titration isotherme pour identifier les mécanismes de liaison ligand-macromolécule et extraire les paramètres thermodynamiques. Cette méthode permet d'analyser des isothermes ITC à diverses concentrations.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), en sciences naturelles et en génie (CRSNG), et une bourse d&#39;études de formation des IRSC (pour LF). Nous remercions le professeur Gérard D. Wright (Université McMaster, Canada) pour l&#39;AAC (6)-Ii plasmide d&#39;expression.

1. Préparation des solutions mères <ol><li> Purifier la macromolécule d'intérêt. (Dans ce cas, aminoglycoside N-acétyl-6'-II (AAC6'-II), est isolé comme rapporté ailleurs. 13) </li><li> Préparer 4 litres de tampon de dialyse. (Dans ce cas nous avons utilisé 25 mm 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES, MW 238,3 g / mol), contenant 2 mM d'acide éthylène diamine (EDTA, MW 292.2), à pH 7,5.) </li><li> Dialyser la protéine L'AAC (6 ')-II de l'échantillon (5 ml à 400 uM) utilisés doivent être dialysées dans un tampon de dialyse (3 x 1,3 L). La solution de dialyse final est conservé pour rincer la machine et de diluer les échantillons. </li><li> Filtrer la solution de dialyse final à travers un filtre de 0,45 um de cellulose, et conservés à 4 ° C. Sera dénommé «tampon courant" </li><li> Solution de protéines Filtrer à travers un filtre de 0,2 um seringue qui a été rincé avec un tampon d'exécution. Mesurer la concentration finale de la protéine en utilisant un dosage standard (Bradford, Lowry, etc) ou absorbance UV. Magasin de la protéine afin de maximiser la stabilité à long terme. (Dans le cas de l'AAC (6 ')-II, ce moyen de stockage à 4 ° C. AAC (6')-II ne conservent leur activité après congélation et décongélation). </li><li> Préparer 200 pl de 25 mM de solution stock acétyl-coenzyme A (AcCoA, le ligand, MW 809.57) en dissolvant 4,0 mg dans la gestion de la mémoire tampon. Gel à -78 ° C jusqu'au moment de servir. </li><li> Toutes les protéines et les échantillons de ligand doivent provenir du même stock de solutions, afin de minimiser échantillon aléatoire de l'échantillon à des fluctuations dans la concentration. Un seul facteur de correction pour la concentration de protéines dans l'ensemble de variables-c données est ajusté dans l'analyse. 10 </li></ol> 2. Préparation des échantillons CCI <ol><li> Diluer la solution enzymatique à un c-valeur de 64 avec un volume final de 2 ml. (Dans le cas de l'AAC (6 ')-II, ce qui correspond à 192 pM.) </li><li> Vite dégeler la solution stock ligand (AcCoA) dans l'eau glacée. </li><li> Préparer 0,5 mL d'une solution AcCoA 10 fois plus concentré, puis le nombre de sites de liaison sur la protéine, dans ce cas, 4 mM, en diluant 80 pl de la solution stock dans 420 uL AcCoA de courir tampon. Transférer dans un tube de la pipette de remplissage. Revenir rapidement la solution stock AcCoA à -78 ° C. </li><li> Degas la protéine et des solutions sous vide pendant 5 min à une température de 1 ° C en dessous de la température désirée de fonctionnement (19 ° C). </li></ol> 3. Mise en place de la seringue 14 <ol><li> Insérer la seringue d'injection à travers porte-seringue jusqu'à ce que l'attache de la seringue pré-monté est à la même hauteur que le titulaire. </li><li> Feed the bride deuxième seringue au cours de la seringue jusqu'à ce qu'il soit fermement pressé contre le fond du porte-seringue. Serrer doucement la pince fournie avec les 0.050 "entraînement hexagonal à bille. </li><li> Porte-seringue place dans le porte-pipette. </li><li> Faites glisser doucement l'injecteur pipette dans la seringue. Assurez-vous que la pointe de piston est alimenté directement dans le trou de la seringue. Une fois entièrement inséré, visser la bague de blocage du titulaire dans l'injecteur pipette. </li></ol> 4. Chargement de la cellule 14 de l'échantillon <ol><li> Laver l'échantillon de cellules avec un minimum de 50 ml de tampon de course, et enlever toute trace de liquide en utilisant un long aiguilleté 2,5 ml seringue en verre. </li><li> Lentement dessiner un minimum de 1,8 ml de solution échantillon de protéine dans le propre et sec à long aiguilleté 2,5 ml seringue. Attention à ne pas introduire de bulles. </li><li> Insérez soigneusement l'aiguille dans la cellule de l'échantillon et doucement toucher le fond de la cellule. Soulever la pointe légèrement (~ 1 mm) et d'injecter délicatement AAC (6 ')-II de solution dans la cellule jusqu'à ce que l'excès de liquide est visible au-dessus du haut de la cellule de l'échantillon. </li><li> Soulevez lentement l'aiguille d'environ 1 cm tout en assurant reste liquide dans le débordement. Retirer rapidement et injecter une petite quantité de solution (~ 0,25 ml) pour éliminer les bulles emprisonnées dans la cellule d'échantillon. </li><li> Retirez tous les débordement de solution. Ce résultat est obtenu en faisant délicatement l'aiguille le long côté de déborder dans la cellule d'échantillon. Le bout de la seringue va frapper une corniche, c'est la hauteur désir de la solution fonctionne. Retirer tout le liquide qui se trouve au-dessus de cette ligne. </li></ol> 5. Chargement seringue d'injection et d'initier course de 14 <ol><li> Fixer la seringue tube en plastique de chargement dans le port de remplissage. </li><li> Pointe de la Basse piston pour le haut de l'orifice de remplissage. </li><li> Placer la solution dans le tube AcCoA pipette de remplissage à bas de la porte-pipette. Le bout de la seringue ne doit pas toucher le fond du tube de remplissage. </li><li> Aspirer lentement la solution dans la seringue jusqu'à ce qu'une petite quantité pénètre dans le tube de la seringue de chargement. </li><li> Fermer l'orifice de remplissage en abaissant le piston et cliquez sur le bouton Fermer l'orifice de remplissage. Purge et recharge, en cliquant sur la Purge-&gt; bouton Recharge, trois fois pour éliminer les bulles d'air qui peuvent avoir été piégés pendant le chargement. </li><li> Retirez le tube de remplissage du porte-pipette et essuyez délicatement l'embout de la seringue. </li><li> Prenez la pipette et l'assemblage de seringues abaisser doucement dans la cellule de l'échantillon. Procéder lentement que la seringue peut facilement plier, donc le plus grand soin est nécessaire. Assurer la seringue est complètement inséré en appuyant sur la base du blocage col. </li><li> Régler la température désirée de fonctionnement (dans ce cas 20 ° C), et sélectionnez une puissance de référence qui est légèrement supérieur au flux de chaleur d'injection maximale prévue (dans ce cas, 20μcal/sec). </li><li> Programme des volumes d'injection désiré et les retards. (Dans ce cas, 28 injections ont été employées. La première injection a un volume de 2 pl avec un retard de 60 s. Toutes les injections suivantes ont des volumes de 10 ul avec des retards 330 s). </li></ol> 6. Des exécutions ultérieures <ol><li> Dans tous les exécutions ultérieures répétez les étapes 2-5, tout en diminuant les AAC (6 ')-II et les concentrations AcCoA par un facteur de 2,4,8,16 et 32. </li></ol> 7. Analyse des données <ol><li> Utilisez une procédure d'ajustement qui correspond globalement l'ensemble des isothermes d'un ensemble unique de paramètres de liaison, comme décrit précédemment 10. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Des données représentatives sont présentées dans la figure 1. Les formes des isothermes devrait varier avec la concentration. Sharper transitions sont attendus pour plus c-valeurs (ie protéines élevé et les concentrations de ligand) (figure 2). Dans le cas de l'AAC (6 ')-II, le modèle à deux sites séquentielle donne un meilleur choix que celui décrivant deux ensembles de produits identiques, avec des sites indépendants stoechiométries réglable. <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Isothermes Figure 1. Produite par un titrage des AcCoA (3,86 mM) en AAC (6 ')-II (192 pM). A) trace premières CCI. B) des valeurs intégrées utilisées pour déterminer des paramètres obligatoires (places) avec un ajustement 2 place séquentielle (-). <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Isothermes CCI pour AcCoA titré en AAC (6 ')-II à des concentrations variables. Les données expérimentales (cercles ouverts) ont été adaptés à un modèle 2-ensembles-de-sites indépendants (magenta pointillés) et un modèle 2-place séquentielle (solide bleu). Le modèle 2-site sequentional donne clairement un accord globalement meilleure. Les concentrations utilisées étaient de type A) 6 uM, 0,25 mm, B) 12 uM, 0,25 mm, C) 24 uM, 0,5 mM, D) 48 uM, 1,0 mM, E) 96 uM, 1,9 mM, et F) 196 uM, 3,86 mM, pour AAC (6 ')-II et AcCoA respectivement.

<ol><li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li>
<li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2004%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Okhrimenko, O. ksana, J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li>
<li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li>
<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li>
<li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li>
<li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase%3A+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li>
<li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC%286%27%29-Ii+from+Enterococcus+faecium%3A+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li>
<li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li>
<li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ITC+Data+Analysis+in+Origin%22">ITC Data Analysis in Origin</a>. , 7 edn, MicroCal. (2004).</li>
</ol>

Cette partie analytique de variable c montage a été précédemment décrit en détail 10. Nous rapportons ici les aspects pratiques de la collecte variable c ensembles de données adapté à cette approche. Il est essentiel que toutes les protéines et les échantillons de ligand sont tirées des solutions même stock. Il est donc important que la solution stock suffisant est préparé initialement pour compléter la série entière d&#39;expériences. Cela garantit le ratio de l&#39;AAC (6 &#39;)-II et AcCoA est constante en...

<table><tbody><tr><td>Acétyl c&amp;#8211;nzyme A (AcCoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td></td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Tubulure de dialyse Spectra/Por 2</td><td>Spectrum Labs</td><td>132678</td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile pour seringue (0,2 &amp;mu;m)</td><td>VWR international</td><td>281445-477</td><td></td></tr><tr><td>Filtres membranaires en nitrate de cellulose (0,45 &amp;mu;m)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>7184-004</td><td></td></tr><tr><td>VP-ITC</td><td>MicroCal</td><td>VP-ITC</td><td>Microcalorimètre utilisé pour les mesures</td></tr><tr><td>ThermoVac</td><td>MicroCal</td><td>USB Thermo Vac</td><td>Station de dégazage contrôlée en température</td></tr></tbody></table>

collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est couramment utilisé pour déterminer les paramètres thermodynamiques associés à la liaison d&#39;un ligand à une macromolécule hôte. ITC a certains avantages sur des approches communes pour étudier par spectroscopie d&#39;hôte / ligand interactions. Par exemple, la chaleur dégagée ou absorbée lorsque les deux composants interagissent est directement mesurée et ne nécessite aucune journalistes exogènes. Ainsi, l&#39;enthalpie de liaison et la constante d&#39;association (Ka) sont obtenues directement à partir de données CCI, et peut être utilisé pour calculer la contribution entropique. Par ailleurs, la forme de l&#39;isotherme est dépendante de la Valeur-C et le modèle mécaniste impliqués. La Valeur-C est défini comme c = n [P] TKA, où [P] l est la concentration en protéines, et n est le nombre de sites de liaison au ligand au sein de l&#39;hôte. Dans de nombreux cas, plusieurs sites de liaison pour un ligand donné ne sont pas équivalents et l&#39;ITC permet la caractérisation des paramètres thermodynamiques de liaison pour chaque site individuel contraignant. Cela exige cependant que le modèle correct contraignante être utilisé. Ce choix peut être problématique si les différents modèles peuvent tenir les mêmes données expérimentales. Nous avons précédemment montré que ce problème peut être contourné en réalisant des expériences dans plusieurs C-valeurs. Les isothermes de multiples obtenues à différentes valeurs de c-sont aptes simultanément à des modèles séparés. Le modèle correct est ensuite identifié sur la base des qualité de l&#39;ajustement sur l&#39;ensemble de variables-c données. Ce processus est appliqué ici à l&#39;aminoglycoside résistance provoquant aminoglycoside enzyme N-acétyl-6&#39;-II (AAC (6 &#39;)-II). Bien que notre méthodologie est applicable à tout système, la nécessité de cette stratégie est mieux démontrée avec un système ligand-macromolécule montrant allostérie ou coopérativité, et quand différents modèles de fixation s&#39;adapte fournissent essentiellement identiques aux mêmes données. À notre connaissance, il n&#39;existe pas de tels systèmes disponibles dans le commerce. AAC (6 &#39;)-II, est un homo-dimère contenant deux sites actifs, en montrant la coopérativité entre les deux sous-unités. Toutefois, les données obtenues à l&#39;ITC d&#39;un seul c-valeur peut être adapté aussi bien à au moins deux modèles différents d&#39;un modèle à deux ensembles de sites indépendants et une à deux sites séquentielle (coopérative) modèle. Grâce à varier le C-valeur comme expliqué ci-dessus, il a été établi que le modèle correct contraignante pour AAC (6 &#39;)-II est un site de deux modèle séquentiel contraignant. Nous décrivons ici les étapes qui doivent être prises lors de la réalisation d&#39;expériences CCI en vue d&#39;obtenir des ensembles de données adapté à la variable c-analyses.

ITC est un outil puissant pour étudier la liaison d&#39;un ligand à son hôte. Dans les systèmes complexes cependant, plusieurs modèles peuvent ajuster les données aussi bien. La méthode décrite ici fournit un moyen d&#39;élucider le modèle approprié contraignante pour les systèmes complexes et d&#39;extraire les paramètres thermodynamiques correspondants.

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

La calorimétrie d'isotherme de titration (ITC) est couramment utilisée pour déterminer les paramètres thermodynamiques associés à la liaison d'un ligand à un hôte...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier le modèle physique correct décrivant la liaison d'une macromolécule à son ligand et de déterminer les paramètres thermodynamiques associés. Cela est réalisé en préparant d'abord une solution mère de la macromolécule par dialyse prolongée. Le ligand d'intérêt est ensuite dissous dans le tampon de dialyse final, et les concentrations de tous les composants sont déterminées lors d'une deuxième étape.Les échantillons de macromolécules et de ligands sont soigneusement dilués à une série de concentrations différentes. Ensuite, une série d'expériences de calorimétrie de titrage isotherme, ou ITC, est réalisée à plusieurs concentrations du ligand et de la protéine afin de produire une série d'isothermes ITC à l'étape finale de la procédure. Une analyse globale de la série d'expériences est effectuée à l'aide de différents modèles physiques, et le modèle offrant la meilleure concordance globale est identifié comme étant le modèle correct.Aujourd'hui, je vais vous présenter une méthode permettant de répondre à des questions biophysiques telles que la manière dont les molécules protéiques se lient à leurs ligands, et fournissant des mesur

collecting-variable-concentration-isothermal-titration-calorimetry

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Un protocole général pour l'utilisation de la calorimétrie de titration isotherme pour surveiller la thermodynamique contraignante pour les systèmes biologiques avec les modérés affinités de liaison est présenté.

Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand d&#39;affinité

Cette vidéo présente la calorimétrie différentielle à balayage, une technique permettant d’étudier l’interaction entre une biomolécule et un ligand. La liaison d’un aptamère d’ADN et d’un ligand thermolabile est étudiée en appliquant des cycles répétés de chauffage et de refroidissement à l’échantillon et en obtenant des balayages pour l’analyse thermodynamique.

Calorimétrie différentielle à balayage pour étudier l’interaction aptamère-ligand thermolabile de l’ADN

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l'affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d'exécution, et l'analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l'urée par l'uréase jack bean.

Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

La thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) est une technologie sensible pour caractériser les interactions aptamère-cible. Ce manuscrit décrit un protocole MST pour caractériser les interactions aptamère-petites molécules.

La cartographie du site de liaison d&#39;un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

Un protocole détaillé pour effectuer un titrage ELISA est décrite. En outre, un nouvel algorithme est présenté afin d’évaluer le titrage des tests ELISA et d’obtenir une constante de dissociation de liaison d’un ligand soluble à un récepteur immobilisée plaque de microtitration.

Titrage ELISA comme une méthode pour déterminer la constante de Dissociation de l’Interaction Ligand du récepteur

La thermophorèse à micro-échelle permet d’obtenir rapidement des constantes de liaison à faible coût matériel. La thermophorèse micro-échelle étiquetée ou sans étiquette est disponible dans le commerce; cependant, la thermophorèse sans étiquette n’est pas capable de la diversité des mesures d’interaction qui peuvent être effectuées à l’aide d’étiquettes fluorescentes. Nous fournissons un protocole pour les mesures de thermophorèse marquées.

Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide

Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique et de la calorimétrie de titrage isotherme pour sonder et quantifier la thermodynamique de la liaison du Cu(II) aux peptides et aux protéines.

Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

Le présent protocole décrit l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour analyser l’association et la cinétique de dissociation de la liaison entre un aptamère d’ADN et la tétracycline, y compris la préparation des échantillons, les étalons et les échantillons, et l’interprétation des données résultantes.

Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode alternative de détection et de titrage de virus en utilisant une technique de détection d'antigènes enzymatique connu sous le nom d'un dosage immuno. Ici, nous allons vous montrer comment collecter vos échantillons viraux, préparer les cellules pour les tests, et enfin le dosage immuno utilisant des dilutions en série pour déterminer le titre viral.

Le titrage de coronavirus humains en utilisant un dosage immunoperoxydase

Découvrez la calorimétrie de titration isotherme pour identifier les mécanismes de liaison ligand-macromolécule et extraire les paramètres thermodynamiques. Cette méthode permet d'analyser des isothermes ITC à diverses concentrations.

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison (Vidéo) | JoVE Journal

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

Explorer plus de vidéos