En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

Cette procédure utilise la puce Viro, un test de microréseau panviral pour analyser les échantillons cliniques à la recherche de virus connus et inconnus. Les premiers acides nucléiques sont extraits d’échantillons cliniques. Ensuite, l’ARN extrait est transcrit à l’aide d’amorces aléatoires.

Une synthèse de CD NA sur second brin est réalisée et la banque de CD NA est amplifiée par PCR aléatoire. Ensuite, le cd NA amplifié est marqué avec des colorants fluorescents et hybridé à une puce virale. La dernière étape consiste à scanner et à analyser la puce à ADN.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la présence ou l’absence d’un virus ou de plusieurs virus grâce à l’analyse de la puce microarray. Des méthodes de détection à large spectre telles qu’une puce virale sont nécessaires en microbiologie diagnostique car les syndromes cliniques courants, tels que la pneumonie, ne sont spécifiques à aucun agent pathogène individuel, et en raison de la menace émergente continue de nouveaux agents pathogènes viraux tels que le coronavirus du SRAS et le nouveau virus de la grippe H one N one de 2009, Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie diagnostique, par exemple, le pourcentage d’infections non diagnostiquées en milieu clinique pouvant être causées par de nouveaux virus non encore identifiés. Les implications de cette technique s’étendent à un meilleur diagnostic des maladies cliniques aiguës à l’hôpital, car nous testons simultanément des centaines, voire des milliers d’agents pathogènes potentiels.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois en 2002 lorsque nous avons décidé d’appliquer la technologie nouvellement développée des microréseaux mise au point dans le laboratoire du Dr Joseph DeRisi à l’UCSF à la détection des virus. Notre premier cas test dans le monde réel a été d’utiliser la puce virale pour identifier un nouveau coronavirus responsable du SRAS en 2003, démontrant la procédure du début à la fin sera par un technicien de mon laboratoire qui démontrera l’utilisation du test de la puce virale sur un échantillon d’écouvillon nasal d’un enfant pour diagnostiquer la cause de sa maladie respiratoire aiguë. Les échantillons d’écouvillonnage nasopharyngé sont prélevés dans des récipients stériles contenant du transport viral, des milieux liquides, et stockés congelés dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Dans une cagoule de biosécurité, laissez le tube contenant l’échantillon décongeler et remuez brièvement l’écouvillon dans le milieu avant de jeter l’écouvillon dans un bac de taille pour matières biologiques. Ensuite, aliquote 200 microlitres de l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre. Passez l’échantillon à travers un filtre à spin de 0,22 micron pour le purifier des particules virales et dans un tube frais de 1,5 millilitre.

Ensuite, utilisez le kit Turbo DNA d’Ambien selon les instructions du fabricant pour dégrader l’ADN génomique de l’hôte et le purifier en acide nucléique viral encapsulé protégé. Poursuivez avec l’extraction de l’ARN, à l’aide du kit d’extraction d’ARN viral XMO ZR ou du kit de virus de l’échographie Qiagen selon les instructions du fabricant. Mesurez la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre d’acide nucléique NanoDrop.

La concentration en ARN est de préférence d’au moins 10 nanogrammes par microlitre, mais variera d’un échantillon à l’autre à l’aide d’un tube à paroi mince de 200 microlitres. Ajoutez un microlitre d’amorce A à une concentration de 40 moles PICA par microlitre à quatre microlitres d’ARN extrait. Chauffez l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un thermocycleur, puis laissez le tube refroidir à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’un mélange principal contenant deux microlitres cinq fois RT tampon, un microlitre 12,5 millimolaires, DNTP un microlitre d’eau, 0,5 microlitres, 0,1 molaire DTT et 0,5 microlitres d’exposant trois, transcriptase inverse dans un thermocycleur. Incuber le tube à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, chauffez l’échantillon à 94 degrés Celsius pendant deux minutes.

Pour interrompre la réaction de transcriptase inverse, appelez à 10 degrés Celsius pendant deux minutes et pulsez la centrifugeuse pendant cinq secondes. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de mélange de quease composé d’un microlitre de tampon cinq fois quease, de 3,8 microlitres d’eau et de 0,15 microlitre de synthèse du deuxième brin. Faites passer le thermocycleur de 10 degrés Celsius à 37 degrés Celsius en huit minutes.

Maintenez à 37 degrés Celsius pendant huit minutes. Ensuite, chauffez à 94 degrés Celsius pendant deux minutes pour désactiver la maladie et appelez à 10 degrés Celsius à ce stade. Si vous le souhaitez, conservez l’échantillon contenant 15 microlitres d’ADNC à moins 20 degrés Celsius.

Tout d’abord, ajoutez cinq microlitres d’échantillon CD NA à 45 microlitres d’un mélange maître composé de cinq microlitres 10 fois tampon PCR, un microlitre 12,5 millimolaires, DNTP un microlitre 100 pomo par microlitre d’amorce, B un microlitre cleantech LA et 37 microlitres d’eau. Exécutez ensuite le protocole PCR comme suit, 94 degrés Celsius pendant deux minutes, suivi de 25 cycles de 94 degrés Celsius pendant 30 secondes. 50 degrés Celsius pendant 45 secondes et 72 degrés Celsius pendant une minute.

Puis un pas à genoux à 72 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivi d’une prise à 10 degrés Celsius après PCR. Vérifiez le produit PCR et un gel d’électrophorèse AOSE à 1,5 %. Un frottis d’environ 200 à 1000 paires de bases doit être visualisé.

Pour incorporer AAD DNTP, ajoutez cinq microlitres de produit PCR viral à 45 microlitres d’un mélange maître composé de cinq microlitres 10 fois tampon PCR, un microlitre 12,5 millimolaires, A-A-D-N-T-P un microlitre 100 p d’amorce de plusieurs microlitres, B un microlitre ClinTech LA et 37 microlitres d’eau. Exécutez le protocole PCR comme suit, 94 degrés Celsius pendant deux minutes, 15 cycles de 94 degrés Celsius pendant 30 secondes. 50 degrés Celsius pendant 45 secondes.

72 degrés Celsius pendant une minute et un pas à genoux de 72 degrés Celsius pendant cinq minutes et maintenez à 10 degrés Celsius. Nettoyez ensuite le nouveau produit PCR avec le kit DNA clean and concentrator three selon les instructions du fabricant et ajoutez 10 microlitres de tampon d’élution. Ajoutez un microlitre d’une molaire de bicarbonate et un microlitre si trois aux 10 microlitres de produit PCR et incubez pendant une heure dans l’obscurité.

Ensuite, encore une fois, nettoyez l’échantillon marqué S avec un kit de nettoyage d’ADN et de concentrateur cinq et éluez dans 12 microlitres de tampon d’élution. Utilisez 1,5 microlitre d’échantillon pour vérifier la concentration de CDNA et la quantité de colorant incorporée sur un spectrophotomètre NanoDrop dans un tube de bandelette PCR à un microlitre 25 fois le tampon de fragmentation, cinq microlitres cinq fois le tampon de blocage 9,5 microlitres ou la quantité nécessaire pour une concentration finale normalisée de 10 pics ou moles par microlitre de SI trois échantillons marqués et de l’eau jusqu’à un volume total de 25 microlitres. Ajoutez ensuite 25 microlitres de tampon d’hybridation deux fois GX, et tournez brièvement vers le bas pour éliminer les bulles.

Placez une nouvelle glissière de joint dans la chambre d’hybridation. Chargez 40 microlitres de l’échantillon sur la glissière du joint. Ensuite, placez le réseau viral imprimé Agilent avec le côté marqué Agilent vers le bas sur le dessus de la glissière du joint et serrez fermement la vis.

Placez la chambre d’hybridation dans un four à 65 degrés Celsius et hybridez pendant la nuit en utilisant une rotation lente de 10 rotations par minute pour laver les réseaux. Préchauffez d’abord le tampon de deux à 37 degrés Celsius pendant le chauffage. Remplissez un récipient en plastique de 500 millilitres avec environ 250 millilitres de tampon. Un.

Retirez le réseau de la chambre d’hybridation, immergez-le et séparez-le de la glissière du joint. Transférez le réseau dans le récipient propre et lavez-le dans la mémoire tampon pendant une minute. Ensuite, à l’aide d’un récipient en plastique séparé de 500 millilitres.

Lavez l’ensemble dans la mémoire tampon préchauffée deux pendant une minute. Après le lavage, retirez lentement la matrice de la mémoire tampon. Deuxièmement, faire attention à éviter les bulles.

Utilisez une lingette Kim pour évacuer l’humidité supplémentaire tout en prenant soin d’éviter de toucher directement le côté actif de la matrice. Enfin, placez la diapositive dans le support de diapositives côté Agilent vers le haut et insérez-la dans le scanner de réseau. Dans cette procédure, nous utilisons un scanner à ADN Agilent de deux microns.

Scannez le réseau à trois marqueurs SI à cinq microns ou deux microns selon le protocole de balayage standard de l’instrument. Analysez les microarrays de chipp viraux par l’analyse de cluster ou le programme automatisé d’analyse de chipp RO e unpredic. À l’aide de la puce Viro Chipp 2009, le nouveau virus de la grippe H, un, N, est facilement détecté dans l’échantillon d’écouvillon nasal prélevé sur un enfant atteint d’un syndrome grippal.

De plus, nous avons montré que la puce virale est capable d’identifier non seulement les virus respiratoires, mais aussi un large éventail de virus provenant d’une variété de tissus et de fluides corporels différents. Quelques exemples de détection de virus dans le sang total et le sérum à l’aide du vichi, comme indiqué ici. Il s’agit d’appels correspondant à des microrayons de viropuce à partir d’échantillons de sang, soit du sang total, soit du sérum prélevé sur quatre patients pour chaque échantillon, les deux premières prédictions de virus sont montrées avec la première prédiction de virus ayant la valeur P la plus basse.

Par exemple, dans l’échantillon surligné en bleu clair, la prédiction la plus élevée pour cet échantillon est le virus de la dengue de type un. Alors que la deuxième prédiction est le virus de la dengue de type deux, le virus réel dans cet échantillon de sang total a en effet été confirmé comme étant le virus de la dengue de type 1, en accord avec les résultats du dict. Une autre application de la puce viro est la découverte de nouveaux agents pathogènes.

Parmi les exemples, citons les découvertes du coronavirus du SRAS X-M-R-V-A, le rétrovirus OME lié au cancer de la prostate et au syndrome de fatigue chronique chez l’homme et le HTCV, un nouveau virus cardio humain associé aux infections respiratoires et diarrhéiques chez les enfants Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en 12 heures si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de s’assurer de la disponibilité de tout l’équipement et des réactifs nécessaires en suivant cette procédure.

D’autres méthodes, telles que l’amplification virale spécifique et le séquençage profond, peuvent être effectuées afin de confirmer et de suivre des modèles inhabituels d’hybridation de puces virales ou des résultats de puces virales qui suggèrent la présence d’un nouveau virus après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’oncologie pour explorer l’association de nouveaux virus avec le cancer, dans les domaines de la biodéfense et de la microbiologie clinique pour développer des tests micro-condensés pour le diagnostic rapide des agents pathogènes, et dans le domaine de la virologie pour la caractérisation de nouveaux virus et leur association avec la maladie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer toutes les étapes du test microgénique sur puce virale, un test de surveillance à large spectre pour détecter les agents pathogènes viraux dans les échantillons cliniques, depuis l’extraction des acides nucléiques, des échantillons cliniques jusqu’à l’hybridation et l’analyse des microrayons.

N’oubliez pas que travailler avec des échantillons cliniques est considéré comme biodangereux et que l’extraction des acides nucléiques doit être effectuée dans des laboratoires classés au niveau de biosécurité deux ou supérieur.