En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

Cette procédure utilise la puce Viro, un test panviral par puces à ADN, pour analyser des échantillons cliniques à la recherche de virus connus et inconnus. Tout d'abord, les acides nucléiques sont extraits des échantillons cliniques. Ensuite, l'ARN extrait est rétrotranscrit à l'aide d'amorces aléatoires.

La synthèse de l'ADN du deuxième brin est réalisée, puis la bibliothèque d'ADNc est amplifiée par PCR aléatoire. Ensuite, l'ADNc amplifié est marqué avec des colorants fluorescents et hybridé sur une puces à ADN virale. La dernière étape consiste à scanner et analyser la puces à ADN.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la présence ou l'absence d'un virus ou de plusieurs virus par l'analyse de la puces de biopuce. Des méthodes de détection à large spectre, telles qu'une biopuce virale, sont nécessaires en microbiologie diagnostique car des syndromes cliniques courants comme la pneumonie ne sont pas spécifiques à un agent pathogène particulier, et en raison de la menace constante de nouveaux agents pathogènes viraux tels que le coronavirus du SRAS et le virus de la grippe H1N1 apparu en 2009. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la microbiologie diagnostique, telles que quel pourcentage d'infections non diagnostiquées en milieu clinique pourrait être causé par des virus nouveaux et jusqu'ici non identifiés. Les implications de cette technique s'étendent vers un meilleur diagnostic des maladies cliniques aiguës à l'hôpital, car nous testons simultanément des centaines, voire des milliers, d'agents pathogènes potentiels.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en 2002, lorsque nous avons décidé d'appliquer la technologie nouvellement développée des puces à ADN, mise au point dans le laboratoire du Dr Joseph DeRisi à l'UCSF, à la détection des virus. Notre premier cas concret a consisté à utiliser la puce virale pour identifier un nouveau coronavirus responsable du SRAS en 2003. La démonstration de la procédure du début à la fin sera effectuée par un technicien de mon laboratoire, qui illustrera l'utilisation du test par puce virale sur un prélèvement nasal provenant d'un enfant afin de diagnostiquer la cause de sa maladie respiratoire aiguë. Les échantillons prélevés au niveau du nasopharynx sont recueillis dans des récipients stériles contenant un milieu liquide de transport viral, puis stockés congelés dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Dans une hotte de sécurité biologique, laissez décongeler le tube contenant l'échantillon et agitez brièvement le prélèvement dans le milieu avant de jeter le prélèvement dans une poubelle pour déchets biologiques dangereux. Ensuite, aliquotez 200 microlitres de l'échantillon dans un tube de 1,5 millilitre. Faites passer l'échantillon à travers un filtre à centrifugation de 0,22 micron afin de purifier les particules virales et récupérez-le dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, utilisez le kit Turbo ADN d'Ambien selon les instructions du fabricant pour dégrader l'ADN génomique de l'hôte et purifier l'acide nucléique viral encapsulé protégé. Procédez ensuite à l'extraction de l'ARN en utilisant le kit d'extraction d'ARN viral XMO ZR ou le kit de virus d'ultrasons de Qiagen, conformément aux instructions du fabricant. Mesurez la concentration de l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop pour acides nucléiques.

La concentration en ARN doit de préférence être d'au moins 10 nanogrammes par microlitre, mais peut varier d'un échantillon à l'autre en utilisant un tube de 200 microlitres à paroi fine. Ajouter un microlitre de l'amorce A à une concentration de 40 picamoles par microlitre à quatre microlitres d'ARN extrait. Chauffer l'échantillon à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un thermocycleur, puis laisser le tube refroidir à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres d'un mélange maître contenant deux microlitres de tampon RT 5X, un microlitre de DNTP 12,5 millimolaire, un microlitre d'eau, 0,5 microlitre de DTT 0,1 molaire et 0,5 microlitre de transcriptase inverse superscript trois, dans un thermocycleur. Incubez le tube à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes. Puis chauffez l'échantillon à 94 degrés Celsius pendant deux minutes.

Pour interrompre la réaction de la transcriptase inverse, porter à 10 degrés Celsius pendant deux minutes et faire une courte centrifugation de cinq secondes. Ensuite, ajouter cinq microlitres de mélange de quease composé d'un microlitre de tampon de quease cinq fois concentré, de 3,8 microlitres d'eau et de 0,15 microlitre de quease pour la synthèse du deuxième brin. Augmenter progressivement la température du thermocycleur de 10 degrés Celsius à 37 degrés Celsius sur une période de huit minutes.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant huit minutes. Puis chauffer à 94 degrés Celsius pendant deux minutes pour inactiver la quease et passer à 10 degrés Celsius à ce stade. Si désiré, conserver l'échantillon contenant 15 microlitres d'ADNc à moins 20 degrés Celsius.

Tout d'abord, ajoutez cinq microlitres d'échantillon d'ADN à 45 microlitres d'un mélange maître composé de cinq microlitres de tampon PCR 10×, un microlitre de dNTP à 12,5 millimolaire, un microlitre d'amorce à 100 pico-moles par microlitre, un microlitre de Taq polymérase et 37 microlitres d'eau. Ensuite, exécutez le protocole PCR selon les étapes suivantes : 94 °C pendant deux minutes, suivi de 25 cycles de 94 °C pendant 30 secondes, 50 °C pendant 45 secondes et 72 °C pendant une minute.

Ensuite, une étape d'extension finale de 72 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivie d'une pause à 10 degrés Celsius après la PCR. Vérifiez le produit de PCR sur un gel d'électrophorèse AOSE à 1,5 %. Une traînée de taille comprise entre environ 200 et 1000 paires de bases devrait être visible.

Pour incorporer le dNTP AAD, ajoutez cinq microlitres de produit PCR viral à 45 microlitres d'un mélange maître composé de cinq microlitres de tampon PCR 10×, un microlitre de dNTP A-A-D-N-T-P à 12,5 millimolaire, un microlitre d'amorce B à 100 pM/µL, un microlitre de ClinTech LA et 37 microlitres d'eau. Exécutez le protocole PCR selon les étapes suivantes : 94 °C pendant deux minutes, puis 15 cycles de 94 °C pendant 30 secondes et 50 °C pendant 45 secondes.

72 degrés Celsius pendant une minute et une étape d'extension de 72 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis maintenir à 10 degrés Celsius. Ensuite, purifier le nouveau produit PCR à l'aide du kit DNA Clean and Concentrator-3 selon les instructions du fabricant et le redissoudre dans 10 microlitres de tampon d'élution. Ajouter un microlitre de bicarbonate un molaire et un microlitre de si trois aux 10 microlitres de produit PCR et incuber pendant une heure à l'abri de la lumière.

Ensuite, nettoyez à nouveau l'échantillon marqué S à l'aide du kit de purification et concentration d'ADN numéro cinq, et élué dans 12 microlitres de tampon d'élution. Utilisez 1,5 microlitre d'échantillon pour vérifier la concentration d'ADNc et la quantité de colorant incorporé sur un spectrophotomètre NanoDrop, dans un tube en bande PCR, avec un microlitre de tampon de fragmentation 25 fois, 5 microlitres de tampon de blocage 5 fois, 9,5 microlitres ou la quantité nécessaire pour obtenir une concentration finale normalisée de 10 picomoles par microlitre de l'échantillon marqué SI trois, et de l'eau jusqu'à un volume total de 25 microlitres. Ajoutez ensuite 25 microlitres de tampon d'hybridation GX 2 fois, puis centrifugez brièvement pour éliminer les bulles.

Placez une nouvelle lame avec joint dans la chambre d'hybridation. Déposez 40 microlitres de l'échantillon sur la lame avec joint. Ensuite, placez le réseau viral imprimé par Agilent, côté marqué Agilent vers le bas, au-dessus de la lame avec joint et serrez fermement la vis.

Placer la chambre d'hybridation dans un four à 65 degrés Celsius et hybridiser toute la nuit en utilisant une rotation lente de 10 tours par minute pour laver les puces. Préchauffer d'abord le tampon deux à 37 degrés Celsius pendant le chauffage. Remplir un récipient en plastique de 500 millilitres avec environ 250 millilitres de tampon.un.

Retirer la matrice de la chambre d'hybridation, plonger la matrice et la séparer de la lame de joint. Transférer la matrice dans un récipient propre et la laver dans le tampon un pendant une minute. Puis, à l’aide d’un autre récipient en plastique de 500 millilitres.

Lavez la matrice dans le tampon deux préchauffé pendant une minute. Après le lavage, retirez lentement la matrice du tampon deux, en prenant soin d'éviter les bulles.

Utilisez un essuie-tout pour absorber l'excès d'humidité tout en prenant soin d'éviter de toucher directement la face active de la matrice. Enfin, placez la lame dans le support de lame, côté Agilent vers le haut, puis insérez-la dans le lecteur de matrice. Dans cette procédure, nous utilisons un lecteur de matrices d'ADN Agilent de deux microns.

Scannez le réseau SI à trois matrices étiquetées à cinq micromètres ou deux micromètres selon le protocole standard de balayage de l'instrument. Analysez les puces microarrays virales par analyse en grappes ou par le programme automatisé d'analyse de puce RO, e unpredic. À l'aide de la puce microarray Viro Chipp, le virus de la grippe H1N1 nouveau de 2009 est facilement détecté dans l'échantillon de prélèvement nasal obtenu auprès d'un enfant présentant une maladie de type grippal.

En outre, nous avons démontré que la puce virale est capable d'identifier non seulement les virus respiratoires, mais aussi un large éventail de virus provenant de divers tissus et fluides corporels. Certains exemples de détection de virus dans le sang total et le sérum à l'aide de la vichi sont présentés ici. Il s'agit d'appels de séquences correspondant à la micropuce virologique à partir d'échantillons sanguins, soit du sang total soit du sérum, prélevés sur quatre patients ; pour chaque échantillon, les deux premières prédictions virales sont indiquées, la première prédiction virale présentant la valeur P la plus faible.

Par exemple, dans l'échantillon mis en évidence en bleu clair, la prédiction principale pour cet échantillon est le virus de la dengue de type un. Bien que la deuxième prédiction classée soit le virus de la dengue de type deux, le virus réel présent dans cet échantillon de sang total a effectivement été confirmé comme étant le virus de la dengue de type un, en accord avec les résultats du dict. Une autre application de la puce viro est la découverte de pathogènes nouveaux.

Des exemples incluent la découverte du coronavirus SARS X-M-R-V-A, du rétrovirus OME lié au cancer de la prostate et au syndrome de fatigue chronique chez l'homme, ainsi que du HTCV, un nouveau cardiovirus humain associé à des infections respiratoires et à la diarrhée chez les enfants. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures si elle est correctement exécutée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de s'assurer que tout l'équipement et les réactifs nécessaires sont disponibles.

D'autres méthodes, telles que l'amplification virale spécifique par PCR et le séquençage profond, peuvent être réalisées afin de confirmer et de suivre des profils inhabituels d'hybridation sur puce virale ou des résultats de puces virales suggérant la présence d'un virus nouveau, après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'oncologie pour explorer l'association entre de nouveaux virus et le cancer, dans les domaines de la biosécurité et de la microbiologie clinique pour développer des tests microscopiques condensés permettant un diagnostic rapide des agents pathogènes, et dans le domaine de la virologie pour la caractérisation de nouveaux virus et de leur lien avec les maladies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer toutes les étapes du test d'analyse sur puce virale, un test de surveillance à large spectre destiné à détecter les agents pathogènes viraux dans des échantillons cliniques, allant de l'extraction des acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques jusqu'à l'hybridation sur micropuce et l'analyse.

N'oubliez pas que le travail avec des échantillons cliniques est considéré comme un risque biologique et que l'extraction des acides nucléiques doit être effectuée dans des laboratoires classés au niveau de biosécurité deux ou supérieur.