Name: En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Apprenez à utiliser le Virochip pour détecter les virus connus et nouveaux dans des échantillons cliniques. Cette méthode de microarray pan-viral améliore le diagnostic des infections respiratoires aiguës.

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Nous remercions David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, et Alexander Greninger pour le développement initial et l&#39;optimisation du protocole Virochip. Ce travail est soutenu par une subvention du NIH K08 et Abbott Discovery Award (pour CC) et le Howard Hughes Medical Institute (au JLD).

Les étapes de l'essai Virochip incluent (1) l'extraction des acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques, (2) la transcription inverse de l'ARN extrait et 2 ème brin synthèse de l'ADNc, (3) L'amplification par PCR de l'ADNc amorcés au hasard, (3) l'incorporation colorant fluorescent Cy3 , (4) l'hybridation des matériaux étiquetés pour la puce Virochip, et (5) la numérisation et l'analyse (figure 1). Le protocole présenté ci-dessous montrent l'utilisation de l'essai sur un échantillon Virochip écouvillon nasal d'un enfant avec un syndrome grippal. Séquences des amorces Amorce A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 ' Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 ' 1. Extraction des acides nucléiques <ol><li> Extraction des acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques doivent être effectuées sous le niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ou plus des conditions, comme ces échantillons sont potentiellement infectieux. </li><li> L'échantillon écouvillon nasal est transporté dans un milieu de détention virale. Partie aliquote de 200 ul de l'échantillon dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. </li><li> En option: passage de l'échantillon à travers un filtre de 0,22 um (pour purifier des particules virales) </li><li> En option: l'échantillon prétraiter à la DNAse (pour dégrader l'ADN génomique d'hôte et de purifier pour les aires protégées, de l'acide nucléique viral encapsidé) en utilisant le kit turbo DNAse (Ambion) par les instructions du fabricant </li><li> Extraire l'échantillon en utilisant l'ARN viral Zymo ZR Extraction Kit ou Kit Qiagen Virus Ultrasens selon les instructions du fabricant. </li></ol> 2. Transcription inverse et 2 ème brin synthèse de l'ADNc («Round A») <ol><li> Ajouter 1 UL 40 pmol / uL Primer A à 4 pl extrait l'ARN. Chauffer à 65 ° C pendant 5 min dans un thermocycleur (par exemple GeneAmp PCR System 9700), puis laisser refroidir à température ambiante température x 5 min. </li><li> Ajouter 5 ul d'un mélange maître comprenant 2 uL de tampon RT 5X, 1 pi 12,5 mM dNTP, 1 uL d'eau, 0,5 pi DTT 0,1 M et 0,5 uL SSIII RT (Invitrogen). Incuber à 42 ° C x 60 minutes. </li><li> Dans un thermocycleur programmable, de la chaleur à 94 ° C x 2 minutes (pour annuler la réaction de la transcriptase inverse), laisser refroidir à 10 ° C, centrifuger le pouls, puis ajouter 5 mélangez Sequenase uL composé d'une mémoire tampon Sequenase uL 5X, 3,8 pi d'eau, et 0,15 uL Sequenase (USB Corporation). Pour 2 ème synthèse des brins, montée en puissance de 10 ° C à 37 ° C en 8 min, tenir 8 min, puis chauffer à 94 ° C x 2 minutes (pour inactiver Sequenase) et laisser refroidir à 10 ° C (en attente). </li><li> En option: Rd Un échantillon d'ADNc peut être conservé à ce point à -20 ° C. </li></ol> 3. Amplification par PCR de hasard apprêté ADNc («Ronde B") <ol><li> Ajouter 5 uL de Rd Un échantillon de 45 ul d'un mélange maître constitué de 5 tampon PCR 10X uL, 1 pi 12,5 mM dNTP, 1 ul amorce B 100 pmol / ul, 1 ul Klentaq LA (Sigma), et 37 pi d'eau. </li><li> Exécuter protocole de PCR comme suit: 94 ° C, 2 min → (25 cycles de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 mn) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attente) </li><li> Vérifier l'échantillon B Rd sur un gel d'électrophorèse d'agarose 1,5%. Un frottis d'environ 200 - 1000 pb devrait être visualisées (figure 2A) </li></ol> 4. Cy3 Incorporation colorant fluorescent <ol><li> En option: un autre échantillon peut être étiqueté avec le colorant fluorescent et Cy5 hybride à la puce même. </li><li> Pour intégrer aa-dNTP, ajouter 5 uL de Rd échantillon B à 45 uL d'un master mix composé de 5 tampon PCR 10X uL, 1 uL 12,5 mm AA-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 apprêt pmol / ul B, 1, 1 uL Klentaq LA (Sigma), et 37 d'eau ul. Exécuter protocole de PCR comme suit: 94 ° C, 2 min → (15 cycles de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 mn) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attente) </li><li> Nettoyer l'échantillon Rd C avec l'ADN propre et Concentrateur-5 Kit (Zymo Research) par les instructions du fabricant. Eluer dans 10 ul. </li><li> Ajouter 1 uL de bicarbonate de 1M (Sigma) et 1 ul Cy5 (GE Healthcare) à l'échantillon Rd C. </li><li> Incuber x 1 heure dans l'obscurité. </li><li> Nettoyer l'échantillon Cy3-étiquetés avec l'ADN propre et Concentrateur-5 Kit (Zymo Research) par les instructions du fabricant. Eluer dans 12 uL. </li></ol> 5. Hybridation d'Virochip Microarray <ol><li> En option: utiliser 1,5 uL de vérifier la concentration d'ADNc et la quantité de colorant incorporé sur un spectrophotomètre Nanodrop (pour la normalisation des échantillons) </li><li> Dans un tube de la bande de PCR ajouter 1 pi de tampon de fragmentation 25X, 5 pl de tampon 5X blocage, 9,5 ul (ou le montant de normaliser) de Cy3-étiquetés de l'échantillon, et l'eau pour un volume total de 25 uL (Agilent) </li><li> Ajouter 25 uL de tampon d'hybridation 2X Gex (Agilent). Centrifuger brièvement pour éliminer les bulles. </li><li> Charge à 40 uL de l'échantillon sur la glissière du joint. </li><li> Placez-imprimés Agilent array Virochip (Université de Californiune, San Francisco / Agilent) (côté marqué "Agilent" vers le bas) sur le dessus de la glissière joint et fixez la vis serrée. </li><li> Hybrider nuit dans le four à 65 ° C, réglage de la vitesse à 10 tpm. </li><li> Pour laver les tableaux, préchauffer le tampon de 2 (Agilent) à 37 ° C. Prenez part sous joint sandwichs glisser / tableau dans un tampon de 1 (Agilent). Laver dans le tampon de 1 x 1 min. Laver dans le tampon préchauffé 2 x 1 min. Retirer lentement glisser du tampon 2, en prenant soin d'éviter les bulles (utilisation Kimwipe pour évacuer l'humidité supplémentaire en prenant soin d'éviter de toucher directement l'aspect actif de la matrice) </li><li> Placez diapositives dans le support de diapositives et insérer dans scanneur tableau. </li></ol> 6. Virochip balayage et d'analyse <ol><li> Balayage Cy3 étiquetés tableau à 5 um um ou 2 selon le protocole de l'instrument de balayage standard (figure 2B). </li><li> Analyser microarrays Virochip par inspection visuelle, l'analyse typologique, ou le programme d'analyse automatisée Virochip, E-Predict 11. En chacun de ces trois méthodes, le virus de l'influenza est facilement détectée dans l'échantillon écouvillon nasal (à partir d'un enfant avec syndrome grippal) (figure 2C) </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Lorsque le protocole est fait correctement, un frottis devraient être visibles sur l'électrophorèse sur gel d'agarose après l'étape Rd B (figure 2A). Les biopuces Virochip sur la plateforme Agilent sera difficile d'analyser visuellement (figure 2B), mais si un virus est présent, il devrait être facilement identifiés par l'inspection visuelle, l'analyse typologique, et / ou E-Predict (figure 1C). Les échantillons peuvent être dopés avec des quantités mesurées de l'acide nucléique d'un virus connu (par exemple le virus de la mosaïque du tabac; bactériophage MS2) pour servir de contrôle positif pour le dosage. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma des biopuces Virochip traitement et d'analyse. Extraite d'acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques sont amplifiés au hasard, marqués avec des colorants fluorescents, et hybridées à la puce Virochip. Microarrays sont numérisées à une résolution de 2 um et analysées en utilisant une variété d'outils informatiques, y compris E-Predict. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Étapes dans le dosage de Virochip Après amplification par PCR aléatoire, un frottis de 200 -. 1000 pb peut être visualisé par électrophorèse sur gel (A) (B) Trois puces Virochip sur les 8 tableaux / lame de verre sont présentés, avec une petite région. d'une biopuce soufflé dans l'encart dans le coin inférieur droit. (C) automatisé biopuces d'analyse virale en utilisant E-Predict révélant la présence de virus influenza A dans l'échantillon clinique. Le score de similarité élevé (s = 0,55) correspond à une p-valeur qui est proche de zéro, ce qui rend cette une prédiction extrêmement important.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
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<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

Le protocole Virochip comme décrit ici est complexe et nécessite un technicien de recherche minutieux et compétent. Concentrations de réactifs et des conditions correctes pour la PCR, l&#39;étiquetage, et l&#39;hybridation sont critiques. Le protocole Virochip peut être facilement modifié pour accueillir l&#39;analyse des tissus malades par l&#39;utilisation d&#39;une méthode d&#39;extraction des tissus tels que Trizol (Invitrogen) pour l&#39;extraction des acides nucléiques. Les sondes peuvent être ajoutées ou supprimées au besoin d&#39;obtenir le spectre désiré et l&#39;étendue de la couverture, par exemple, des sondes pour la détection de cibles non viraux tels que les bactéries et les champignons peuvent être conçus et ajouté «à la volée&quot;. Certaines applications de l&#39;analyse Virochip actuellement en développement comprennent large spectre diagnostic des maladies virales dans les laboratoires cliniques, l&#39;investigation des flambées, le dépistage pureté des médicaments et des vaccins, et la découverte de nouveaux agents pathogènes viraux.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif / matériel </th><th> Nom de réactif / matériel </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Mix Master (5 uL) </td><td> 2 ul de tampon 5X RT </td></tr><tr><td> 1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 uL d&#39;eau </td></tr><tr><td> 0,5 ul DTT 0,1 M </td></tr><tr><td> 0,5 ul SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 uL) </td><td> 1 pl de tampon 5X Sequenase </td></tr><tr><td> 3,8 uL d&#39;eau </td></tr><tr><td> 0,15 uL Sequenase (USB Corporation) </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd B PCR Master Mix (45 ul) </td><td> 5 ul de tampon 10X PCR </td></tr><tr><td> 1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ul 100 amorce B pmol / uL </td></tr><tr><td> 1 ul Klentaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 uL d&#39;eau </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd C PCR Master Mix (45 ul) </td><td> 5 uL de tampon 10X PCR </td></tr><tr><td> 1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ul 100 amorce B pmol / uL </td></tr><tr><td> 1 ul Klentaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 uL d&#39;eau </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampon d&#39;hybridation (25 ul) </td><td> 1 pi de tampon de fragmentation 25X (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 ul de tampon 5X blocage (Agilent) </td></tr><tr><td> 9,5 ul (ou le montant de normaliser) de Cy3-étiquetés de l&#39;échantillon </td></tr><tr><td> Ajouter de l&#39;eau au volume total de 25 uL </td></tr><tr><td> Agilent Virochip biopuces </td><td> licence en attendant, disponible à Chiu laboratoire, UCSF </td></tr></tbody></table>

en utilisant un dosage microarray pan-virale (virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Le diagnostic des causes virales de nombreuses maladies infectieuses est difficile en raison de la diversité des séquences inhérentes de virus ainsi que l&#39;émergence continue de nouveaux agents pathogènes viraux, tels que le coronavirus du SRAS et de grippe pandémique H1N1 2009 virus, qui ne sont pas détectables par les méthodes traditionnelles. Pour relever ces défis, nous avons précédemment développé et validé une plateforme biopuces pan-virale appelée Virochip avec la capacité de détecter tous les virus connus ainsi que de nouveaux variants sur la base d&#39;une homologie de séquence conservée 1. Utilisation de la Virochip, nous avons identifié le spectre complet des virus associés à des infections respiratoires, y compris des cas de maladie grave inexpliquée chez les patients hospitalisés, avec une sensibilité équivalente ou supérieure à 2-5 tests cliniques classiques. Le Virochip a également été utilisé pour identifier de nouveaux virus, y compris le coronavirus du SRAS 6,7, un clade rhinovirus roman 5, XMRV (un rétrovirus liés à la prostate) 8, bornavirus aviaire (la cause d&#39;une maladie débilitante chez les perroquets) 9, et un roman dans cardiovirus enfants souffrant de maladies respiratoires et diarrhéiques 10. La version actuelle de la Virochip a été porté à une plateforme Agilent microarray et se compose de 36 000 ~ sondes issues de plus de 1500 ~ virus dans GenBank à partir de Décembre 2009. Nous montrerons les étapes impliquées dans le traitement d&#39;un test Virochip du début à la fin (temps ~ retournement 24 heures), y compris l&#39;extraction des acides nucléiques de l&#39;échantillon, l&#39;amplification par PCR utilisant des amorces aléatoires, l&#39;incorporation de colorants fluorescents, et l&#39;hybridation biopuces, de numérisation et d&#39;analyse.

Le Virochip est une puce pan-viral conçu pour détecter simultanément tous les virus connus ainsi que de nouveaux virus sur la base d&#39;une homologie de séquence conservée. Ici, nous montrent comment exécuter un test Virochip pour analyser des échantillons cliniques pour la présence de virus connus et inconnus.

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

Le diagnostic des causes virales de nombreuses maladies infectieuses est difficile en raison de la diversité séquentielle inhérente aux virus ainsi que de l'émergence continue...

Cette procédure utilise la puce Viro, un test panviral par puces à ADN, pour analyser des échantillons cliniques à la recherche de virus connus et inconnus. Tout d'abord, les acides nucléiques sont extraits des échantillons cliniques. Ensuite, l'ARN extrait est rétrotranscrit à l'aide d'amorces aléatoires.La synthèse de l'ADN du deuxième brin est réalisée, puis la bibliothèque d'ADNc est amplifiée par PCR aléatoire. Ensuite, l'ADNc amplifié est marqué avec des colorants fluorescents et hybridé sur une puces à ADN virale. La dernière étape consiste à scanner et analyser la puces à ADN.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la présence ou l'absence d'un virus ou de plusieurs virus par l'analyse de la puces de biopuce. Des méthodes de détection à large spectre, telles qu'une biopuce virale, sont nécessaires en microbiologie diagnostique car des syndromes cliniques courants comme la pneumonie ne sont pas spécifiques à un agent pathogène particulier, et en raison de la menace constante de nouveaux agents pathogènes viraux tels que le coronavirus du SRAS et le virus de la grippe H1N1 apparu en 2009. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la microbiologie diagnostique, telles que quel pourcentage d'infections non diagnostiquées en milieu clinique pourrait être causé par des virus nouveaux et jusqu'ici non identifiés. Les implications de cette technique s'étendent vers un meilleur diagnostic des maladies cliniques aiguës à l'hôpital, car nous testons simultanément des centaines, voire des milliers, d'agents pathogènes potentiels.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en 2002, lorsque nous avons décidé d'appliquer la technologie nouvellement développée des puces à ADN, mise au point dans le laboratoire du Dr Joseph DeRisi à l'UCSF, à la détection des virus. Notre premier cas concret a consisté à utiliser la puce virale pour identifier un nouveau coronavirus responsable du SRAS en 2003. La démonstration de la procédure du début à la fin sera effectuée par un technicien de mon laboratoire, qui illustrera l'utilisation du test par puce virale sur un prélèvement nasal provenant d'un enfant afin de diagnostiquer la cause de sa maladie respiratoire aiguë. Les échantillons prélevés au niveau du nasopharynx sont recueillis dans des récipients stériles contenant un milieu liquide de transport viral, puis stockés congelés dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.Dans une hotte de sécurité biologique, laissez décongeler le tube contenant l'échantillon et agitez brièvement le prélèvement dans le milieu avant de jeter le prélèvement dans une poubelle pour déchets biologiques dangereux. Ensuite, aliquotez 200 microlitres de l'échantillon dans un tube de 1,5 millilitre. Faites passer l'échantillon à travers un filtre à centrifugation de 0,22 micron afin de purifier les particules virales et récupérez-le dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.Ensuite, utilisez le kit Turbo ADN d'Ambien selon les instructions du fabricant pour dégrader l'ADN génomique de l'hôte et purifier l'acide nucléique viral encapsulé protégé. Procédez ensuite à l'extraction de l'ARN en utilisant le kit d'extraction d'ARN viral XMO ZR ou le kit de virus d'ultrasons de Qiagen, conformément aux instructions du fabricant. Mesurez la concentration de l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop pour acides nucléiques.La concentration en ARN doit de préférence être d'au moins 10 nanogrammes par microlitre, mais peut varier d'un échantillon à l'autre en utilisant un tube de 200 microlitres à paroi fine. Ajouter un microlitre de l'amorce A à une concentration de 40 picamoles par microlitre à quatre microlitres d'ARN extrait. Chauffer l'échantillon à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un thermocycleur, puis laisser le tube refroidir à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, ajoutez cinq microlitres d'un mélange maître contenant deux microlitres de tampon RT 5X, un microlitre de DNTP 12,5 millimolaire, un microlitre d'eau, 0,5 microlitre de DTT 0,1 molaire et 0,5 microlitre de transcriptase inverse superscript trois, dans un thermocycleur. Incubez le tube à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes. Puis chauffez l'échantillon à 94 degrés Celsius pendant deux minutes.Pour interrompre la réaction de la transcriptase inverse, porter à 10 degrés Celsius pendant deux minutes et faire une courte centrifugation de cinq secondes. Ensuite, ajouter cinq microlitres de mélange de quease composé d'un microlitre de tampon de quease cinq fois concentré, de 3,8 microlitres d'eau et de 0,15 microlitre de quease pour la synthèse du deuxième brin. Augmenter progressivement la température du thermocycleur de 10 degrés Celsius à 37 degrés Celsius sur une période de huit minutes.Incuber à 37 degrés Celsius pendant huit minutes. Puis chauffer à 94 degrés Celsius pendant deux minutes pour inactiver la quease et passer à 10 degrés Celsius à ce stade. Si désiré, conserver l'échantillon contenant 15 microlitres d'ADNc à moins 20 degrés Celsius.Tout d'abord, ajoutez cinq microlitres d'échantillon d'ADN à 45 microlitres d'un mélange maître composé de cinq microlitres de tampon PCR 10×, un microlitre de dNTP à 12,5 millimolaire, un microlitre d'amorce à 100 pico-moles par microlitre, un microlitre de Taq polymérase et 37 microlitres d'eau. Ensuite, exécutez le protocole PCR selon les étapes suivantes : 94 °C pendant deux minutes, suivi de 25 cycles de 94 °C pendant 30 secondes, 50 °C pendant 45 secondes et 72 °C pendant une minute.Ensuite, une étape d'extension finale de 72 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivie d'une pause à 10 degrés Celsius après la PCR. Vérifiez le produit de PCR sur un gel d'électrophorèse AOSE à 1,5 %. Une traînée de taille comprise entre environ 200 et 1000 paires de bases devrait être visible.Pour incorporer le dNTP AAD, ajoutez cinq microlitres de produit PCR viral à 45 microlitres d'un mélange maître composé de cinq microlitres de tampon PCR 10×, un microlitre de dNTP A-A-D-N-T-P à 12,5 millimolaire, un microlitre d'amorce B à 100 pM/µL, un microlitre de ClinTech LA et 37 microlitres d'eau. Exécutez le protocole PCR selon les étapes suivantes : 94 °C pendant deux minutes, puis 15 cycles de 94 °C pendant 30 secondes et 50 °C pendant 45 secondes.72 degrés Celsius pendant une minute et une étape d'extension de 72 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis maintenir à 10 degrés Celsius. Ensuite, purifier le nouveau produit PCR à l'aide du kit DNA Clean and Concentrator-3 selon les instructions du fabricant et le redissoudre dans 10 microlitres de tampon d'élution. Ajouter un microlitre de bicarbonate un molaire et un microlitre de si trois aux 10 microlitres de produit PCR et incuber pendant une heure à l'abri de la lumière.Ensuite, nettoyez à nouveau l'échantillon marqué S à l'aide du kit de purification et concentration d'ADN numéro cinq, et élué dans 12 microlitres de tampon d'élution. Utilisez 1,5 microlitre d'échantillon pour vérifier la concentration d'ADNc et la quantité de colorant incorporé sur un spectrophotomètre NanoDrop, dans un tube en bande PCR, avec un microlitre de tampon de fragmentation 25 fois, 5 microlitres de tampon de blocage 5 fois, 9,5 microlitres ou la quantité nécessaire pour obtenir une concentration finale normalisée de 10 picomoles par microlitre de l'échantillon marqué SI trois, et de l'eau jusqu'à un volume total de 25 microlitres. Ajoutez ensuite 25 microlitres de tampon d'hybridation GX 2 fois, puis centrifugez brièvement pour éliminer les bulles.Placez une nouvelle lame avec joint dans la chambre d'hybridation. Déposez 40 microlitres de l'échantillon sur la lame avec joint. Ensuite, placez le réseau viral imprimé par Agilent, côté marqué Agilent vers le bas, au-dessus de la lame avec joint et serrez fermement la vis.Placer la chambre d'hybridation dans un four à 65 degrés Celsius et hybridiser toute la nuit en utilisant une rotation lente de 10 tours par minute pour laver les puces. Préchauffer d'abord le tampon deux à 37 degrés Celsius pendant le chauffage. Remplir un récipient en plastique de 500 millilitres avec environ 250 millilitres de tampon.un.Retirer la matrice de la chambre d'hybridation, plonger la matrice et la séparer de la lame de joint. Transférer la matrice dans un récipient propre et la laver dans le tampon un pendant une minute. Puis, à l’aide d’un autre récipient en plastique de 500 millilitres.Lavez la matrice dans le tampon deux préchauffé pendant une minute. Après le lavage, retirez lentement la matrice du tampon deux, en prenant soin d'éviter les bulles.Utilisez un essuie-tout pour absorber l'excès d'humidité tout en prenant soin d'éviter de toucher directement la face active de la matrice. Enfin, placez la lame dans le support de lame, côté Agilent vers le haut, puis insérez-la dans le lecteur de matrice. Dans cette procédure, nous utilisons un lecteur de matrices d'ADN Agilent de deux microns.Scannez le réseau SI à trois matrices étiquetées à cinq micromètres ou deux micromètres selon le protocole standard de balayage de l'instrument. Analysez les puces microarrays virales par analyse en grappes ou par le programme automatisé d'analyse de puce RO, e unpredic. À l'aide de la puce microarray Viro Chipp, le virus de la grippe H1N1 nouveau de 2009 est facilement détecté dans l'échantillon de prélèvement nasal obtenu auprès d'un enfant présentant une maladie de type grippal.En outre, nous avons démontré que la puce virale est capable d'identifier non seulement les virus respiratoires, mais aussi un large éventail de virus provenant de divers tissus et fluides corporels. Certains exemples de détection de virus dans le sang total et le sérum à l'aide de la vichi sont présentés ici. Il s'agit d'appels de séquences correspondant à la micropuce virologique à partir d'échantillons sanguins, soit du sang total soit du sérum, prélevés sur quatre patients ; pour chaque échantillon, les deux premières prédictions virales sont indiquées, la première prédiction virale présentant la valeur P la plus faible.Par exemple, dans l'échantillon mis en évidence en bleu clair, la prédiction principale pour cet échantillon est le virus de la dengue de type un. Bien que la deuxième prédiction classée soit le virus de la dengue de type deux, le virus réel présent dans cet échantillon de sang total a effectivement été confirmé comme étant le virus de la dengue de type un, en accord avec les résultats du dict. Une autre application de la puce viro est la découverte de pathogènes nouveaux.Des exemples incluent la découverte du coronavirus SARS X-M-R-V-A, du rétrovirus OME lié au cancer de la prostate et au syndrome de fatigue chronique chez l'homme, ainsi que du HTCV, un nouveau cardiovirus humain associé à des infections respiratoires et à la diarrhée chez les enfants. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures si elle est correctement exécutée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de s'assurer que tout l'équipement et les réactifs nécessaires sont disponibles. D'autres méthodes, telles que l'amplification virale spécifique par PCR et le séquençage profond, peuvent être réalisées afin de confirmer et de suivre des profils inhabituels d'hybridation sur puce virale ou des résultats de puces virales suggérant la présence d'un virus nouveau, après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'oncologie pour explorer l'association entre de nouveaux virus et le cancer, dans les domaines de la biosécurité et de la microbiologie clinique pour développer des tests microscopiques condensés permettant un diagnostic rapide des agents pathogènes, et dans le domaine de la virologie pour la caractérisation de nouveaux virus et de leur lien avec les maladies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer toutes les étapes du test d'analyse sur puce virale, un test de surveillance à large spectre destiné à détecter les agents pathogènes viraux dans des échantillons cliniques, allant de l'extraction des acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques jusqu'à l'hybridation sur micropuce et l'analyse.N'oubliez pas que le travail avec des échantillons cliniques est considéré comme un risque biologique et que l'extraction des acides nucléiques doit être effectuée dans des laboratoires classés au niveau de biosécurité deux ou supérieur.

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JoVE Journal

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