Name: Etudier lintégration des adultes-né Neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Découvrez l'intégration fonctionnelle des neurones granuleux dentés néonataux chez la souris adulte par marquage rétroviral et patch-clamp. Cette méthode permet d'analyser la maturation synaptique et les connexions neuronales dans l'hippocampe.

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Ce travail a été financé par NINDS et l&#39;American Heart Association à S.Ge. Cette approche a été initialement créé et développé par l&#39;auteur dans le laboratoire du Dr Hongjun Song à l&#39;Université Johns Hopkins. Nous tenons à remercier le Dr Hongjun chanson pour ses conseils et de soutien.

1. Injection du virus Haute-titrage des rétrovirus modifiés (1 × 10 9 unités / ml) est produite par co-transfection des vecteurs rétroviraux et VSVG en cellules HEK293T, suivie par ultracentrifugation du surnageant viral. Pour les sources et méthodes de production, voir la démonstration JoVE excellente (3). Remarque: Les jeunes adultes (4-6 semaines) femelle souris C57Bl / 6 (Charles River) sont logés dans des conditions standard. Toutes les procédures à suivre le Guide du Conseil national de recherches pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire selon un protocole approuvé par le IACUC l'Université Stony Brook. <ol><li> 2UL Dégel des rétrovirus gelés par animal sur la glace. </li><li> Anesthésier (100 mg de kétamine + 10 xylazine ug par gramme de poids corporel) et monter l'animal sur un cadre stéréotaxique (Steolting). Enlever les cheveux sur la tête et essuyer la peau avec de l'éthanol à 70%. </li><li> Exposer le crâne et percez quatre trous peu profonds à l'aide d'une fraise dentaire (0,6 mm foret) aux coordonnées suivantes: <ul><li> anterioposterior = -2 mm du bregma; latérale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm de bregma; latérale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm. </li><li> anterioposterior = -2 mm du bregma; latérale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm de bregma; latérale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm. </li></ul></li><li> Monter une Hamilton 1 microlitre, plate-bout de la seringue et injecter 0,5 rétrovirus ul par site à un taux de 0,25 l / min dans le gyrus denté. (Voir les coordonnées ci-dessus pour la profondeur ventrale.) Pause 2 minutes après chaque injection avant retirant lentement la seringue pour empêcher le retour du liquide. Entre les injections, brièvement rincer la surface externe de l'extrémité de la seringue avec du PBS stérile et un applicateur pour enlever les traces de sang. </li><li> Fermez la plaie avec du matériel de suture chirurgical stérile (type P-1; Taille 6-0) et le retour de l'animal aux conditions de logement standard jusqu'à l'heure désirée stades après l'injection. </li></ol> 2. Préparation Trancher Pour obtenir de haute qualité à partir des tranches aiguë chez la souris adulte, nous utilisons une solution de découpe modifiés pour la préparation de tranche (voir ci-dessous). <ol><li> Solution de coupe pré-froid à 0-4 ° C sur la glace et la bulle avec 95% d'O 2 -5% CO 2 pendant au moins 30 minutes. </li><li> Anesthésier et transcardiaque perfuser un animal avec glacée saturée en oxygène solution de découpe. </li><li> Enlever rapidement le cerveau dans une boîte de Petri avec du papier-filtre pré-mouillé avec le froid, la solution de découpe oxygénée. Couper la tranche de cervelet et une surface de montage d'au moins 1mm antérieure à l'injection de coordonnées (visibles). Collez le cerveau sur une scène vibrotome et le monter dans la chambre de coupe remplie de la solution de découpe à froid et oxygéné. </li><li> Préparer les tranches coronales ou horizontale (300-350μm) et les transférer avec une pipette de gros calibre à une chambre d'incubation à température ambiante contenant ACSF barbotage avec 95% d'O 2 / 5% CO 2. </li><li> Incuber les coupes, bouillonne en permanence, à 32 ° C pendant 30-60 minutes. Retour dans la chambre à température ambiante pendant la durée de l'enregistrement. </li></ol> 3. Des expériences électrophysiologiques <ol><li> Les tranches sont transférées dans la chambre d'enregistrement qui est perfusée en continu avec de l'oxygène saturé ACSF à 32 ° C - 34 ° C. </li><li> Une électrode de stimulation bipolaire de tungstène est placé dans la couche moléculaire du gyrus denté en utilisant un objectif de microscope à faible grossissement (10X). </li><li> DGCS nouveau-né dans la zone sous-granulaire / couche de cellules granulaires sont identifiés par l'expression de la GFP ou dTomato. L'enregistrement patchclamp cellule entière est effectuée sur les nouveaux neurones à fort grossissement (40x). </li><li> Propriétés de cuisson des cellules enregistrées sont obtenues par injection d'une série de courants sous-courants pince mode. </li><li> Stimuli électriques sont livrés par l'électrode de stimulation par l'intermédiaire d'un isolateur stimulation contrôlée par le logiciel d'enregistrement, et évoqué les courants postsynaptiques dans la DGCS-nés sont enregistrés. </li></ol> 4. Analyse des données Amplitudes des réponses évoquées postsynaptiques sont analysés à différents stades de développement de l'adulte née neurones. 5. Les résultats représentatifs En utilisant le protocole ci-dessus, l'expression de GFP dans les neurones nés gyrus denté semblable à la figure 1 est commune. Notez que les nouveaux neurones sont facilement visualisés et deux dendrites et les axones sont solidement étiquetés. Expression en fines axones GCR et de petites épines dépend de la qualité et le titre du virus, le promoteur utilisé et la longueur de l'expression in vivo. Dans nos mains, les cellules-nés et sub-cellulaire des organites sont habituellement visibles en quelques jours après l'injection, la colonne vertébrale et d'expression peut être tracée dès les premiers stades de développement. Wtrou de cellules à partir d'enregistrements nouveaux neurones à des stades différents du temps permettent l'étude des propriétés uniques de cellules nouveau-né, par exemple, des potentiels d'action (figure 2a), ainsi que le processus d'intégration synaptique dans les circuits neuronaux existants lors de la maturation (Figure 2b). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 à 2 photons image confocale de nouveaux neurones dans une section horizontale gyrus denté d'une souris adulte. Cellules vertes sont 21dpi (jours après l'injection) exprimant la GFP DGCS nés étiquetés avec Pux-GFP rétrovirus. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 a, b) du potentiel d'action tirs propriétés d'un nouveau-né à 21 DGC dpi.) Représentant a évoqué excitateurs courants postsynaptiques (EPSCs) enregistrées sur une GCR-né à 21 dpi.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

Neurogenèse dans l&#39;hippocampe continue des adultes cerveau des mammifères fournit un système modèle expérimental unique pour étudier le développement et l&#39;intégration neuronale dans le cerveau mature. Le protocole présenté ici associe l&#39;étiquetage rétroviraux et aux méthodes électrophysiologiques pour étudier l&#39;intégration des nouveaux-nés neurones granulaires denté dans les cerveaux de souris adultes. Afin de s&#39;assurer que vos expériences sont réussies, nous recommandons ce qui suit au cours des étapes critiques de la procédure: Pour éviter l&#39;infection et l&#39;inflammation indésirables, tous les outils doivent être stérilisés (par autoclavage, tout type de stérilisateur, ou d&#39;éthanol à 70%) avant la chirurgie. Utiliser du PBS stérile pour laver la pointe de l&#39;aiguille de la seringue avant l&#39;injection. Pour l&#39;injection du virus, les animaux doivent être bien monté sur le dispositif de stéréotaxie et les sources de mouvements inutiles doivent être minimisés pendant l&#39;injection. Assurez-vous que la tête est bien fixe et ferme, et ajuster la position du nez de la souris au niveau de bregma et lambda avant l&#39;injection du calcul des coordonnées. Extrait du virus dans la seringue rapidement pour minimiser l&#39;exposition à des températures ambiantes - les rétrovirus sont particulièrement sensibles à la température. Injecter lentement le virus à la dose recommandée pour minimiser les dégâts de pression. Utiliser le recommande à bout plat seringue (vs commune embout biseauté) assurera une répartie secteur denté infection gyrus. Avant de préparer les tranches, solution de découpe et l&#39;incubation doit être ACSF barbotage avec 95% de CO 2 O 2 -5% pendant au moins 30 minutes pour permettre à l&#39;oxygène pour saturer les solutions. Les animaux doivent être perfusés rapidement et tissus maintenus dans le froid, saturée en oxygène solution pour la meilleure qualité tranche. Pour l&#39;enregistrement, l&#39;augmentation de l&#39;intensité du stimulus progressivement jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est une réponse postsynaptique. Changer l&#39;emplacement de l&#39;électrode de stimulation dans la couche moléculaire du gyrus denté, si nécessaire. En résumé, l&#39;approche recommandée offre un moyen d&#39;explorer les propriétés distinctes et possible des rôles fonctionnels des adultes-né neurones au cours du stade précoce intégration active, circuits matures.

<ul><li> Solution de découpe (en mm): 110 chlorure de choline, 2,5 KCl, 1,3 KH 2 PO 4, 25,0 NaHCO 3, 0,5 CaCl2, MgCl2 7, 10 dextrose, ascorbate de sodium 1,3, 0,6 pyruvate de sodium, l&#39;acide 5,0 kynurénique. </li><li> Artificial liquide céphalo-rachidien (ACSF, en mm): 125,0 NaCl, 25,0 NaHCO 3, 2,5 KCl, CaCl 2 2, 1,3 KH 2 PO 4, 1,3 MgCl 2, 1,3 ascorbate de sodium, 0,6 pyruvate de sodium, 10 dextrose. </li><li> Solution interne pour la cellule entière patchclamp (en mm): 120 gluconate de potassium, KCl 15, 4 MgCl 2, 0,1 EGTA, HEPES 10,0, 4 MgATP, 0,3 Na 3 GTP, 7 phosphocréatine (pH 7,4, à 300 mOsm). </li></ul>

etudier l&#39;intégration des adultes-né neurones

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenèse adulte se produit dans le cerveau des mammifères dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et dans la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus dentelé hippocampique long de la vie. Des rapports antérieurs ont montré que la neurogenèse hippocampique adulte est associée à des troubles cérébraux divers, y compris l&#39;épilepsie, la schizophrénie, la dépression et l&#39;anxiété (1). Décrypter le processus d&#39;intégration des neurones normaux et aberrants pour adultes-né peut faire la lumière sur l&#39;étiologie de ces maladies et d&#39;informer le développement de nouvelles thérapies. Neurogenèse adulte SGZ miroirs embryonnaire et post-natal du développement neuronal, y compris les étapes de la spécification destin, la migration, l&#39;intégration synaptique, et la maturation. Cependant, l&#39;intégration complète se produit sur une période prolongée, de 6 semaines période. Initial entrée synaptique à l&#39;adulte-né cellules granulaires SGZ denté (DGCS) est GABAergique, suivie par l&#39;entrée glutamatergique moins 14 jours (2). Les facteurs spécifiques qui réglementent formation des circuits de l&#39;adulte-né neurones dans le gyrus denté sont actuellement inconnus. Notre laboratoire utilise une réplication déficiente vecteur rétroviral basé sur le virus de la leucémie murine de Moloney pour livrer des protéines fluorescentes et de l&#39;hypothèse des gènes de régulation de ces cellules proliférantes. Cette technique fournit une haute spécificité virale et la résolution pour l&#39;analyse de la date de naissance de cellules, le lignage, la morphologie et la synaptogenèse. Une expérience typique emploie souvent deux ou trois des virus contenant étiquette unique, transgène, et les éléments de promoteur pour analyse unicellulaire d&#39;un processus de développement souhaité in vivo. Le protocole suivant décrit une méthode d&#39;analyse fonctionnelle d&#39;intégration neurone né avec un seul verte (GFP) ou rouge (dTomato) rétrovirus protéine fluorescente et de patch-clamp électrophysiologie.

Une façon d&#39;étudier l&#39;intégration des nouveaux-nés des cellules granulaires denté chez les animaux adultes est décrite. Cette technique utilise un rétrovirus conçu pour étiqueter les nouveaux neurones, suivie par des enregistrements électrophysiologiques de déterminer à l&#39;intégration fonctionnelle in vivo.

Etudier l&#39;intégration des adultes-né Neurones

La neurogenèse se produit dans le cerveau des mammifères adultes au sein de la zone sous-ventriculaire (SVZ) du ventricule latéral et dans la zone sous-granulaire (SGZ) du...

L'objectif général de cette procédure est de présenter une méthode permettant d'étudier l'intégration fonctionnelle des cellules granulaires du gyrus denté issues de la neurogenèse à l'âge adulte. Cette approche s'effectue tout d'abord par une injection stéréotaxique de rétrovirus dans le gyrus denté de souris adultes afin de marquer les cellules granulaires du gyrus denté nouvellement formées. La deuxième étape consiste à perfuser les souris à des stades temporels précis avec une solution de coupe froide et à extraire le cerveau.La troisième étape de la procédure consiste à préparer des tranches cérébrales aiguës à l’aide d’un vibratome. La quatrième étape de la procédure consiste à effectuer des enregistrements en configuration whole cell par patch clamp sur des cellules granulaires dentées nouvelles, et à stimuler la couche moléculaire de tranches cérébrales aiguës. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l’intégration synaptique fonctionnelle des nouveaux neurones en enregistrant et en analysant les courants postsynaptiques évoqués sur les neurones granulaires dentés nouveaux.Les principaux avantages de cette technique sont la transduction rétrovirale des nouveaux neurones dans le cerveau adulte et la préparation aiguë de tranches de cerveau à partir d'animaux adultes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse adulte, telles que la perte fonctionnelle des nouveaux neurones dans le cerveau adulte. Préparez l'injection virale en sortant le rétrovirus codant pour la protéine fluorescente verte GFP ou la protéine fluorescente rouge D tomate du congélateur et en le décongelant sur de la glace. Décongelez.Deux microlitres de rétrovirus par animal permettent d'anesthésier une souris femelle âgée de quatre à six semaines. Vérifiez l'anesthésie en pinçant le pied, fixez la souris sur un cadre stéréotaxique, rasez les poils de la tête et essuyez la peau avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez un scalpel pour inciser la peau et exposer le crâne.Ajuster la position du nez de la souris de manière à ce que bgma et lambda se trouvent dans le même plan horizontal à l’aide d’un foret dentaire muni d’un foret de 0,6 millimètre. Percez quatre trous à travers le crâne aux coordonnées indiquées ici. Remplir rapidement une seringue Hamilton de un microlitre à embout plat avec le rétrovirus décongelé.Positionnez-le au-dessus de l'un des trous créés à moins deux millimètres bgma pour injecter le rétrovirus dans le gyrus denté. Abaissez la seringue à une profondeur verticale de 2,5 millimètres. Injectez 0,5 microlitre de rétrovirus à un débit de 0,25 microlitre par minute afin d'éviter tout reflux de liquide.Attendre deux minutes après chaque injection avant de retirer lentement la seringue. Rincer brièvement la surface externe de l'extrémité de la seringue avec du PBS stérile et un applicateur pour éliminer les traces de sang. Utiliser la même procédure pour injecter 0,5 microlitres de rétrovirus dans les trois autres sites à des profondeurs ventrales de 2,5 ou 3,2 millimètres.Fermez la plaie avec un matériau de suture chirurgicale stérile et remettez l'animal dans son logement jusqu'à ce que les neurones nouvellement formés atteignent le stade de maturité souhaité. Après un délai de 21 jours, préparez-vous à découper le cerveau de la souris en préparant les solutions nécessaires. Refroidissez la solution de coupe sur de la glace à une température de zéro à quatre degrés Celsius et faites-la barboter avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 30 minutes.Placer le liquide céphalorachidien artificiel ou LCR à température ambiante et le saturer avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 30 minutes. Après 30 minutes sur de la glace, préparer la solution de coupe saturée en oxygène, appelée glace, pour la perfusion cardiaque. Après anesthésie de la souris, effectuer la perfusion cardiaque.Ensuite, retirez rapidement le cerveau et placez-le dans une boîte de Pétri contenant une solution de coupe ainsi qu'un morceau de papier filtre dans la boîte de Pétri. Retirez le cervelet, puis effectuez une coupe coronale à un ou deux millimètres en avant des sites d'injection afin d'obtenir une surface plane. Pour le montage super.Collez le cerveau sur une plateforme de vibram. Montez la plateforme dans la chambre de coupe du vibram remplie de solution de coupe oxygénée. Abaissez la lame et réglez la fenêtre de coupe sur le Vibram.Commencez à découper le tissu. Coupez chaque tranche en deux moitiés le long de la ligne médiane. Utilisez une pipette à large orifice pour transférer ces tranches dans une chambre d'incubation contenant de l'air ambiant.Température A LCR bullé avec 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Poursuivre la section jusqu'à ce que l'extrémité antérieure de l'hippocampe soit visible. Incuber les tranches en les maintenant constamment bullées dans un bain d'eau à 32 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes.Replacer la chambre d'incubation à la température du bord pendant toute la durée de l'enregistrement. Les tranches sont désormais prêtes pour l'enregistrement. Commencer par perfuser la chambre d'enregistrement avec un A CSF saturé en oxygène à 32 à 34 degrés Celsius à un débit d'environ deux millilitres par minute.Utilisez un support en forme de porc de grande taille pour transférer une coupe dans la chambre d'enregistrement. Placez un fil de platine en forme de U, muni de fils de nylon, au-dessus de la coupe afin de la maintenir en place sous faible grossissement. Identifiez la couche moléculaire du gyrus denté.Abaissez ensuite l'électrode de stimulation dans la couche moléculaire du gyrus denté. En fort grossissement, identifiez les cellules granulaires dentées nouvelles nées dans la zone sous-granulaire ou la couche granulaire par l'expression de la protéine fluorescente verte ou rouge marquée.Localisez les neurones nouvellement formés exprimant la GFP ou le D tomate en alternant entre les filtres CIDI et fluorescents. Sélectionnez une cellule présentant une fluorescence relativement intense et un corps cellulaire sain pour l’enregistrement en configuration whole cell (enregistrement en mode cellule entière). Insérez une micropipette en verre, dont la résistance du bout est de trois à six mégohms et remplie de la solution interne appropriée, dans un support de micropipette fixé sur le porte-électrode de l'amplificateur, sous l'objectif à fort grossissement du microscope.Abaisser la micropipette à l’aide d’un micromanipulateur jusqu’à la cellule granulaire dentée sélectionnée et former un patch en configuration tout-cellule. Injecter une série de courants en mode « clampage de courant » et enregistrer les propriétés de décharge du neurone néoformé. Appliquer une impulsion unique ou des impulsions jumelées électriquement via l’électrode de stimulation et enregistrer les courants post-synaptiques évoqués.S'il n'y a pas de réponse post-synaptique, déplacez l'électrode de stimulation vers une autre position dans la couche moléculaire et essayez d'enregistrer les courants post-synaptiques évoqués à partir du nouveau site de stimulation. Après avoir terminé l'expérience, utilisez l'ajustement en mode « clamp » pour mesurer l'amplitude des réponses post-synaptiques évoquées provenant des neurones néophytes. Cette figure montre l'expression de la GFP dans les neurones néophytes du gyrus dentelé d'une souris adulte 21 jours après l'injection de rétrovirus GFP.Remarquez que les neurones nouvellement formés sont facilement visibles et que les dendrites ainsi que les axones sont fortement marqués. Les dendrites sont les prolongements qui s'étendent du soma vers la couche moléculaire du gyrus dentelé, et les axones sont également visibles dans les hiles et la région CA3. Cette figure montre des enregistrements en mode courant constant sur cellule entière d'un nouveau neurone granulaire du gyrus dentelé, réalisés 21 jours après l'injection de rétrovirus P-U-X-G-F-P chez une souris adulte.La trace supérieure montre des potentiels d'action provoqués par une injection de courant. Cette figure montre les courants post-synaptiques provoqués dans une cellule granulaire dentée de nouveau-né 21 jours après l'injection du virus. En stimulant la couche moléculaire.L'existence de la réponse post-synaptique montre que le neurone nouveau-né s'est déjà intégré aux circuits neuronaux existants et reçoit des entrées synaptiques de la part de neurones de différentes origines après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurogenèse adulte pour explorer l'intégration fonctionnelle des neurones nouveaux-nés dans le cerveau adulte.

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