Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l'échelle nanolitres sur l'IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

L’objectif global de cette procédure est de profiler l’expression des micro-ARN de manière efficace, peu coûteuse et avec un minimum de matériel de départ en combinant le R-T-P-C-R quantitatif multiplex avec une plateforme microfluidique. Cela commence par la concentration de l’ARN extrait, suivie d’une transcription inverse multiplex et d’une préamplification multiplexe. L’étape suivante consiste à purifier les amorces excessives.

Enfin, l’expression d’un micro-ARN singleplex est profilée à l’aide d’une plateforme microfluidique. Le résultat est des niveaux d’expression de micro-ARN précis et hautement reproductibles dans les échantillons d’intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que l’étape de purification supplémentaire après amplification pré-EMP améliore la précision et la reproductibilité de la méthode multiplex Q-R-T-P-C-R.

Commencez par l’ARN qui a été extrait du sérum. À l’aide d’un kit de purification d’ARN ou d’une méthode d’ARN à base de phénol chloroforme à partir de tissus homogénéisés comme le triol, toutes les extractions doivent être suivies d’une étape de lavage et tout le stockage se fait à moins 80 degrés Celsius. Concentrez la solution d’ARN.

Si vous commencez avec une quantité limitée d’échantillon, par exemple à partir du sérum en premier, insérez un réservoir d’échantillon MicroCon dans un flacon, puis pipetez la solution d’ARN dans le réservoir, en faisant très attention à ne pas toucher la membrane avec la pointe de la pipette. Positionnez maintenant le flacon et le filtre dans la centrifugeuse avec la bande de fissure vers le rotor et faites fonctionner la centrifugation pendant environ trois heures. Après trois heures, l’ARN sera entièrement concentré sur la membrane pour éluer l’ARN.

Ajoutez la quantité souhaitée d’eau libre d’ARN dans la membrane, retournez le réservoir et placez-le dans un nouveau flacon. Ensuite, tournez pendant trois minutes à quatre degrés Celsius avec un maximum de 3000 fois G.Store l’ARN concentré à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire Après avoir effectué une réaction RT sur l’ARN à l’aide d’amorces de boucle de tige inverse xpl, suivie de 12 à 18 cycles de PCR. Les microARN sont représentés par des brins CD NA.

C’est ce qu’on appelle le produit pré-PCR. En référence au prochain QPCR. Le produit pré-PCR doit être purifié sur un gel de polyacrylamide à 10 % accompagné d’une charge échelle d’ADN appariée à 10 bases chaque voie avec 5,5 microlitres de six x G orange combinés à 27,5 microlitres de produit pré-PCR.

Faites fonctionner le gel à 150 volts pendant 55 à 60 minutes. Le bleu phénol Romo fonctionne sur ce gel dans la région de la paire de 20 bases. Une fois que le gel a coulé, colorez-le avec du cyber gold pendant 25 minutes, sans l’exposer à la lumière et sur un shaker à partir du gel coloré.

Découpez la bande de produit pré-PCR de 60 à 80 paires de bases et transférez le bloc de gel dans des tubes étiquetés. Si la concentration du produit est faible, il se peut qu’il ne soit pas visible, mais qu’il soit toujours dans le gel. Écrasez maintenant la bande de gel à l’aide de la centrifugation tube dans tube et ajoutez 300 microlitres de tampon TEN.

Incuber le mélange de gel tampon pendant quatre heures à 37 degrés Celsius avec agitation. Après quatre heures, transférez le liquide dans un nouveau tube et ajoutez 300 microlitres supplémentaires de tampon TEN. Incuber ce mélange pendant la nuit à quatre degrés Celsius en agitant.

Le lendemain, transférez à nouveau le contenu du tube et procédez à une précipitation à l’éthanol du produit pré PCR. Lorsqu’une puce est ouverte de son emballage, elle doit être amorcée dans les 24 heures, puis chargée dans les 60 minutes suivant l’amorçage. Commencez à amorcer le réseau en injectant 150 microlitres de liquide de ligne de contrôle dans chacun des accumulateurs de la puce.

Veillez à ne pas renverser de liquide sur la puce ou les entrées, sinon la puce deviendra inutilisable. Placez ensuite la puce dans le circuit fluidique intégré ou le contrôleur IFC et exécutez le script d’amorçage du contrôleur. Dès que le programme commence, commencez à préparer les échantillons.

Commencez par préparer le pré-échantillon Mélangez une combinaison de tack man, de master mix universel et de réactifs de chargement. Ensuite, en utilisant le format de chargement à 96 puits, combinez 2,25 microlitres de chaque échantillon avec 2,75 microlitres de mélange d’échantillons pour collecter le fluide chargé. Vortex brièvement et centrifugez rapidement la plaque à quatre degrés Celsius.

La plaque d’échantillonnage est maintenant préparée. Utilisez maintenant une nouvelle plaque à 96 puits pour préparer 13 x les concentrations du mélange de dosage. Cela se fait en mélangeant une amorce universelle, une amorce avant et une sonde tac man spécifique au gène par puits.

Les concentrations d’un X sont d’une micromolaire pour l’amorce universelle et l’amorce directe et de 0,2 micromolaire pour la sonde tac man. Ajoutez ensuite suffisamment de tween pour obtenir une concentration finale de 0,25 % tween dans un volume de puits final de cinq microlitres. Mélangez bien en évitant les bulles et tournez brièvement la plaque pour recueillir le liquide.

Il s’agit de la plaque d’essai. Commencez le 96.96 Q-R-T-P-C-R en chargeant la puce. Chargez d’abord les échantillons, puis les dosages avec le volume final de cinq microlitres par entrée dans l’IFC.

Deuxièmement, exécutez le script de mélange de chargement pour charger les échantillons et les tests dans la puce. Une fois le script terminé, décollez le film protecteur de la puce chargée et retirez toutes les particules de poussière ou débris de la surface de la puce à l’aide de ruban adhésif. Configurez maintenant le programme d’amplification du système bio.

Chargez la puce dans le système et exécutez le programme. Les résultats peuvent être analysés à l’aide d’un logiciel de calcul de centimes de fluide pour fournir des courbes d’amplification, des cartes thermiques de puces entières et des valeurs CT pour chacune. Bien en utilisant des produits pré PCR, purifiés par séparation granulométrique sur des gels de poly acrylamide natifs, de type sauvage DG CR huit et ER null mutant.

L’ARN a été préparé par rapport aux protocoles précédents. Grâce à l’étape de purification, il y a plus de microARN et une perte de signaux faussement positifs dans les arrière-plans nuls DGCR huit et RE. De plus, l’approche modifiée QR TPCR R permet la catégorisation correcte des petits ARN rares D gcr à huit dés indépendants.

Ici, 48 cérames de patients et de témoins ont été dépistées pour le changement d’expression de 384 microARN différents. Les données ont été normalisées pour chaque échantillon en soustrayant la médiane correspondante et sans utiliser de pic dans les témoins. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont le multiplex Q-R-T-P-C-R sur une plateforme de ligne antigrippale peut être utilisé pour profiler simultanément des centaines de micronases sur de nombreux échantillons, même en commençant avec une entrée très limitée, l’ARN.