Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l'hippocampe de culture

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la mobilité de la protéine de fluorescence verte améliorée en mesurant le frap de la protéine dans une région d’intérêt. Ceci est accompli en transectant d’abord le vecteur EGFP dans les neurones de l’hippocampe de rat en culture. L’enregistrement de Fre est effectué dans une colonne vertébrale d’intérêt à l’aide d’un microscope confocal Zeiss seven 10.

Le taux de photoblanchiment peut ensuite être calculé à l’aide des logiciels Image J et GraphPad Prism. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la mobilité de l’EGFP dans une colonne vertébrale à partir d’un neurone hippocampique en culture grâce à la microscopie confocale. Ce protocole a été développé par Chazen en collaboration avec moi-même, Ronald Pet, ainsi que Ya, Wang Bahar Kisha, et l’auteur principal de l’article original, Robert Ol, décédé en octobre 2009.

Nous dédions cette vidéo à sa mémoire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dynamique des protéines, telles que le taux de renouvellement d’une protéine d’intérêt dans une région d’intérêt. Commencez cette procédure en cultivant des neurones hippocampiques embryonnaires de rat du jour 18 sur des plats à fond de verre mattec de 35 millimètres recouverts de poly de lysine sur des neurones transfecteurs in vitro de 16 à 18 jours à l’aide du kit de transfection de mammifères Cal Foss de technologie de clonage avant de commencer la transfection.

Conservez le milieu de culture d’origine dans un tube stérile de 15 millilitres pour une utilisation ultérieure. Remplissez chaque plat de 35 millimètres avec 1,5 millilitre de milieu aigle modifié de DOL eco 30 minutes avant la transfection. Ensuite, combinez 10 microgrammes d’ADN plasmatique P-E-G-F-P-N avec 12,4 microlitres de solution calcique à deux molaires et portez le volume total à 100 microlitres avec de l’eau stérile.

Ajoutez le mélange d’ADN DROPWISE à 100 microlitres de solution saline tamponnée en deux tas. Vortex du tampon après chaque chute est ajouté. Après avoir laissé le mélange final reposer à température ambiante pendant 20 minutes, ajoutez la solution tampon d’ADN aux neurones incubés par DMEM.

Incuber les neurones à 37 degrés Celsius pendant une heure à une heure et demie. Après l’incubation, retirez le milieu contenant du phosphate de calcium des plats de culture et lavez les cellules avec du DMEM. Répéter le lavage DMEM trois fois au total.

Remplacez le milieu DMEM par le milieu de culture d’origine avant de le remettre dans l’incubateur. Les neurones sont utilisés pour l’expérience de fracturation hydraulique deux à quatre jours après la transfection. Pour commencer, remplacez immédiatement le milieu de culture dans la parabole à fond en verre de 35 millimètres par la solution Prewarm Tyro.

Un microscope confocal Zeiss LSM seven 10 est utilisé pour l’expérience de fracturation. Le système de module de température Zeiss maintient la température, l’humidité et le pourcentage de dioxyde de carbone du système de travail. Assurez-vous que le réservoir de dioxyde de carbone est connecté et que la bouteille d’eau, qui sert à équilibrer l’humidité, est remplie d’eau.

Une fois le microscope installé, trouvez une dendrite mature transfectée avec l’objectif 100x. Si les cellules transfectées dans la parabole sont clairsemées, recherchez la cellule souhaitée avec l’objectif 40x. Passez ensuite à l’objectif 100 x.

Pour capturer des images, utilisez un zoom optique cinq x et une résolution de 2 56 x 2 56 pixels. Pour imager un court morceau de dendrite avec plusieurs épines. Pour capturer des images, utilisez la vitesse nominale neuf, qui prend 0,5 seconde.

Pour terminer un scan, réglez le sténopé sur deux micromètres pour obtenir une forte fluorescence. Lorsque vous prenez des images, essayez d’utiliser une faible transmission laser, par exemple, de 1 à 5 % pour éviter de photoblanchir l’ensemble de l’image. Ensuite, sélectionnez la colonne vertébrale qui vous intéresse pour cette expérience.

Des épines de champignon avec des diamètres de tête d’épine d’environ un micromètre sont choisies pour effectuer une expérience d’enveloppement. Prenez cinq images de contrôle avant le blanchiment, puis blanchissez la colonne vertébrale d’intérêt 10 fois à 100 % nominal. L’intervalle de temps doit être ajusté en fonction des différentes protéines de ciblage et des différents plans expérimentaux.

Pour cette expérience, des images sont capturées toutes les secondes pendant 15 secondes après le blanchiment. Ensuite, enregistrez les images pour analyser les données. Ouvrez les images avec le logiciel Image J : alignez la pile d’images à l’aide de l’outil aligné de sorte que la colonne vertébrale d’intérêt ne flotte pas et reste dans la même position.

Sur l’image, mesurez l’intensité relative de fluorescence de la colonne vertébrale d’intérêt, qui est une région transfectée mais non blanchie. Mesurez la région d’arrière-plan dans les images en accéléré avec l’outil de surveillance de l’intensité en fonction du temps de l’image J.Utilisez une région non fluorescente comme courbe de la région d’arrière-plan ajustez l’intensité fluorescente avec une équation exponentielle monophasée dans le logiciel GraphPad Prism ou un autre logiciel similaire. Enfin, calculez le pourcentage de fluorescence mobile et immobile. Montré.

Voici les mesures de fracturation de la fluorescence de l’EGFP dans une colonne vertébrale à partir d’un neurone hippocampique en culture. La région du contrôle de la colonne vertébrale et de l’arrière-plan est marquée, et la pointe de flèche rouge indique le moment du blanchiment de la photo. Des photographies de la même zone ont été prises avant et à 0, 1, 5, 10 et 15 secondes après le blanchiment des photos.

Les courbes FRA de fluorescence EGFP sont affichées sur une période de 15 secondes, les points sur les courbes représentant la FRA à chaque seconde. Les courbes ont été ajustées par des équations exponentielles d’une phase. La fluorescence moyenne avant photoblanchiment a été comptée à 100 %Dans cette expérience, la fraction mobile est de 87 % et la fraction immobile est de 13 %A.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la mobilité d’une protéine marquée à la GFP en utilisant la technique FRAPPE.