Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

L’objectif de l’expérience suivante est d’observer le développement in vivo de cellules progénitrices neurales individuelles du cerveau antérieur grâce à l’imagerie en direct d’embryons de poisson-zèbre. Ceci est réalisé par électroporation de constructions d’ADN codant pour des marqueurs fluorescents qui marquent quatre cellules progénitrices neurales cérébrales peu positionnées. Les embryons électroporés sont anesthésiés, montés à bas point de fusion et imagés par microscopie confocale time-lapse.

Les résultats montrent le développement in vivo d’une cellule progénitrice neurale particulière du cerveau antérieur. Cette méthode peut donner un aperçu du développement in vivo de cellules neuroprogènes foïnes. Il peut également être appliqué à d’autres régions du système nerveux central telles que la membrane, l’hélène et la moelle épinière.

Le principal avantage de cette méthode ou des méthodes existantes, telles que l’injection d’ADN ou d’ARN au stade d’une seule cellule, est qu’elle cible précisément l’intérêt personnel à un moment donné du développement. Ce protocole commence la veille de l’électroporation prévue. Le matin, collectez 50 embryons fécondés de poissons-zèbres accouplés, baignez les embryons dans un milieu embryonnaire contenant du phénylthrée ou du PTU, incubez les embryons immergés pendant 22 heures à 28,5 degrés Celsius le lendemain.

22 heures après la fécondation, les embryons sont prêts à être électroporés. Commencez par enrober les embryons manuellement avec des pinces fines. Transférez les embryons enrobés dans 10 millilitres de solution d’électroporation contenant du PTU, puis anesthésiez les embryons.

À 420 microlitres de stock Trica à une concentration de quatre milligrammes par millilitre dans la solution. Les embryons sont maintenant prêts pour l’électroporation afin de préparer les aiguilles d’injection nécessaires à l’électroporation. Les capillaires en verre sont tirés et leurs extrémités sont brisées à l’aide d’une pince pour obtenir un point de fusion bas de 0,2.

Des solutions agricoles sont également nécessaires, qui comprennent une solution à 1 % en suspension dans des bagues d’électroporation et une solution à 0,8 % dans un milieu embryonnaire pour le montage. Aliquotez les deux différentes solutions agricoles dans deux microtubes de centrifugation d’un millilitre et maintenez-les prêts dans un bloc de chaleur à environ 37 degrés Celsius. Ce protocole utilise le système GAL four UAS pour piloter l’expression des gènes dans les cellules progénitrices neurales.

Deux plasmides sont utilisés lorsqu’ils expriment de manière ubiquitaire GAL quatre ff et l’autre exprime GFP en réponse à GAL quatre ff. Les deux plasmides sont préparés par des kits pour utiliser le préparé, concentrez-les entre un et deux microgrammes par microlitre en utilisant une précipitation d’éthanol d’acétate de sodium dans une solution de 10 millimolaires Tri cl. Après avoir déterminé la concentration du plasmide, diluez les deux plasmides en une seule solution avec de l’eau sans nucléases à 500 nanogrammes par microlitre.

À cette concentration, ils seront évalués ensemble pour visualiser l’administration de la solution, la colorer avec du rouge de phénol à 10 % du volume total de la solution. La solution est maintenant prête pour l’électroporation et doit être placée sur de la glace. Le banc d’électroporation se compose d’un microscope à stéréodissection avec un grossissement maximal de 50 x.

Le banc est équipé d’un injecteur de pression d’air, de deux manipulateurs microm et d’un stimulateur électrique. L’électrode sur le micromanipulateur gauche a des électrodes bipolaires parallèles en platine et iridium personnalisées juste avant l’électroporation, chargez l’aiguille d’injection avec deux microlitres de solution d’ADN et ajustez le volume d’injection à quatre nanolitres. À partir de ce moment, le protocole nécessite de la pratique pour être perfectionné pour le montage, l’immersion et le retrait immédiat de deux embryons de la solution agricole à 1 % de point de fusion bas.

À l’aide d’une pipette en verre, transférez chacun dans sa propre gouttelette d’agros sur la plate-forme ou dans le plat dans la gouttelette. Utilisez une sonde à fibres pour orienter doucement les embryons en position dorsale vers le haut avant que l’agro ne se solidifie. Cela rendra le cerveau antérieur accessible à la fois aux électrodes et à l’aiguille de micro-injection.

Répétez ce processus jusqu’à ce que les 10 gouttelettes soient chargées avec tous les embryons préparés. Insérez les électrodes dans l’aéros et insérez l’aiguille de micro-injection dans le ventricule du cerveau antérieur. Injectez maintenant quatre nanolitres de mélange d’ADN.

Remarquez le flux et surveillez l’enflure du ventricule. Dès que l’enflure est observée, appliquez deux des 4 impulsions de 27 0,5 volts d’une milliseconde chacune. Ces quatre impulsions doivent être délivrées en polarité opposée.

Le résultat est un marquage en mosaïque bilatérale des quatre cellules progénitrices neurales du cerveau. Retirez maintenant l’aiguille d’injection du cerveau antérieur et déplacez le stade vers l’embryon suivant. Répétez le processus d’injection et d’électroporation sur chaque embryon restant.

Une fois que les 10 embryons ont été électroporés, versez cinq millilitres de milieu embryonnaire sur les embryons pour transférer les embryons. Épluchez les aros avec un couteau microchirurgical et déplacez-les dans un plat frais contenant 30 millilitres de milieu embryonnaire. Avant l’imagerie, incubez les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant environ quatre heures, quatre heures après l’électroporation.

Le signal EGFP est observable. S’ils sont observés au microscope de dissection épifluorescente dans l’heure ou les cinq heures suivant l’électroporation, sélectionnez les embryons présentant une forte expression de l’EGFP en mosaïque mais forte dans la région des quatre cerveaux. Transférez les embryons sélectionnés dans 10 millilitres de milieu et anesthésiez-les avec un ajout de 420 microlitres de stock de trica à une concentration de quatre milligrammes par millilitre.

L’imagerie sera réalisée sur la platine à température contrôlée d’un microscope confocal, équipé d’objectifs verticaux. Préparez la lunette en réglant la température de la scène à 28,5 degrés Celsius. Préchauffez également le milieu embryonnaire à 28,5 degrés Celsius.

Pour monter un embryon, utilisez une pipette en verre pour l’immerger brièvement dans des aros et placez-le au centre d’une boîte de culture à fond de verre de 35 millimètres. À l’aide d’une sonde à fibres, orientez doucement les embryons en position dorsale vers le haut avant que l’agro ne se solidifie et couvrez-les de trois millilitres de milieu préchauffé. L’embryon est maintenant prêt pour l’imagerie en direct à intervalle fixe avec un objectif de trempage dans l’eau. Voici des images confocales en accéléré d’une cellule progénitrice neurale.

En utilisant cette méthode, nous pouvons observer cette cellule migrer et se diviser deux fois entre 28,5 et 41,5 heures après la fécondation. En minimisant la puissance du laser et en reconstituant l’embryon, les images multimédias peuvent continuer à être prises jusqu’à 60 heures après la fécondation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une électroporation sur des cellules neuroprogéniques génétiquement marquées et vidéo et de la façon de manipuler les embryons d’électrodes.

Pour l’imagerie confocale de niveau TimeLapse, une fois maître, cette électroporation peut être réalisée en moins d’une heure si elle est réalisée correctement.