Name: Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Découvrez l'imagerie time-lapse en direct des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur chez Danio rerio. Cette méthode combine électroporation et microscopie confocale pour analyser le développement clonal in vivo.

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Ce travail a été soutenu par theNIH grantNS042626. Nous remercions Thorn Kurt et UCSF Nikon Imaging Centre d&#39;aide à l&#39;imagerie.

1. Préparation des embryons de poissons zèbres <ol><li> Deux jours avant l'électroporation, mis en place des cages d'accouplement des poissons de type sauvage en utilisant des diviseurs d'hommes séparés des femelles. </li><li> Un jour avant l'électroporation, tirez les diviseurs de l'accouplement des cages de la journée précédente. </li><li> Recueillir des embryons et incuber 50 embryons fécondés in 30 ml de milieu contenant embryonnaire phénylthiourée 0,003% (PTU) à 28,5 ° C. </li><li> Le jour de l'électroporation, les embryons dechorionate manuellement avec une pince fine (Inox 5, Dumont électronique, Suisse) où les embryons atteignent le stade de développement 22hpf. Puis transfert des embryons à 3 10ml électroporation Ringer (180 mM de NaCl, KCl 5 mM, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM pH Hepes 7,2) contenant 0,003% PTU. </li><li> Ajouter 420 ul tricaïne stock (4mg/ml) à l'électroporation 10ml Ringer pour anesthésier les embryons. </li></ol> 2. Préparation pour l'électroporation <ol><li> Aiguilles d'injection de verre ont été retirés de capillaires (1,2 mm de diamètre extérieur, 0,9 mm ID, avec filament) sur un extracteur Flaming-Brown P897 (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). La pointe de l'aiguille a été rompu avec une pince pour obtenir une extrémité pointue, comme indiqué dans la figure 1D. Le diamètre de la pointe devrait être d'environ 10 pm et l'angle du cône doit être autour de 30 degrés. </li><li> Préparer 0,8% et 1% à bas point de fusion d'agarose (Shelton Scientific, Inc catalogue # IB70050) dans une solution de Ringer électroporation. Aliquoter la solution d'agarose à 2 ml microtubes. Gardez les aliquotes dans un bloc thermique à ~ 37 ° C. </li><li> Le système Gal4/UAS est utilisé pour piloter l'expression des gènes dans les cellules progénitrices neurales des embryons électroporé. Deux plasmides sont utilisés: le plasmide EF1α-GFF-PT2KXIG, dans lequel Gal4FF est entraîné par le promoteur ubiquitaire EF1α, et le plasmide SAMU-E1B-EGFP-PT2KXIG. </li><li> Préparez-EF1α GFF-PT2KXIG et UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG ADN plasmidique en utilisant GenEluteTM HP plasmidique Midiprep Kit (Sigma). </li><li> Les plasmides sont ensuite concentrées par acétate de sodium / éthanol précipitations à la concentration finale de 1-2 pg / pl dans 10 mM Tris · Cl (pH 8,5). </li><li> Mélanger les deux plasmides et diluer avec sans nucléase H2O à une concentration finale de 500 ng / ul pour chaque plasmide. Ajout de rouge de phénol (dilué 1 / 10 volume total) à la solution est préférée pour la visualisation de la livraison. Conserver la solution d'ADN sur la glace. </li><li> Juste avant l'électroporation, backloading l'aiguille d'injection avec 2 ul solution d'ADN et d'ajuster le volume d'injection à 2 nl. </li></ol> 3. L'électroporation <ol><li> Un microscope de dissection stero (Zeiss Stemi 2000 avec un grossissement maximal de 50x), une pression d'injection d'air (Narishige IM 300 microinjecteur), deux micromanipulateurs (WPI M3301R, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, USA), et un stimulateur électrique (SD9 carrés d'impulsion stimulateur, Herbe Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) sont mis en place comme dans la Figure 1A. </li><li> Pour monter les embryons, immerger deux embryons dans 1% à bas point de fusion d'agarose. Puis retirer immédiatement les embryons de l'agarose avec une pipette en verre. </li><li> Placer les embryons sur un couvercle de plastique inversé plat de Petri en gouttes individuelles d'agarose. Orienter les embryons doucement avec une sonde à fibre à une position dorsale-up avant l'agarose se solidifie pour que le prosencéphale est accessible à la fois les électrodes et l'aiguille de microinjection (figure 1B). Les embryons doivent être montés dans chaque agarose gouttes. </li><li> Manipuler les électrodes avec le micromanipulateur gauche. Insérer les électrodes dans l'agarose comme indiqué dans la figure 1B. Personnalisé en platine iridié électrodes bipolaires en parallèle 125 mm de diamètre et espacés de 500 um d'intervalle sont utilisés pour l'électroporation (FHC, catalogue # PBSA0575). </li><li> Insérez l'aiguille de microinjection dans le ventricule du cerveau antérieur et injecter mélange d'ADN 4NL, comme découlant de liquide rouge et le gonflement du ventricule peuvent être observés. </li><li> Immédiatement, une impulsion de 28,5 V à 1 milliseconde durables a été appliquée manuellement. Ensuite, on inverse la polarité et d'appliquer une plus 28,5 V impulsion de durée de 1 milliseconde. Cela se traduira par l'étiquetage de mosaïque de cellules du cerveau antérieur bilatérale du progénitrices neurales. </li><li> Après électroporation de 10 embryons, ajouter 5ml moyenne embryonnaires pour couvrir les embryons et le zeste de l'agarose avec un couteau de microchirurgie pour libérer les embryons. </li><li> Transfert des embryons électroporées à un plat frais de 30 ml de milieu embryonnaire contenant 0,003% et PTU incuber à 28,5 ° C. </li></ol> 4. Montage et imagerie time-lapse en direct <ol><li> Environ 4 heures après l'électroporation, le signal de l'EGFP est observable si vu sous un microscope à épifluorescence dissection. </li><li> Cinq heures après l'électroporation, sélectionner les embryons à la mosaïque, mais très forte expression de l'EGFP dans la région du cerveau antérieur. </li><li> Transfert des embryons sélectionnés pour 10ml embryonnaire milieu contenant PTU 0,003%. </li><li> Ajouter 420 ul tricaïne stock (4mg/ml) à l'embryon t 10ml moyenneso anesthésier les embryons. </li><li> Pour monter les embryons, immerger une embryon dans 0,8% d'agarose à faible point de fusion. Puis retirer immédiatement l'embryon de l'agarose avec une pipette en verre et le lieu de l'embryon au centre d'une boîte de culture à fond de verre 35mm (MatTek Corporation, partie # P35GC-1.5-10-C, <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-bas dishes.com</a> ) . </li><li> Orienter les embryons doucement avec une sonde à fibre à une position dorsale-up avant l'agarose se solidifie. </li><li> Placer le plat bien sur la scène à température contrôlée du microscope confocal, comme indiqué dans la figure 1C (Nous utilisons un microscope Nikon C1 spectrale confocale avec haut-droite objectifs). Réglez la température à 28,5 ° C. </li><li> Ajouter 3ml 28,5 ° C préchauffé moyenne embryonnaire contenant 0,003% PTU pour couvrir l'embryon. L'embryon est maintenant prêt pour l'imagerie. </li><li> Effectuer imagerie time-lapse vivre avec un intervalle fixe en utilisant un objectif de l'eau de trempage. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Montre la figure 2 sont sélectionnés les cadres d'une imagerie time-lapse direct confocale de l'embryon électroporées des EF1α-GFF + SAMU-E1B-EGFP à 22 HPF. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Appareillage set-up. (A) L'assemblée des équipements d'électroporation: l'herbe SD9 carrée pouls stimulateur (i), le micromanipulateur gauche (ii), les électrodes (iii), le Zeiss loupe binoculaire (iv), l'aiguille d'injection (v), le droit de micromanipulateur (vi) et l'IM 300 Narishige microinjecteur (vii). (B) La position relative des électrodes (i), le ventricule du cerveau antérieur (ii) et l'aiguille d'injection (iii). Notez la solution d'ADN de couleur rouge a été injecté dans le ventricule du cerveau antérieur. (C) L'Assemblée de l'imagerie en direct sur Nikon microscope confocal C1: le régulateur de température (i), l'eau plongeant objectif len (ii) et l'embryon électroporées intégré dans agarose bas point de fusion dans une boîte de culture à fond de verre (iii) (D ) Image tirée d'une aiguille et de coupe pour micro-injection d'ADN. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Cadres sélectionnés d'un 18-heures imagerie time-lapse direct confocale de l'embryon électroporation avec EF1α-GFF + SAMU-E1B-EGFP à 22 HPF. La surface du ventricule est sur le côté bas de chaque trame d'image. La barre d'échelle représente 10 um.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour imagerie time-lapse en direct de cellules progénitrices neurales au niveau clonal dans le prosencéphale poisson zèbre en développement. Nous avons testé et modifié les protocoles existants électroporation 4-6 pour génétiquement et par fluorescence étiquette individuelle des cellules progénitrices neurales. Un arbre lignée composée de cellules par clonage progéniture connexes peuvent être mis en place depuis seulement quelques cellules ont été marqués avec un ...

imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement zebrafish

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Schémas précis de la division, la migration et la différenciation des cellules progénitrices neurales sont cruciales pour le développement du cerveau et 1,2 fonction. Pour comprendre le comportement des cellules progénitrices neurales dans le complexe dans un environnement in vivo, imagerie time-lapse en direct de cellules progénitrices neurales dans un cerveau intact est absolument nécessaire. Dans cette vidéo, nous exploitons les caractéristiques uniques des embryons de poisson zèbre pour visualiser le développement des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur in vivo. Nous utilisons d&#39;électroporation génétiquement et peu d&#39;étiquettes individuelles cellules progénitrices neurales. En bref, des constructions d&#39;ADN codant pour des marqueurs fluorescents ont été injectées dans le ventricule du cerveau antérieur de 22 heures après fécondation (HPF) et les embryons de poissons zèbres impulsions électriques ont été livrés immédiatement. Six heures plus tard, les embryons de poissons zèbres électroporées ont été montés avec bas point de fusion de verre dans des plats d&#39;agarose culture sur le fond. Marqués par fluorescence des cellules progénitrices neurales ont ensuite été imagés pour les 36 heures avec des intervalles fixes sous un microscope confocal à l&#39;aide d&#39;eau plongeant objectif. La méthode actuelle fournit un moyen d&#39;avoir un aperçu dans le développement in vivo des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur et peut être appliquée à d&#39;autres parties du système nerveux central de l&#39;embryon de poisson zèbre.

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l&#39;électroporation et la microscopie confocale pour l&#39;imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.<em&gt; In vivo</em&gt; L&#39;analyse du développement des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur à un niveau clonal peut être réalisé de cette façon.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Des schémas précis de division, de migration et de différenciation des cellules progénitrices neurales sont cruciaux pour le développement et le fonctionnement appropriés du cerveau1,2. Pour ...

L'objectif de l'expérience suivante est d'observer le développement in vivo de cellules progénitrices neuronales individuelles du prosencéphale par imagerie vivante en laps de temps de embryons de poisson zèbre. Ceci est réalisé par électroporation de constructions d'ADN codant pour des marqueurs fluorescents qui étiquettent de manière éparse quatre cellules progénitrices neuronales cérébrales. Les embryons électroporés sont anesthésiés, montés dans de l'agarose à bas point de fusion et observés par microscopie confocale en laps de temps.Les résultats montrent le développement in vivo d'un type particulier de cellule progénitrice neuronale du prosencéphale. Cette méthode peut fournir des informations sur le développement in vivo des cellules neuroprogénitrices du cerveau. Elle peut également être appliquée à d'autres régions du système nerveux central telles que la membrane, le cerveau et la moelle épinière.L'avantage principal de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que l'injection d'ADN ou d'ARN au stade de cellule unique, est qu'elle cible précisément l'intérêt propre à tout moment donné du développement. Ce protocole commence le jour précédant l'électroporation prévue. Le matin, récupérez 50 embryons fécondés provenant de poissons zèbres accouplés, placez les embryons dans un milieu embryonnaire contenant de la phénylthréa ou du PTU, puis incubez les embryons immergés pendant 22 heures à 28,5 degrés Celsius le jour suivant.À 22 heures post-fécondation, les embryons sont prêts à être électroporés. Commencez par enduire manuellement les embryons à l’aide de pinces fines. Transférez les embryons enduits dans 10 millilitres de solution de Ringer pour électroporation contenant du PTU, puis anesthésiez les embryons.Ajouter 420 microlitres de stock de Trica à une concentration de quatre milligrammes par millilitre à la solution. Les embryons sont maintenant prêts pour l'électroporation. Préparer les aiguilles d'injection nécessaires pour l'électroporation. Des capillaires en verre sont étirés et leurs extrémités sont cassées à l’aide de pinces afin d’obtenir une pointe fine de 0,2 point de fusion bas. Des solutions agro sont également nécessaires, comprenant une suspension à 1 % dans du sérum physiologique pour électroporation et une solution à 0,8 % dans un milieu embryonnaire pour le montage. Répartir les deux solutions agro différentes en aliquotes dans des tubes microcentrifugeurs de deux millilitres et les maintenir prêtes dans un bloc chauffant à environ 37 degrés Celsius. Ce protocole utilise le système GAL4-UAS pour induire l'expression génique dans les cellules souches neuronales.Deux plasmides sont utilisés : l'un exprime de manière ubiquitaire GAL quatre ff, et l'autre exprime GFP en réponse à GAL quatre ff. Les deux plasmides sont préparés à l'aide de kits, puis concentrés entre un et deux microgrammes par microlitre à l'aide d'une précipitation à l'éthanol en présence d'acétate de sodium, dans une solution de Tri cl à 10 millimolaire. Après détermination de la concentration en plasmide, diluez les deux plasmides dans une solution unique d'eau sans nucléase à 500 nanogrammes par microlitre.À cette concentration, ils seront évalués ensemble afin de visualiser l'administration de la solution, puis colorés au rouge de phénol à 10 % du volume total de la solution. La solution est désormais prête pour l'électroporation et doit être placée sur de la glace. Le dispositif d'électroporation est constitué d'un microscope stéréo de dissection avec un grossissement maximal de 50 x.Le dispositif est équipé d'un injecteur à pression d'air, de deux micromanipulateurs et d'un stimulateur électrique. L'électrode située sur le micromanipulateur gauche possède des électrodes bipolaires parallèles en platine-iridium sur mesure. Juste avant l'électroporation, rechargez l'aiguille d'injection avec deux microlitres de solution d'ADN et réglez le volume d'injection à quatre nanolitres. À partir de ce moment, le protocole exige de la pratique pour maîtriser parfaitement le montage : immergez et retirez immédiatement deux embryons de la solution d'agarose à 1 % à point de fusion bas. À l’aide d’une pipette en verre, transférez chacun dans une goutte séparée d’agros sur la plateforme ou dans la coupelle, en goutte. Utilisez une sonde en fibre pour orienter délicatement les embryons en position dorsale vers le haut avant que l’agros ne durcisse. Cela rendra le prosencéphale accessible à la fois aux électrodes et à l’aiguille de microinjection.Répétez ce processus jusqu'à ce que les 10 gouttelettes contiennent tous les embryons préparés. Insérez les électrodes dans l'aéros et introduisez l'aiguille de microinjection dans le ventricule antérieur. Injectez maintenant quatre nanolitres du mélange d'ADN.Observez le flux et surveillez le gonflement du ventricule. Dès que le gonflement est observé, appliquez deux séries de quatre impulsions de 0,5 volt, durant chacune un milliseconde. Ces quatre impulsions doivent être délivrées en polarité opposée.Le résultat est une étiquetage mosaïque bilatéral des quatre cellules progénitrices neuronales du cerveau. Retirez maintenant l'aiguille d'injection du cerveau antérieur et déplacez la platine vers l'embryon suivant. Répétez les étapes d'injection et d'électroporation sur chaque embryon restant.Une fois que les 10 embryons ont été électroporés, versez cinq millilitres de milieu embryonnaire sur les embryons pour les transférer. Retirez les aros à l’aide d’un couteau microchirurgical et placez-les dans une nouvelle boîte contenant 30 millilitres de milieu embryonnaire. Avant l’imagerie, incubez les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant environ quatre heures, soit quatre heures après l’électroporation.Le signal EGFP est observable. Si l'observation a lieu sous un microscope stéréofluorescent épi en lumière réfléchie une heure ou cinq heures après l'électroporation, sélectionner les embryons présentant une expression fortement mosaique mais intense de l'EGFP dans la région des quatre cerveaux. Transférer les embryons sélectionnés dans 10 millilitres de milieu et les anesthésier en ajoutant 420 microlitres de solution mère de trica à une concentration de quatre milligrammes par millilitre.L’imagerie sera réalisée sur la platine contrôlée en température d’un microscope confocal équipé d’objectifs droits. Préparer le microscope en réglant la température de la platine à 28,5 degrés Celsius. Préchauffer également le milieu embryonnaire à 28,5 degrés Celsius.Pour monter un embryon, utilisez une pipette en verre pour l'immerger brièvement dans de l'agaroïde et placez-le au centre d'une boîte de culture de 35 millimètres à fond en verre. À l'aide d'une sonde en fibre, orientez délicatement les embryons en position dorsale supérieure avant que l'agaroïde ne durcisse, puis recouvrez-les de trois millilitres de milieu préchauffé. L'embryon est désormais prêt pour une imagerie en temps réel à intervalles fixes à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau. Ci-dessous figurent des images au microscope confocal en temps réel d'une cellule progénitrice neuronale.Grâce à cette méthode, nous pouvons observer cette cellule migrer et se diviser deux fois entre 28,5 et 41,5 heures après la fécondation. En minimisant la puissance du laser et en renouvelant le milieu de l'embryon, des images peuvent être acquises pendant jusqu'à 60 heures après la fécondation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une électroporation sur des cellules neurogéniques génétiquement marquées et filmées, ainsi que la manière de manipuler les embryons munis d'électrodes.Pour l'imagerie de niveau TimeLapse en microscopie confocale, une fois maîtrisée, cette électroporation peut être réalisée en moins d'une heure si elle est effectuée correctement.

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Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

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