Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l'hippocampe sur des durées longues

L'objectif général de cette procédure est de visualiser le transport mitochondrial dans des neurones en culture pendant de longues durées à l'aide de la microscopie à fluorescence en temps réel. Cela est réalisé en marquant d'abord les mitochondries dans des neurones en culture à l'aide d'une protéine fluorescente ciblant un organite. La deuxième étape de la procédure consiste à acquérir des images du transport mitochondrial dans des conditions de contrôle.

La troisième étape de la procédure consiste à acquérir des séries d'images en laps de temps du transport mitochondrial après l'administration aiguë de neuromodulateurs tels que la sérotonine. La dernière étape de la procédure consiste à analyser les séries d'images en laps de temps acquises. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant que les neurotransmetteurs modulent le transport mitochondrial.

De tels résultats ne sont obtenus que par l'imagerie de mitochondries marquées de façon fluorescente dans des neurones sur des durées prolongées. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes, telles que le marquage avec des colorants vitaux ou la transfection transitoire de GFP, est qu'elle rend possible l'observation à long terme du transport mitochondrial dans des neurones en culture sains. Cette procédure sera démontrée par Chen, chercheur associé de mon laboratoire, afin de fournir un environnement stably chauffé et humidifié.

L'incubateur à plateau est relié à un incubateur standard pour culture de tissus par un circuit fermé, avec un couvercle à membrane A-P-F-T-E pour boîtes de culture de 35 millimètres à fond en verre, permettant les échanges gazeux entre la culture neuronale et l'environnement à l'intérieur de l'incubateur. L'ensemble de ces caractéristiques et d'autres permettent l'observation à long terme de neurones en culture dans diverses conditions expérimentales. Transférez la boîte de culture contenant les neurones hippocampiques en culture exprimant la protéine mito turbo red vers une hotte de culture de tissus.

Remplacez le couvercle en plastique par le couvercle en membrane de PFTE et déplacez la boîte de culture vers le microscope. Fixez la base de l'incubateur sur la platine du microscope, puis placez délicatement la boîte de culture recouverte de membrane. Dans l'ouverture encastrée, alignez l'enceinte de l'incubateur avec les piliers en acier situés sur la base de l'incubateur et abaissez l'enceinte sur la base.

Serrer les vis moletées jusqu'à ce qu'un bon joint soit obtenu entre l'enceinte et la base. Allumer le contrôleur de la roue à filtres du microscope, la source lumineuse et la caméra CCD avant d'ouvrir le logiciel d'acquisition d'images. Dans ce protocole, le slide book numéro cinq est utilisé pour l'acquisition d'images.

Passer à un objectif à immersion huile de 63 x et abaisser la tourelle d'objectifs. Appliquer soigneusement de l'huile à immersion sur la surface de l'objectif. Cliquer sur l'icône de fenêtre de mise au point dans la barre d'outils et allumer la lampe de champ clair en déplaçant le curseur de la lampe.

Pour régler l'intensité lumineuse, acquérez le focus sur un champ de cellules à l'aide des oculaires et repérez une cellule d'intérêt. Sous l'onglet microscope, sélectionnez le filtre XI trois à l'aide des oculaires, trouvez le plan de focalisation des mitochondries dans les cellules marquées avec la protéine mito turbo red, puis passez à la caméra CCD. Cliquez sur l'icône de capture d'image dans la barre d'outils, en commençant par un temps d'exposition initial de 100 millisecondes.

Déterminez l'exposition optimale en utilisant les boutons de test et de recherche du meilleur dans la fenêtre de capture. Dans la zone Type de capture, cochez l'option d'acquisition temporelle et sélectionnez l'intervalle d'imagerie souhaité ainsi que la durée de la session d'imagerie sous les options d'acquisition temporelle.

Démarrez l'acquisition d'images en mode laps de temps en cliquant sur le bouton de démarrage situé en bas à droite de la fenêtre de capture. Après avoir effectué une session d'imagerie de contrôle, ajoutez des neurotransmetteurs ou d'autres réactifs par les orifices d'injection situés en haut de l'incubateur de platine. Après l'ajout de l'agoniste du récepteur de la sérotonine 8-OH-DPAT, les mitochondries auparavant immobiles, indiquées par la flèche, se déplacent le long de l'axone du neurone hippocampique.

La vitesse moyenne et la directionnalité des mitochondries individuelles sont résumées avant l'ajout de sérotonine. La majorité des mitochondries sont immobiles ; toutefois, après l'ajout de sérotonine, 42 % des mitochondries présentent désormais un mouvement directionnel et parcourent des distances plus grandes que celles observées en l'absence de sérotonine. Inversement, après l'ajout de dopamine, 92 % des mitochondries sont immobiles durant les dernières 15 minutes d'une séance d'imagerie suivant cette procédure.

D'autres méthodes permettant de surveiller plus d'un signal peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, la manière dont l'activité calcique et le transport mitochondrial dans les neurones sont liés.