Name: Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Découvrez l'enregistrement électrophysiologique de neurones pyramidaux dans des tranches organotypiques du néocortex de rats postnataux. Cette méthode permet d'étudier les propriétés neuronales après transfection génétique.

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Les auteurs tiennent à remercier Mayumi Sakuraba et Rebecca Foehring d&#39;assistance technique exceptionnelle. En outre, nous tenons à remercier les Drs. Rodrigo Andrade pour l&#39;aide à mettre en œuvre la culture organotypique et des protocoles de transfection biolistique et le Dr Jeanne Nerbonne pour nous fournir avec des constructions d&#39;ADNc pour la transfection. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant: NS044163 du NINDS (aux FCR).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons étudié les rôles d&#39;expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat (4, 9-11). En raison de l&#39;absence d&#39;agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous utilisons une approche génétique pour manipuler l&#39;expression de canal (1,14,15,17-19). Nous utilisons une préparation culture organotypique (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modifiée de l&#39;approche de Stoppini et al (16), afin de maintenir la morpholog...

Chirurgie / transfection / culture: <ol><li> Cerveau Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, USA </li><li> Système de canon Gene: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Comprend: pistolet à gènes, tuyau d&#39;hélium avec détendeur, tuyau de préparation station (# 165-2418), une seringue kit, tuyaux Tefzel, coupe-tube, l&#39;optimisation de kit (# 165-2424), coupe-tube </li><li> Bio-Rad Régulateur Hélium (# 165-2413) </li><li> fournitures jetables pour Helios de Bio-Rad: <ul><li> 1,6 microporteurs Or um: # 165-2264 </li><li> Tubes Tefzel: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubateur: le modèle Forma Scientific # 3110 (Thermo-scientifique: (866) 984-3766). </li></ol> Médias: <ol><li> Sérum de cheval: Hyclone donateurs équine # SH 30074. (Hyclone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Médias Essentiel Plus HBSS et HEPES, sans glutamine: Lonza BioWhittaker Catalogue # 12-137f): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, option 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks saline tamponnée, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, option 1. </li><li> MEM (Gibco milieu minimal essentiel, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, option 1. </li><li> 250 ml Millipore filtre de 0,2 um: # SC6PU02RE </li><li> Pipettes de transfert en plastique: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore 0,22 um steriflip (# SCGP00525) filtre </li></ol> Articles 6-8 obtenu à partir de: Fisher Scientific, 1241 boul Ambassadeur, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Enregistrement: <ol><li> Verre de Pipet, Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 Octobre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 Extracteur d&#39;électrode horizontale: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B amplificateur: Molecular Devices, Inc 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 logiciels d&#39;acquisition de données: Molecular Devices, Inc, 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> position de lectrode est contrôlé avec Sutter RE-200 manipulateurs et PC-200 de contrôleur: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. </li><li> Microscope: Olympus BX-50WI microscope droit avec l&#39;IR-DIC optiques </li><li> IR-sensibles appareil OLY-150 (Olympus) ou BDÉS-MTI (DAGE-MTI, 01, avenue du Nord Roeske, Michigan City, IN 46360). </li></ol>

enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Nous avons étudié les rôles d&#39;expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat. En raison de l&#39;absence d&#39;agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous avons pris une approche génétique de la manipulation de l&#39;expression des canaux. Nous utilisons une préparation culture organotypique (16) afin de maintenir la morphologie cellulaire et le modèle laminaire du cortex. En général, nous isoler aiguë tranches néocorticales à 8-10 jours post-natal et de maintenir les tranches en culture pendant 3-7 jours. Cela nous permet d&#39;étudier les neurones à un âge similaire à ceux de notre travail avec des tranches aiguës et minimise le développement des connexions excitatrices exubérante dans la tranche. Nous enregistrons d&#39;identifier visuellement les neurones pyramidaux des couches II / III ou V à l&#39;aide d&#39;éclairage infrarouge (IR-) et microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) avec pince de cellules de patch tout en courant ou voltage-clamp. Nous utilisons biolistique (canon à gènes) transfection de type sauvage ou mutante ADN canal potassique de manipuler l&#39;expression des canaux d&#39;étudier leur fonction. Les cellules transfectées sont facilement identifiables par microscopie à épifluorescence après co-transfection avec l&#39;ADNc pour la protéine fluorescente verte (GFP). Nous comparons les enregistrements de cellules transfectées à proximité, les neurones non transfectées dans la même couche de la même tranche.

C&#39;est un protocole pour préparer et maintenir une préparation de tranches de néocortex culture organotypique dans le but de réaliser des enregistrements électriques des neurones pyramidaux.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

Nous avons étudié l'expression et les rôles fonctionnels des canaux potassiques voltage-dépendants dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat. En raison de la ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des enregistrements électriques de neurones paramétaux dans des tranches organotypiques de néocortex. Cela est réalisé en découpant d'abord des tranches aiguës chez des rats à l'âge postnatal P8 à P10. La deuxième étape de la procédure consiste à effectuer la transfection par Bic de l'ADNc. La troisième étape de la procédure est de cultiver les tranches pendant trois à sept jours.La dernière étape de la procédure consiste à obtenir des enregistrements électriques à partir de cellules transfectées en utilisant un clampage en courant ou en tension. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant que les cellules paramétales dans des tranches organotypiques possèdent des propriétés similaires à celles des tranches aiguës du même âge. Le transfectage de la GFP n'altère pas ces propriétés, permettant l'étude des neurones après des manipulations génétiques des canaux ioniques par des enregistrements en clampage en courant ou en tension sur cellule entière.Le principal avantage de cette technique, par opposition aux tranches aiguës par exemple, est que les cellules peuvent être maintenues dans un environnement normal suffisamment longtemps pour permettre la manipulation génétique des canaux ioniques. La méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des canaux ioniques, telles que les rôles fonctionnels de types spécifiques de canaux ioniques. Préparez le flux laminaire, le flux sous vide, le matériel chirurgical et les solutions comme indiqué dans le manuscrit accompagnant. Portez des gants pour toutes les étapes suivantes après avoir filtré l'aliquot de 250 millilitres de solution de coupe, en versant 40 millilitres dans un bécher de 50 millilitres.Placer la chambre de découpe, l'aliquot de 40 millilitres et les 210 millilitres restants de la solution de découpe au congélateur à moins 20 degrés Celsius sous la hotte à flux laminaire. Ajouter 1,1 millilitre de milieu de culture dans trois puits en diagonale d'une plaque à six puits. Répéter cette opération pour une seconde plaque.Plaque à six puits. Placer les plaques à six puits dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Ensuite, utiliser des ciseaux stériles pour raccourcir quatre pipettes de transfert destinées au transfert des tranches.Trois autres pipettes sont conservées intactes lorsque les solutions sont devenues des mélanges boueux. Retirez l'aliquot de 40 millilitres de solution de coupe du congélateur et placez-le sous la hotte à vide. Bubblisez-le avec 95 % d'oxygène, 5 % de dioxyde de carbone.Ensuite, retirez les 210 millilitres de solution de coupe du congélateur et placez-les sous la hotte à flux laminaire avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone. Puis, retirez le milieu de lavage du réfrigérateur et saturer-le d'oxygène à 100 % sous la hotte à flux laminaire.Placez deux millilitres de milieu de culture dans une boîte de Pétri. Conservez le milieu de culture restant au réfrigérateur pour le changement de milieu pendant la semaine, en prévision de la découpe du cerveau. Versez environ 10 millilitres de solution froide de coupe provenant du bécher de 50 millilitres dans un bécher de 25 millilitres sous la hotte aspirante.Après l'anesthésie et la décapitation, retirer le cerveau d'un rat de huit à dix jours postnataux. Rincer le cerveau dans le bécher contenant 30 millilitres de solution de coupe froide pendant environ 30 secondes. Puis transférer soigneusement le cerveau dans le bécher de 25 millilitres.Changez les gants et imbibez-les d'éthanol. Ensuite, transportez le cerveau dans la solution de coupe froide vers la hotte à flux laminaire. L'étape suivante consiste à orienter et bloquer le cerveau en retirant le cervelet et le pôle frontal, puis en effectuant une coupe sagittale médiane partielle. Collez le cerveau bloqué sur la platine, avec le cortex frontal orienté vers le haut.Effectuez des coupes supplémentaires au scalpel selon les besoins afin de limiter la taille des tranches. Ensuite, placez le plateau avec le cerveau dans la chambre de découpe en métal stérilisée. Fixez-le au microtome à vibration. Remplissez le bain avec la solution de coupe glacée et saturée en bulles. Versez 30 millilitres de la solution de coupe restante dans un bécher de 50 millilitres et saturez-la avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone. Ce bécher servira à recueillir les tranches.Découper des tranches coronales de 250 microns du cortex frontal pariétal. Placer au moins six tranches dans un bécher de 50 millilitres contenant la solution de coupe. Ensuite, placer environ deux millilitres de milieu de lavage dans une boîte de Pétri de 35 millimètres.À l’aide d’une pipette coupée, transférez les tranches de la solution de coupe vers la boîte de Pétri contenant le milieu de lavage. Lavez les tranches trois fois en utilisant des pipettes neuves pour ajouter du milieu et pour aspirer les solutions usées après chaque lavage, puis transférez les tranches dans la boîte de Pétri de 35 millimètres contenant le milieu de culture. Ensuite, retirez les couvercles des emballages des inserts en treillis, mais laissez les inserts à l’intérieur des emballages.Ensuite, utilisez une pince pour soulever un insert en treillis de son emballage à l’aide d’une pipette de transfert coupée. Transférez une tranche depuis le milieu de culture vers le treillis. Insérez et positionnez la tranche au centre de la membrane à l’aide d’une pipette de transfert intacte.Retirer tout excès de milieu de culture. Maintenant, placer l'insert en treillis avec sa tranche dans l'un des puits remplis de liquide de la plaque à six puits. Faire attention à éviter la formation de bulles d'air sous le treillis après avoir placé une tranche dans chacun des puits remplis de liquide.Remettez les deux plaques à six puits dans l’incubateur et incubez à 37 degrés Celsius pendant environ une heure. Pendant ce temps, nettoyez la zone de travail sous la hotte à flux laminaire en prévision de la transfection. L’étape suivante consiste à charger le canon à gènes BioRad Helios, en laissant la première position libre.Chargez une cartouche contenant des microbilles revêtues d'ADN dans chaque emplacement sur deux du porte-cartouche du pistolet à gènes. Ensuite, insérez le porte-cartouche dans le pistolet à gènes. Commencez par purger l'appareil en tirant un barillet sans microbilles.Ensuite, faites avancer le barillet vers une cartouche contenant des CDNA.Bullets. Retirez les plaques à six puits de l'incubateur et placez-les sous la hotte à flux laminaire en tenant le pistolet verticalement, juste au-dessus du dessus de la plaque à six puits ; tirez une tranche à 100 PSI, puis faites avancer le barillet et purgez-le à nouveau en tirant à blanc. Tirez les tranches restantes avec un coup par tranche.Après la microdissection, remettez les plaques à six puits dans l'incubateur et incubez les tranches à 37 degrés Celsius pendant deux à sept jours avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la période d'incubation. Remplacez le milieu tous les deux jours comme suit : en travaillant sous la hotte à flux laminaire, ajoutez du milieu neuf dans les trois puits inoccupés. Ensuite, remettez la plaque à six puits dans l'incubateur pendant au moins une heure ; après une heure, rapportez la plaque à six puits sous la hotte laminaire et utilisez une pince courbe nettoyée à l'éthanol pour transférer chaque insert en treillis ainsi que sa tranche dans un nouveau puit, aspirez l'ancien milieu et remettez la plaque dans l'incubateur.Après plusieurs jours d'incubation, les tranches sont désormais prêtes pour des enregistrements en configuration tout-cellule. Retirez une plaque de six puits du incubateur sous la hotte à flux laminaire. Utilisez une pince courbe désinfectée à l'éthanol pour retirer un insert en treillis ainsi que sa tranche.Ensuite, remettez la plaque à six puits dans l'incubateur. Puis, transférez la boîte de Pétri munie de l'insert en treillis et de la tranche vers la zone d'enregistrement, en appliquant une tension à l'aide de pinces ou d'une lame métallique flexible. Utilisez un scalpel de numéro 11 pour découper le treillis autour de la tranche si nécessaire, puis terminez les dernières incisions avec les ciseaux.Ensuite, utilisez une pince pour transférer la tranche et la grille qui lui est attachée vers la chambre d'enregistrement. Sur la platine d'un microscope droit, immergez la tranche dans un liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné au carbogène sous optique DIC à infrarouge. Visualisez les neurones paramédians dans les couches deux, trois ou cinq en épifluorescence avec le filtre FITC.Localisez les cellules transfectées vertes en microscopie IR DIC. Recherchez les projectiles d'ADNc, qui apparaissent comme de petits points noirs à l'intérieur des cellules. Sélectionnez une cellule transfectée pour l'enregistrement en configuration tout-cellule.Ensuite, avancez une microélectrode vers la cellule sélectionnée et appliquez une aspiration douce pour obtenir un scellement de l'ordre du gigohm. Puis appliquez une aspiration supplémentaire pour pénétrer dans la cellule en configuration tout-patch. La cellule est désormais prête pour des enregistrements en clampage de courant ou en clampage de tension.Cette figure montre une image fluorescente de cellules transfectées avec l'ADNc pour la GFP. Les enregistrements suivants proviennent de cellules transfectées avec l'ADNc pour la GFP. On observe ici un potentiel d'action dans une cellule paramétrale de la couche trois en réponse à une injection de courant supra-liminaire de 10 millisecondes.Cette figure montre un tirage répétitif provenant d'un neurone paramétal de la couche cinq en réponse à une injection de courant de 400 picoampères pendant deux secondes. Cette figure présente un enregistrement en clampage de voltage réalisé sur un neurone paramétal de la couche cinq. La tétradotoxine a été utilisée pour bloquer le courant sodique dépendant du voltage.Les tracés représentent des courants potassiques sortants provoqués par une série de pas de tension de 500 millisecondes à partir d'un potentiel de maintien de moins 70 millivolts. Une fois maîtrisé, le léger prélèvement et la transfection peuvent être réalisés en environ deux heures, temps de préparation inclus. Lors de la tentative de cette procédure.Il est important de maintenir des conditions stériles et de limiter l'épaisseur ainsi que les dimensions de la coupe pour éviter le dessèchement. Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience.Merci.

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Les protocoles en boucle fermée sont de plus en plus répandus dans l’électrophysiologie moderne. Nous présentons une manière simple, polyvalente et peu coûteuse d’effectuer des protocoles électrophysiologiques complexes dans les neurones pyramidaux corticaux in vitro, à l’aide d’un ordinateur de bureau et d’une carte d’acquisition numérique.

Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà

Ici, une procédure permettant d’activer sélectivement une protéine neuronale avec une courte impulsion de lumière en codant génétiquement un acide aminé non naturel photo-réactif dans une protéine neuronale cible exprimée dans les neurones en culture ou in vivo est présentée.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Ce protocole illustre l’implémentation d’un optimisé N-méthyl-D-glucamine (NMDG) méthode de recouvrement protecteur de préparation de tranches de cerveau. Une formulation unique de médias est utilisée pour obtenir fiable des tranches de cerveau sain provenant d’animaux de tout âge et pour diverses applications expérimentales.

Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.

Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis

Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Ici, nous présentons des protocoles pour la préparation des tranches aigues de cerveau contenant le noyau génuulé latéral et l'investigation électrophysiologique de la fonction de synapses de rétinogeniculate et de corticogeniculate. Ce protocole fournit un moyen efficace d'étudier les synapses avec la probabilité de libération élevée et faible dans les mêmes tranches de cerveau aigus.

Investigations électrophysiologiques de la fonction de synapse de rétinogeniculate et de Corticogeniculate

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

Découvrez l'enregistrement électrophysiologique de neurones pyramidaux dans des tranches organotypiques du néocortex de rats postnataux. Cette méthode permet d'étudier les propriétés neuronales après transfection génétique.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

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