Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des enregistrements électriques à partir de neurones paramétalliques dans des tranches organotypiques de néocortex. Ceci est accompli en coupant d’abord des tranches aiguës de rats aux âges postnatals P 8 à P 10. La deuxième étape de la procédure consiste à affecter la transfection Bic de CD NA. La troisième étape de la procédure consiste à cultiver les tranches pendant trois à sept jours.

La dernière étape de la procédure consiste à obtenir des enregistrements électriques à partir de cellules transfectées à l’aide d’une pince de courant ou de tension. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que les cellules paramétalliques dans les coupes organotypiques ont des propriétés similaires à celles des tranches aiguës du même âge. La transfection de la GFP n’altère pas ces propriétés, ce qui permet d’étudier les neurones après des manipulations génétiques des canaux ioniques par le biais d’enregistrements de courant ou de tension de cellule entière.

Le principal avantage de cette technique est, par opposition aux coupes aiguës, est que les cellules peuvent être maintenues dans un environnement normal assez longtemps pour pouvoir manipuler génétiquement les canaux ioniques. La méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des canaux ioniques, telles que les rôles fonctionnels de types de canaux ioniques spécifiques, la préparation de la hotte à flux laminaire, la hotte à flux sous vide, les fournitures et solutions chirurgicales telles que spécifiées dans le manuscrit ci-joint. Portez des gants pour toutes les étapes ultérieures après avoir filtré la solution de coupe préparée de 250 millilitres, aliquote 40 millilitres de celle-ci dans un bécher de 50 millilitres.

Placez la chambre de coupe, l’aliquote de 40 millilitres et les 210 millilitres restants de la solution de coupe au congélateur à moins 20 degrés Celsius sous la hotte à flux laminaire. Placez 1,1 millilitre de milieu de culture dans trois puits diagonaux d’une plaque à six puits. Répétez cette opération pendant une seconde.

Plaque à six puits. Placez les six plaques de puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Ensuite, utilisez des ciseaux stériles pour raccourcir quatre pipettes de transfert à utiliser pour le transfert des tranches.

Trois autres pipettes sont maintenues intactes lorsque les solutions sont devenues des mélanges de neige fondue. Sortez l’aliquote de 40 millilitres de solution de coupe du congélateur et placez-la sous le capot de l’aspirateur. Faites-le bouillonner avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone.

Retirez ensuite les 210 millilitres de solution de coupe du congélateur et placez-les sous la bulle de la hotte à flux laminaire. Il contient également 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, retirez le produit de lavage du réfrigérateur et faites-le bouillonner avec 100 % d’oxygène sous la hotte à flux laminaire.

Placez deux millilitres de milieu de culture dans une boîte de Pétri. Placez les milieux de culture restants au réfrigérateur pour les changer au cours de la semaine afin de préparer le tranchage du cerveau. Versez environ 10 millilitres de solution de coupe à froid du bécher de 50 millilitres dans un bécher de 25 millilitres sous le capot à vide.

Suite à l’anesthésie et à la décapitation, retirer le cerveau d’un jour postnatal, huit à 10 rats. Lavez la cervelle dans le bécher contenant 30 millilitres de solution de coupe à froid pendant environ 30 secondes. Transférez ensuite soigneusement le cerveau dans le bécher de 25 millilitres.

Changez de gants et saturez les gants avec de l’éthanol. Transportez ensuite le cerveau dans la solution de découpe à froid jusqu’à la hotte à flux laminaire. L’étape suivante consiste à orienter et à bloquer le cerveau en retirant le cervelet et le pôle frontal et en faisant une coupe partielle du milieu du sagittal, en collant le cerveau bloqué sur la scène avec le cortex frontal vers le haut.

Faites des coupes de scalpel supplémentaires au besoin pour limiter la taille des tranches. Placez ensuite la scène avec le cerveau dans la chambre de tranchage en métal stérilisé. Fixez-le à la trancheuse à tissu vibrant.

Remplissez le bain d’une solution de coupe bouillonnante glacée. Versez 30 millilitres de la solution de coupe restante dans un bécher de 50 millilitres et bullez avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone. Ce bécher sera utilisé pour collecter les tranches.

Coupez des tranches coronales de 250 microns du cortex pariétal frontal. Placez au moins six tranches dans le pic de 50 millilitres contenant la solution de coupe. Ensuite, placez environ deux millilitres de produit de toilette dans une boîte de Pétri de 35 millimètres.

À l’aide d’une pipette coupée, transférez les tranches de la solution de coupe dans la boîte de Pétri contenant le produit de lavage. Lavez les tranches trois fois à l’aide de pipettes neuves pour ajouter le milieu et pour aspirer les solutions résiduelles après le lavage, transférez les tranches dans la boîte de Pétri de 35 millimètres contenant le milieu de culture. Ensuite, retirez les dessus de l’emballage pour les inserts en filet, mais laissez les inserts dans les emballages.

Ensuite, à l’aide d’une pince, soulevez un insert en maille de son emballage à l’aide d’une pipette de transfert coupée. Transférez une tranche du milieu de culture vers le grillage. Insérez et positionnez la tranche au milieu de la membrane à l’aide d’une pipette de transfert intacte.

Retirez tout excès de milieu de culture. Maintenant. Placez l’insert en maille avec sa tranche dans l’un des puits remplis de liquide de la plaque à six puits. Veillez à éviter la formation de bulles d’air sous le grillage après avoir placé une tranche dans chacun des puits remplis de liquide.

Remettez les deux plaques à six puits dans l’incubateur et incubez à 37 degrés Celsius pendant environ une heure. Pendant ce temps, nettoyez la zone de travail sous la hotte à flux laminaire en prévision de la transfection. L’étape suivante consiste à charger le pistolet à gènes BioRad Helios, en laissant la première position libre.

Chargez une cartouche contenant des balles revêtues de CD NA dans toutes les autres positions du porte-cartouche du pistolet à gènes. Placez ensuite le porte-cartouche dans le pistolet à gènes. Tout d’abord, nettoyez l’arme en tirant avec un canon sans balles.

Avancez ensuite le canon vers une cartouche contenant de l’ADNC. Balles. Prenez les six plaques de puits de l’incubateur et placez-les sous le capot à flux laminaire, en tenant le pistolet verticalement juste au-dessus du haut de la plaque à six puits, tirez une tranche à 100 PSI, puis avancez le canon et nettoyez-le à nouveau en tirant à blanc. Tirez sur les tranches restantes avec un coup par tranche.

Après le tournage, remettez les six plaques dans l’incubateur et incubez les tranches à 37 degrés Celsius pendant deux à sept jours avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la période d’incubation. Remplacez le média tous les deux jours comme suit, en passant sous la hotte à flux laminaire, ajoutez de nouveaux médias aux trois puits inoccupés. Ensuite, replacez la plaque à six puits dans l’incubateur pendant au moins une heure après une heure, remettez la plaque à six puits dans le capot laminaire et utilisez des pinces incurvées nettoyées à l’éthanol pour déplacer chaque insert en maille et sa tranche vers un nouveau puits, aspirez l’ancien média et remettez la plaque dans l’incubateur.

Après plusieurs jours d’incubation, les tranches sont maintenant prêtes pour l’enregistrement de cellules entières. Retirez une plaque à six puits de l’incubateur sous le capot à flux laminaire. Utilisez une pince incurvée nettoyée à l’éthanol pour retirer un insert en maille et sa tranche.

Replacez ensuite la plaque à six puits dans l’incubateur. Ensuite, transférez la boîte de Pétri avec un insert en maille et coupez-la dans la zone d’enregistrement, en appliquant une tension avec une pince ou un morceau de métal flexible. Utilisez un scalpel numéro 11 pour couper le maillage autour de la tranche si nécessaire, terminez les coupes finales avec les ciseaux.

Ensuite, à l’aide d’une pince, vous pouvez transférer la tranche et le treillis attaché dans la chambre d’enregistrement. Sur la platine d’un microscope vertical, baignez la tranche dans du liquide céphalo-rachidien artificiel lié au carbogène sous une optique IR DIC. Visualisez les neurones paramétalliques en couches deux, trois ou cinq sous l’épifluorescence et le filtre fitz.

Localisez les cellules vertes transfectées sous microscopie IR DIC. Recherchez les balles CDNA, qui apparaissent sous la forme de petits points noirs à l’intérieur des cellules. Sélectionnez une cellule transfectée pour l’enregistrement de la cellule entière.

Ensuite, avancez une micro-électrode vers la cellule sélectionnée et utilisez une aspiration douce pour obtenir une étanchéité giga ohm. Ensuite, appliquez une aspiration supplémentaire pour pénétrer dans la cellule pour toute la cellule. Enregistrement. La cellule est maintenant prête pour les enregistrements par pince de courant ou de tension.

Cette figure montre une image fluorescente de cellules transfectées avec de l’ADNC pour la GFP. Les enregistrements suivants sont tirés de cellules transfectées avec de l’ADNC pour la GFP. On voit ici un potentiel d’action dans une cellule paramétallique de couche trois en réponse à une injection de courant de 10 millisecondes au-dessus du seuil.

Cette figure montre une décharge répétitive d’un neurone paramétallique de couche cinq en réponse à une injection de courant de 400 pico ampères de deux secondes. Cette figure montre un enregistrement de pince de tension d’un neurone paramétallique de couche cinq. La tétrodotoxine a été utilisée pour bloquer le courant de sodium voltage-dépendant.

Les traces représentent des courants potassiques sortants provoqués par une famille de pas de tension de 500 millisecondes à partir d’un potentiel de maintien de moins 70 millivolts. Une fois maître, la légère préparation et la transfection peuvent être effectuées en deux heures environ, y compris le temps de préparation. Lors de la tentative de cette procédure.

Il est important de maintenir des conditions stériles et de limiter l’épaisseur et les dimensions de la tranche pour éviter le dessèchement. Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans votre expérience.

Merci.