Name: Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Découvrez l'enregistrement électrophysiologique de neurones pyramidaux dans des tranches organotypiques du néocortex de rats postnataux. Cette méthode permet d'étudier les propriétés neuronales après transfection génétique.

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Les auteurs tiennent à remercier Mayumi Sakuraba et Rebecca Foehring d&#39;assistance technique exceptionnelle. En outre, nous tenons à remercier les Drs. Rodrigo Andrade pour l&#39;aide à mettre en œuvre la culture organotypique et des protocoles de transfection biolistique et le Dr Jeanne Nerbonne pour nous fournir avec des constructions d&#39;ADNc pour la transfection. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant: NS044163 du NINDS (aux FCR).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons étudié les rôles d&#39;expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat (4, 9-11). En raison de l&#39;absence d&#39;agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous utilisons une approche génétique pour manipuler l&#39;expression de canal (1,14,15,17-19). Nous utilisons une préparation culture organotypique (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modifiée de l&#39;approche de Stoppini et al (16), afin de maintenir la morpholog...

Chirurgie / transfection / culture: <ol><li> Cerveau Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, USA </li><li> Système de canon Gene: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Comprend: pistolet à gènes, tuyau d&#39;hélium avec détendeur, tuyau de préparation station (# 165-2418), une seringue kit, tuyaux Tefzel, coupe-tube, l&#39;optimisation de kit (# 165-2424), coupe-tube </li><li> Bio-Rad Régulateur Hélium (# 165-2413) </li><li> fournitures jetables pour Helios de Bio-Rad: <ul><li> 1,6 microporteurs Or um: # 165-2264 </li><li> Tubes Tefzel: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubateur: le modèle Forma Scientific # 3110 (Thermo-scientifique: (866) 984-3766). </li></ol> Médias: <ol><li> Sérum de cheval: Hyclone donateurs équine # SH 30074. (Hyclone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Médias Essentiel Plus HBSS et HEPES, sans glutamine: Lonza BioWhittaker Catalogue # 12-137f): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, option 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks saline tamponnée, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, option 1. </li><li> MEM (Gibco milieu minimal essentiel, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, option 1. </li><li> 250 ml Millipore filtre de 0,2 um: # SC6PU02RE </li><li> Pipettes de transfert en plastique: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore 0,22 um steriflip (# SCGP00525) filtre </li></ol> Articles 6-8 obtenu à partir de: Fisher Scientific, 1241 boul Ambassadeur, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Enregistrement: <ol><li> Verre de Pipet, Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 Octobre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 Extracteur d&#39;électrode horizontale: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B amplificateur: Molecular Devices, Inc 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 logiciels d&#39;acquisition de données: Molecular Devices, Inc, 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> position de lectrode est contrôlé avec Sutter RE-200 manipulateurs et PC-200 de contrôleur: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. </li><li> Microscope: Olympus BX-50WI microscope droit avec l&#39;IR-DIC optiques </li><li> IR-sensibles appareil OLY-150 (Olympus) ou BDÉS-MTI (DAGE-MTI, 01, avenue du Nord Roeske, Michigan City, IN 46360). </li></ol>

enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Nous avons étudié les rôles d&#39;expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat. En raison de l&#39;absence d&#39;agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous avons pris une approche génétique de la manipulation de l&#39;expression des canaux. Nous utilisons une préparation culture organotypique (16) afin de maintenir la morphologie cellulaire et le modèle laminaire du cortex. En général, nous isoler aiguë tranches néocorticales à 8-10 jours post-natal et de maintenir les tranches en culture pendant 3-7 jours. Cela nous permet d&#39;étudier les neurones à un âge similaire à ceux de notre travail avec des tranches aiguës et minimise le développement des connexions excitatrices exubérante dans la tranche. Nous enregistrons d&#39;identifier visuellement les neurones pyramidaux des couches II / III ou V à l&#39;aide d&#39;éclairage infrarouge (IR-) et microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) avec pince de cellules de patch tout en courant ou voltage-clamp. Nous utilisons biolistique (canon à gènes) transfection de type sauvage ou mutante ADN canal potassique de manipuler l&#39;expression des canaux d&#39;étudier leur fonction. Les cellules transfectées sont facilement identifiables par microscopie à épifluorescence après co-transfection avec l&#39;ADNc pour la protéine fluorescente verte (GFP). Nous comparons les enregistrements de cellules transfectées à proximité, les neurones non transfectées dans la même couche de la même tranche.

C&#39;est un protocole pour préparer et maintenir une préparation de tranches de néocortex culture organotypique dans le but de réaliser des enregistrements électriques des neurones pyramidaux.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

Nous avons étudié l'expression et les rôles fonctionnels des canaux potassiques voltage-dépendants dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat. En raison de la ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des enregistrements électriques de neurones paramétaux dans des tranches organotypiques de néocortex. Cela est réalisé en découpant d'abord des tranches aiguës chez des rats à l'âge postnatal P8 à P10. La deuxième étape de la procédure consiste à effectuer la transfection par Bic de l'ADNc. La troisième étape de la procédure est de cultiver les tranches pendant trois à sept jours.La dernière étape de la procédure consiste à obtenir des enregistrements électriques à partir de cellules transfectées en utilisant un clampage en courant ou en tension. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant que les cellules paramétales dans des tranches organotypiques possèdent des propriétés similaires à celles des tranches aiguës du même âge. Le transfectage de la GFP n'altère pas ces propriétés, permettant l'étude des neurones après des manipulations génétiques des canaux ioniques par des enregistrements en clampage en courant ou en tension sur cellule entière.Le principal avantage de cette technique, par opposition aux tranches aiguës par exemple, est que les cellules peuvent être maintenues dans un environnement normal suffisamment l

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