Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

L’objectif global de l’expérience suivante est de purifier à la fois et avec une grande pureté un large éventail de cellules mitiques à partir de testicules adultes de souris afin d’étudier les processus dynamiques qui se déroulent au cours de ce cycle cellulaire unique. Ceci est réalisé en dissociant efficacement les cellules testiculaires avec une série de digestions enzymatiques avec de la collagénase et de la trypsine en présence d’ADN. L’une pour obtenir une suspension testy à cellule unique dans un deuxième temps.

La suspension testiculaire est colorée avec le colorant d’ADN vivant fluorescent 3 33 42 de Hulk, ce qui permet de distinguer divers types de cellules myotiques en fonction de leur contenu en ADN et de leur densité. Ensuite, les cellules miotiques sont analysées par tri cellulaire activé par fluorescence afin d’identifier et de purifier toutes les fractions nécessaires à une analyse ultérieure telle que l’analyse cytogénétique ou l’analyse de l’expression génique. Des résultats sont obtenus qui montrent une purification efficace de populations de cellules miotiques difficiles à obtenir à haute pureté, sur la base d’études cytogénétiques et d’expression complètes.

Le principal avantage de ce protocole basé sur des faits par rapport aux méthodes existantes telles que la centrifugation, la littération ou la sédimentation gravitaire, est qu’il permet de collecter au plus grand nombre de fractions miotiques à très haute pureté. Les individus novices dans cette méthode devront combiner des compétences très différentes pour effectuer des tests efficaces de dissociation et de position debout suivis d’un tri cellulaire optimal, de bonnes interactions entre la personne préparant les cellules et l’opérateur de cytométrie en flux, ainsi qu’une bonne compréhension des fondamentaux de ce protocole essentiel à la réussite. La démonstration du protocole de dissociation cellulaire sera assurée par le Dr I Gatun, un post-doctorant senior de notre laboratoire, qui a considérablement amélioré ce protocole.

BVN Tores. Notre opérateur de cytométrie en flux vous guidera à travers une configuration optimale pour un tri cellulaire efficace. Dans ce protocole, une dissociation de deux testicules de souris adultes sera démontrée, mais les volumes peuvent être adaptés en conséquence pour les juvéniles ou pour des testicules supplémentaires.

Pour commencer à trois millilitres de solution saline équilibrée contenant 120 unités par millilitre de collagénase de type un dans le tube Une association efficace et savoureuse est cruciale pour une coloration correcte et des problèmes de recours des cellules. L’ajout d’une quantité suffisante de G nase one ainsi que le placement du tube en position horizontale pendant l’agitation, ce qui est très important pour une dissociation efficace du test. Placez un testicule encapsulé dans un tube de 15 millilitres.

Ajoutez 10 microlitres d’ADN dans le testicule et secouez vigoureusement le tube à la main jusqu’à ce que vous voyiez le tubule testiculaire commencer à se dissocier Ensuite, placez et fixez le tube horizontalement sur un agitateur rotatif et agitez le tube à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius après 15 minutes, Décanter pendant une minute verticalement à température ambiante. Utilisez ensuite une pipette jetable pour jeter le surnageant. Ajoutez à l’échantillon trois millilitres de solution saline équilibrée contenant de la collagénase de type 1 ainsi que 10 microlitres de D nase un.

Encore une fois, secouez le tube plusieurs fois à la main. Agitez le tube horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius comme précédemment, décantez pendant une minute verticalement à température ambiante, puis jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de GBSS contenant de la collagénase.

Type un 50 microlitres de trypsine et 10 microlitres de dase. On retourne le tube plusieurs fois, on agite horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius. Après 15 minutes d’agitation, utilisez une pipette en plastique jetable avec un large orifice pour pipeter doucement l’échantillon de haut en bas pendant trois minutes.

Aucune touffe ne doit être visible à ce stade. Ajoutez ensuite 30 microlitres de trypsine, 10 microlitres d’ADN un et 40 microlitres de Hulks 3, 33, 42 remis en suspension dans du DMSO. Retournez le tube plusieurs fois.

Agitez horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius. Lorsque l’agitation de l’échantillon est terminée, ajoutez 400 microlitres de sérum de veau fœtal et mélangez en inversant le tube pour inactiver la trypsine. Pour effectuer la coloration finale, ajoutez 50 microlitres de canular 3 33 42 et 10 microlitres d’ADN.

Une fois de plus, agitez le tube horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius. L’échantillon de testicule dissocié est ensuite passé à travers deux filtres jetables de 40 microns pré-mariés avec GBSS sur un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez cinq microlitres de solution d’iodure de propidium à l’échantillon et mélangez doucement en pipetant plusieurs fois avec une pipette à pâte jetable.

Ensuite, transférez l’échantillon dans une seringue en plastique de cinq millilitres à l’aide d’une aiguille de calibre 18. Remplacez ensuite l’aiguille de calibre 18 par une aiguille de calibre 22 pour l’administration de l’échantillon. Enfin, rangez la seringue sur de la glace et protégez-la de la lumière jusqu’à ce que l’échantillon soit prêt pour le traitement par télécopie.

Pour cette expérience, le tri cellulaire est effectué sur une zone de Backin Dixon. Deux conditions d’utilisation du trieur de cellules ont été adaptées de celles utilisées précédemment pour un cytomètre en flux équipé d’un laser ultraviolet à argon de 360 nanomètres et d’un laser argonne de 488 nanomètres. En fin de compte, la configuration du cytomètre en flux devra être optimisée par l’opérateur du trieur de cellules.

Étant donné que le Becton Dixon Aria two U n’a pas de laser UV, le protocole de détection de la coloration de l’épervier est adapté à l’aide d’un laser violet de 405 nanomètres. Hooks est excité par le laser violet de 405 nanomètres et un laser bleu de 488 nanomètres est utilisé pour l’excitation PI et la détection de diffusion avant et latérale. De plus, les filtres pour la détection des hos sont modifiés afin de limiter certaines fuites du laser rouge, ce qui se traduit par une meilleure netteté du nuage de points.

Le laser violet est configuré avec un passe-bande de 4 50 40 nanomètres pour la détection de l’émission bleue canularisée et un passe-bande de 5 85 42 nanomètres pour l’émission de rouge canular. Un passage de 5 0 2 nanomètres de long est utilisé pour séparer la fluorescence bleue de la fluorescence rouge. La différence entre l’utilisation de deux jeux de filtres différents est illustrée ici.

Le filtre 5 85 42 nanomètres donne des populations cellulaires plus compactes que le filtre 6 30 30 nanomètres. Par conséquent, l’opérateur doit être prêt à essayer différentes combinaisons sur son propre instrument afin d’obtenir le meilleur compromis. Une buse de 100 microns est utilisée avec une fréquence d’entraînement de chute de 28 000 gouttes par seconde.

Le débit seuil d’échantillonnage est d’environ 4 000 événements par seconde avec un débit compris entre un et trois pour maintenir une plus grande résolution. Triez l’échantillon en aliquotes d’environ 750 microlitres distribués à partir de la seringue Pendant ces pauses, conservez l’échantillon restant dans la seringue sur de la glace et à l’abri de la lumière. Collectez les échantillons triés dans des tubes de collecte en verre de 12 x 75 millimètres contenant 250 microlitres de DMEM complétés par 10 % de FCS.

Pour maintenir l’échantillon dans les tubes de collecte à quatre degrés Celsius, utilisez l’option de contrôle de la température pendant toute la durée du tri. De plus, utilisez la fonction d’agitation de l’échantillon à 200 tr/min pour empêcher l’échantillon de sédimenter tout au long du tri. Chaque fois qu’une aliquote de l’échantillon principal est ajoutée, il est important de secouer également les tubes de collecte afin de maintenir l’intégrité des cellules collectées.

Des profils représentatifs sont présentés ici où toutes les étapes majeures de la méiose de type sauvage sont identifiées dans ce nuage de points où les cellules fermées sont indiquées, il y a une grande quantité de débris contenant principalement des membranes vides et des queues de spermatozoïdes présentes dans les testicules adultes. Un graphique représentatif de l’iodure de propidium montre une quantité très limitée de cellules positives à l’iodure de propidium présentes dans l’échantillon. La démarche typique est indiquée dans ce profil représentatif de type sauvage hoax 3 33 42 fax.

Les différentes populations de cellules myotiques qui peuvent être purifiées à l’aide de cette méthode pour une étude plus approfondie sont la spermatogonie, la pré-leptine, la leptine, les zygotes, le pacu, le diplotène et le sperate rond. Ces deux derniers profils proviennent d’un testicule SPO 11 N et d’un testicule de type sauvage provenant de souris âgées de 13 jours. SPO 11 est l’endonucléase miotique qui dirige les ruptures de brin doublet ses sites de points chauds de recombinaison miotique, et comme observé ici, l’absence de SPO O 11 entraîne une défaillance miotique claire car aucun stade au-delà du zygote de leptine précoce PACU ne peut être détecté.

En revanche, le profil d’une souris mâle de type sauvage de 13 jours montre une forte concentration de cellules zygotes de leptine. Cette première vague de myose est plutôt asynchrone comme on le voit clairement. Lors de la réalisation de cette expérience, il est important d’utiliser une quantité suffisante d’ADN.

Le centre de la ville pour un tri sans problème. Bien que les chercheurs soient initialement réticents à l’utiliser, l’ajout d’ADN réduira la viscosité de l’échantillon et améliorera la séparation et la coloration des cellules, en plus des cellules intactes, ne seront pas endommagées. La méthode FOX pour l’extraction de cellules matiques peut être utilisée dans un large éventail d’applications en aval telles que, par exemple, l’extraction D-N-A-R-N-A pour étudier la dynamique de l’expression génique, ou pour la technique d’immunoprécipitation de la chromatine pour établir divers profils épigénétiques.