Name: Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez la purification de cellules méiotiques de souris par cytométrie en flux. Cette méthode combine dissociation enzymatique et tri FACS pour isoler à haute pureté les fractions méiotiques. Elle permet d'étudier la dynamique du cycle cellulaire méiotique.

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Ce projet a été soutenu en partie par l&#39;argent de l&#39;Etat de Floride aux Scripps et les numéros de récompense et de R01GM085079 R21HD061304 de l&#39;Institut national des sciences médicales générales et l&#39;Institut national de la santé infantile et du développement humain, respectivement. Ceci est le numéro de manuscrit de 20917 The Scripps Research Institute.

Ce protocole peut être séparé en deux grandes étapes: (1) la dissociation et Hoechst 33342 coloration des cellules des testicules de souris suivie, si nécessaire, (2) FACS de tri des fractions pertinentes méiotique, y compris toutes les étapes de la méiose, à partir de cellules germinales au spermatides rondes. Une fois collectées, ces populations hautement enrichi méiotique peut être utilisé pour un large éventail d'analyses. Ce protocole décrit la dissociation d'un testicule adulte; volumes peuvent être adaptées en conséquence pour les mineurs ou pour les testicules supplémentaires. 1. Testicule dissociation <ol><li> Placez un testicule décapsulé dans un tube de 15 ml. </li><li> Ajouter 3 ml de solution de Gey équilibre du sel (GBSS) contenant 120 U / ml de collagénase de type I. </li><li> Ajouter 10 ul de DNAse I (1mg/ml solution stock de glycérol 50%) et agiter vigoureusement à la main jusqu'à ce que vous voyez tubules testiculaires commencent à se dissocier. </li><li> Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C. </li><li> Décanter pendant 1 min à la verticale à la température ambiante et éliminer le surnageant. </li><li> Répétez les étapes 1.2 à 1.5. </li><li> Ajouter 2,5 ml de GBSS contenant la collagénase de type I, 50 ul d'une solution de trypsine stocks 50mg/ml remises en suspension dans une solution d'HCl 1mM, et 10 pi de DNAse I (1mg/ml), et inverser le tube plusieurs fois. </li><li> Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C. </li><li> L'utilisation de plastique jetables pipette Pasteur avec large orifice, une pipette doucement de haut en bas pour les touffes min.No 3 devrait être visible à ce stade. </li><li> Ajouter 30 ul de la trypsine, 10 pl de la DNAse I, 40 pl de Hoechst 33342 resuspendues dans du DMSO (10 mg / ml), et inverser le tube plusieurs fois. </li><li> Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C. </li><li> Ajouter 400 ul de sérum de veau foetal (FCS) et mélanger en retournant pour inactiver la trypsine. </li><li> Coloration finale est effectuée en ajoutant 50 pl de Hoechst 33342 resuspendues dans du DMSO (10 mg / ml), et 10 pi de DNAse I (1 mg / ml). </li><li> Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C. </li><li> L'échantillon est ensuite dissocié testicule passé par deux GBSS 40 um préhumidifié filtres jetables sur un tube conique de 50 ml, puis 5 ul d'iodure de propidium (PI) et la solution est ajoutée de l'échantillon est mélangé doucement par pipetage plusieurs fois avec Pasteur jetables pipette. </li><li> L'échantillon est transféré dans une seringue en plastique de 5 ml à travers une aiguille de calibre 18. Cette dernière est remplacée par une aiguille de calibre 22 pour la livraison d'échantillons. La seringue est stocké sur la glace et protégé de la lumière jusqu'au moment de son traitement de FACS. </li></ol> 2. Configuration FACS et purification <ol><li> Le tri a été effectué sur un trieur Becton-Dickinson Aria cellules IIU. Les conditions décrites doivent donc être utilisés comme point de départ en particulier lors de l'utilisation des équipements différents. Nous avons utilisé les conditions décrites précédemment 7,8. </li><li> Depuis l'IIU Aria n'a pas un laser UV, nous avons adapté le protocole pour la détection de coloration Hoescht en utilisant un laser violet 405nm en plus nous avons utilisé un laser 488nm bleu pour la détection diffusion vers l'avant et latérale. Par ailleurs, certains filtres ont été modifiées afin de limiter certains perméabilité laser rouge résultant de la netteté améliorée complot dispersés. </li><li> Le laser violet a été configuré avec une bande passante 450/40nm pour la détection de Hoescht Bleu d'émission et un passe-bande pour les 585/42nm Hoescht-Rouge émission. Un laissez-passer 502nm long a été utilisé pour séparer bleue de fluorescence rouge. </li><li> Une buse 100 um a été utilisé avec une fréquence d'entraînement goutte de 28000 gouttes / seconde. Le taux seuil de l'échantillon était d'environ 4000 événements / seconde. L'option de contrôle de température a été utilisée pour maintenir l'échantillon et les tubes de prélèvement à 4 ° C toute la durée de tri. En outre, la fonctionnalité de l'agitation de l'échantillon a été utilisé à 200 rpm pour empêcher l'échantillon de sédimentation dans le tri. </li><li> Habituellement, deux à trois testicules ont été traités par 6 heures de tri permettant la collecte de 0,5-2.0x10 6 cellules pour chaque population (voir la section représentant). </li><li> L'échantillon a été trié dans des aliquotes d'environ 750μl dispensé de la seringue. En attendant, pendant ces pauses les tubes de prélèvement ont été conservés à 4 ° C, protégé de la lumière, et mélanger doucement avant de reprendre de tri. </li><li> Les échantillons ont été collectés triés dans un tube de collecte du verre borosilicaté contenant 250μl 12x75mm DMEM supplémenté avec 10% de FCS. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Un profil typique FACS est montré dans la figure 1. Toutes les grandes étapes de la méiose sont identifiés et sont indiqués dans la légende. Si le Hoechst 33342 tache n'est pas optimale, le profil global apparaîtra beaucoup plus compact et moins bien définies. Un problème commun concerne non ajoutant suffisamment DNAse, qui va induire l'agglutination cellulaire rapide. Ajout d'extra DNAse à toutes les étapes inculpé résout généralement ce problème. E gelAwing du stock DNAse (conservés à -20 ° C) devrait être maintenu à un minimum, car cela entraîne une perte rapide de l'activité enzymatique. Spo11 est l'endonucléase méiotique qui dirige des cassures double brin dans des sites de hotspots recombinaison méiotique 12. La figure 2 montre les profils typiques d'un testicule Spo11-nulle, où cassures double brin ne sont pas formés, résultant en une méiose avortée 12, ainsi que d'un pré-puberous profil d'une souris de 13 jours, ce qui révèle la nature asynchrone de cette première vague de la méiose. Analyses cytogénétiques standard en utilisant la combinaison de protéines complexes synaptonémal 3 (SCP3) et phosphorylée anticorps histone H2AX stade de la méiose des marqueurs spécifiques doivent être d'abord utilisé pour confirmer la pureté et la nature des cellules triées méiotique, comme décrit elswhere 11. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Wild-type de la méiose FACS profils. A) nuage de points représentant est montré. Les cellules fermée sont représentés. Notez la grande quantité de débris présents dans le testicule adulte contenant principalement des membranes vides et les queues des spermatides. B) Un tracé représentatif PI indique la quantité très limitée de cellules PI positives présentes dans un échantillon. La porte typique est montré. C) Un représentant de type sauvage Hoechst 33342 profil FACS est montré. Les différentes populations de cellules méiotiques qui peuvent être purifiés en utilisant cette méthode pour une étude plus approfondie sont indiqués: les spermatogonies (Sp), pré-leptotène (PL), leptotène-zygotène (L / Z), début Pachytène (EP), le Moyen-Pachytène ( spermatides MP), fin-Pachytène (LP), diplotène (D) et ronde (RS). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Spo11-nulle et de type sauvage jours 13 méiotique profils FACS. A) Un typiques Spo11-nulle profil est représenté avec un échec patent méiotique, où aucune étape de la dernière leptotène / zygotène précoce pachytène peut être détecté. B) le profil d'un 13-jours-anciens de type sauvage souris mâle montre la forte concentration de cellules leptotène / zygotène. Cette première vague de la méiose est plutôt asynchrone, aussi clairement visualisés en utilisant cette méthodologie.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

Le protocole présenté ici permet un à la fois purifier de souris mâles adultes toute la gamme des cellules stade de la méiose avec une très grande pureté, ce qui permet aux enquêteurs d&#39;étudier la dynamique de ce processus fondamental. Cellules purifiées peuvent être utilisées pour de nombreuses applications allant de l&#39;extraction de l&#39;ARN 9,10, la cartographie nucléosome 11, la détection de molécules recombinantes, les analyses de protéines, et beaucoup plus. Cependant, les méthodes de...

<table><tbody><tr><td>Collagénase de type 1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>Dissoudre à 12 000 U/ml dans du GBSS, conserver à 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tripsine</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>Dissoudre dans du HCl 1 mM à 50 mg/ml, conserver à 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>Solution saturée (10 mg/ml dans du DMSO), conserver à 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>Dissoudre dans de l’eau/glycérol 50 % à 1 mg/ml, conserver à -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Gey&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert de 6&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Le caractère hétérogène de types de cellules dans les testicules et l&#39;absence de modèles de culture cellulaire méiotique ont été des obstacles importants à l&#39;étude de la différenciation des programmes uniques qui se manifestent lors de la méiose. Deux principales méthodes ont été développées pour purifier, à des degrés divers, diverses fractions méiotique à la fois adulte et immature animaux: élutriation ou Staput (sédimentation) à l&#39;aide de BSA et / ou des gradients de Percoll. Ces deux méthodes reposent sur ​​la taille des cellules et la densité de séparer les cellules méiotiques 1-5. Dans l&#39;ensemble, sauf pour quelques populations de cellules 6, ces protocoles ne parviennent pas à donner une pureté suffisante des populations de nombreuses cellules méiotiques qui sont nécessaires pour des analyses détaillées moléculaire. Par ailleurs, avec de telles méthodes habituellement un type de cellules méiotiques peut être purifié à un moment donné, ce qui ajoute un niveau supplémentaire de complexité quant à la reproductibilité et l&#39;homogénéité en comparant des échantillons de cellules méiotiques. Ici, nous décrivons une méthode raffinée qui permet de visualiser facilement, d&#39;identifier et de purifier les cellules méiotiques, à partir des cellules germinales afin de spermatides rondes, en utilisant FACS combiné avec Hoechst 33342 coloration 7,8. Cette méthode fournit un instantané global de l&#39;ensemble du processus méiotique et permet de purifier les cellules viables hautement de la plupart des étapes de la méiose. Ces cellules purifiées peuvent alors être analysés en détail pour des changements moléculaires qui accompagnent la progression à travers la méiose, par exemple des changements dans les 9,10 expression des gènes et la dynamique de l&#39;occupation des nucléosomes sur les hotspots de la recombinaison méiotique 11.

Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

La nature hétérogène des types cellulaires dans le testicule et l'absence de modèles de culture de cellules méiotiques ont constitué des obstacles majeurs à l'étude de la...

L'objectif général de l'expérience suivante est de purifier simultanément et avec une haute pureté une large gamme de cellules mitiques provenant de testicules adultes de souris afin d'étudier les processus dynamiques qui se déroulent au cours de ce cycle cellulaire unique. Cela est réalisé en dissociant efficacement les cellules testiculaires à l'aide d'une série de digestions enzymatiques au collagénase et à la trypsine en présence d'ADN. Une à obtenir une suspension de cellules testiculaires uniques dans une seconde étape.La suspension instable est colorée avec le colorant fluorescent vital pour l'ADN 3 33 42 du Hulk, ce qui permet de distinguer divers types de cellules mitotiques selon leur teneur et leur densité en ADN. Ensuite, les cellules mitotiques sont analysées par tri cellulaire activé par fluorescence afin d'identifier et de purifier toutes les fractions nécessaires pour des analyses ultérieures, telles que des analyses cytogénétiques ou d'expression génique. Les résultats obtenus montrent une purification efficace de populations cellulaires mitotiques difficiles à obtenir, avec une haute pureté, sur la base d'études approfondies par caryotype et par puces d'expression. Le principal avantage de ce protocole fondé sur des faits par rapport aux méthodes existantes telles que la centrifugation, la filtration ou la sédimentation par gravité est qu'il permet de recueillir en un seul passage la majorité des fractions mitotiques avec une très haute pureté. Les personnes novices dans cette méthode devront combiner des compétences très diverses afin d'effectuer une dissociation efficace des tissus suivie d'un tri cellulaire optimal, ce qui nécessite de bonnes interactions entre la personne préparant les cellules et l'opérateur de cytométrie en flux, ainsi qu'une bonne compréhension des principes fondamentaux de ce protocole, essentielle à la réussite. Le Dr I. Gatun, postdoctorant senior dans notre laboratoire ayant considérablement amélioré ce protocole, démontrera la procédure de dissociation cellulaire.BVN Tores. Notre opérateur de cytométrie en flux vous guidera à travers une configuration optimale pour un tri cellulaire efficace. Dans ce protocole, une dissociation de deux testicules de souris adultes sera démontrée, mais les volumes peuvent être adaptés en conséquence pour des souriceaux ou pour un nombre supplémentaire de testicules.Commencez par ajouter trois millilitres de solution saline tamponnée contenant 120 unités par millilitre de collagénase de type I dans le tube. Une dissociation efficace et complète est cruciale pour une coloration correcte et une bonne récupération des cellules. L'ajout d'une quantité suffisante de G-nase I ainsi que la mise du tube en position horizontale pendant l'agitation sont très importants pour une dissociation efficace du tissu testiculaire. Placez un testicule encapsulé dans un tube de 15 millilitres.Ajoutez 10 microlitres d'ADN1 aux testicules et agitez vigoureusement le tube à la main jusqu'à ce que vous observiez le début de la dissociation des tubules testiculaires. Ensuite, placez le tube horizontalement sur un agitateur rotatif et fixez-le en place ; agitez à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius. Après 15 minutes, laissez décanté verticalement pendant une minute à température ambiante. Utilisez ensuite une pipette jetable pour éliminer le surnageant. Ajoutez trois millilitres de solution saline tamponnée au glucose contenant de la collagénase de type I ainsi que 10 microlitres d'ADN1 au prélèvement.Secouez à nouveau le tube plusieurs fois manuellement. Agitez le tube horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius, puis laissez décanter verticalement pendant une minute à température ambiante, et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de GBSS contenant de la collagénase.Prélevez 50 microlitres de trypsine et 10 microlitres de dase. Retournez le tube plusieurs fois, puis agitez horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius. Après les 15 minutes d'agitation, utilisez une pipette pasteur en plastique jetable à orifice large pour pipeter doucement l'échantillon vers le haut et vers le bas pendant trois minutes.Aucun agrégat ne devrait être visible à ce stade. Ajouter ensuite 30 microlitres de trypsine, 10 microlitres de DNAs one et 40 microlitres de Hulks 3 33 42 resuspendus dans du DMSO. Retourner le tube plusieurs fois.Agiter horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius. Une fois l'agitation de l'échantillon terminée, ajouter 400 microlitres de sérum de veau fœtal et mélanger en retournant le tube afin d'inactiver la trypsine. Pour effectuer la coloration finale, ajouter 50 microlitres de Hoechst 33342 et 10 microlitres d'ADN. Une fois de plus, agiter le tube horizontalement à un maximum de 120 tr/min pendant 15 minutes à 33 degrés Celsius. L'échantillon de testicule dissocié est ensuite passé à travers deux filtres jetables de 40 microns préhumidifiés avec du GBSS, au-dessus d'un tube conique de 50 millilitres. Ajouter cinq microlitres de solution d'iodure de propidium à l'échantillon et mélanger délicatement en pipetant plusieurs fois avec une pipette Pasteur jetable.Ensuite, transférez l'échantillon dans une seringue en plastique de cinq millilitres à l’aide d’une aiguille de 18 g. Puis remplacez l’aiguille de 18 g par une aiguille de 22 g pour l’administration de l’échantillon. Enfin, conservez la seringue sur de la glace et protégez-la de la lumière jusqu’à ce que l’échantillon soit prêt pour le traitement par fax.Pour cette expérience, le tri cellulaire est effectué sur une zone Backin Dixon. Deuxièmement, les conditions de tri cellulaire ont été adaptées à partir de celles utilisées précédemment pour un cytomètre en flux équipé d'un laser à argon ultraviolet de 360 nanomètres et d'un laser à argon de 488 nanomètres. En fin de compte, la configuration du cytomètre en flux devra être optimisée par l'opérateur du trieur cellulaire.Étant donné que le Becton Dixon Aria two U ne possède pas de laser UV, le protocole de détection de la coloration au hawk est adapté en utilisant un laser violet de 405 nanomètres. Le hooks est excité par le laser violet de 405 nanomètres, et un laser bleu de 488 nanomètres est utilisé à la fois pour l'excitation du PI et la détection de la diffusion avant et latérale. En outre, les filtres pour la détection du hos sont modifiés afin de limiter les fuites dues au laser rouge, ce qui améliore la netteté des diagrammes de dispersion.Le laser violet est configuré avec un filtre passe-bande de 450/40 nanomètres pour la détection de l'émission bleue simulée et un filtre passe-bande de 585/42 nanomètres pour l'émission rouge simulée. Un filtre passe-haut de 502 nanomètres est utilisé pour séparer la fluorescence bleue de la rouge. La différence entre l'utilisation de deux jeux de filtres distincts est illustrée ici.Le filtre de 5 85 42 nanomètres donne des populations cellulaires plus compactes que le filtre de 6 30 30 nanomètres. Par conséquent, l'opérateur doit être prêt à essayer différentes combinaisons sur son propre instrument afin d'obtenir le meilleur compromis. Un embout de 100 microns est utilisé avec une fréquence d'entraînement de gouttes de 28 000 gouttes par seconde.Le taux de seuil d'échantillonnage est d'environ 4 000 événements par seconde avec un débit compris entre un et trois pour maintenir une résolution plus élevée. Triez l'échantillon en aliquots d'environ 750 microlitres dispensés à partir de la seringue. Pendant ces pauses, conservez l'échantillon restant dans la seringue sur de la glace et à l'abri de la lumière. Récupérez les échantillons triés dans des tubes de collecte en verre borosilicate de 12 par 75 millimètres contenant 250 microlitres de DMEM supplémenté avec 10 % de FCS.Pour maintenir l'échantillon dans les tubes de collecte à quatre degrés Celsius, utilisez l'option de contrôle de température pendant toute la durée du tri. En outre, utilisez la fonction d'agitation de l'échantillon à 200 tr/min afin d'empêcher la sédimentation de l'échantillon pendant le tri. À chaque fois qu'un aliquot de l'échantillon principal est ajouté, il est important de secouer légèrement les tubes de collecte afin de préserver l'intégrité des cellules recueillies.Des profils représentatifs de faits sont présentés ici, où toutes les étapes majeures de la méiose de type sauvage sont identifiées sur ce diagramme de dispersion, les cellules triées étant indiquées. Une grande quantité de débris, contenant principalement des membranes vides et des queues de spermatozoïdes, est présente dans les testicules adultes. Un profil représentatif au propidium iodure montre une quantité très limitée de cellules positives au propidium iodure dans l'échantillon. La démarche typique est indiquée sur ce profil représentatif de type sauvage hoax 3 33 42 fax.Les différentes populations cellulaires méiotiques qui peuvent être purifiées à l'aide de cette méthode pour des études ultérieures sont indiquées : spermatogonies, préleptotène, leptotène, zygotènes, pachytène, diplotène et spermatides rondes. Ces deux derniers profils proviennent d'un testicule SPO11−/− et d'un testicule de type sauvage de souris âgées de 13 jours. SPO11 est l'endonucléase méiotique qui dirige les cassures double brin vers les sites des points chauds de recombinaison méiotique, et comme observé ici, l'absence de SPO11 entraîne un échec méiotique évident, car aucune étape au-delà du stade leptotène-zygotène précoce du pachytène ne peut être détectée.En revanche, le profil d'un souris mâle de type sauvage âgée de 13 jours montre une forte concentration de cellules zygotiques de leptine. Cette première vague de méiose est plutôt asynchrone, comme on peut le voir clairement. En utilisant cette méthodologie, lors de la réalisation de cette expérience, il est important d'utiliser une quantité suffisante d'ADN.La ville est le centre de tri sans problème. Bien que les chercheurs soient initialement réticents à l'utiliser, l'ajout d'ADN réduira la viscosité de l'échantillon et améliorera la séparation et la coloration des cellules, sans endommager les cellules intactes. La méthode FOX pour l'isolement de cellules mécaniques peut être utilisée dans un large éventail d'applications en aval, telles que, par exemple, l'extraction ADN-ARN pour étudier la dynamique de l'expression génique, ou pour la technique de immunoprécipitation de la chromatine afin d'établir divers profils épigénétiques.

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Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Un nouveau protocole pour la préparation mécanique des suspensions de cellules testiculaires de matériel de rongeurs, en évitant les enzymes et les détergents, est décrite. La méthode est très simple, rapide et reproductible, et rend les suspensions cellulaires de bonne qualité, qui sont adaptés pour le tri de flux et extraction de l'ARN.

Technique simple et efficace pour la préparation de suspensions de cellules testiculaires

Nous décrivons une stratégie de tri pour les spermatides de souris à l’aide de la cytométrie en flux. Les spermatides sont classées en quatre populations très pures : rondes (étapes 1 à 9 de la spermiogenèse), allongées précoces (étapes 10 à 12 de la spermiogenèse), allongées tardives (étapes 13 et 14 de la spermiogenèse) et spermatides allongées (étapes 15 et 16 de la spermogenèse). La coloration de l’ADN, la taille et la granulosité sont utilisées comme paramètres de sélection.

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

Nous rapportons un protocole utilisant les cellules activées par fluorescence de tri pour isoler les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) avec une grande pureté à partir de la moelle osseuse de souris lupus sujettes à des études fonctionnelles de pDC.

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Ce travail décrit la standardisation d'une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d'un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C'est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l'iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Cet article illustre une méthode puissante pour quantifier les mitochondries ou lysosomes dans les cellules vivantes. La combinaison de colorants spécifiques lysosome ou mitochondries avec des anticorps fluorescent conjugués contre marqueurs de surface permet la quantification de ces organites chez les populations de cellules mixtes, comme les cellules primaires récoltées dans des échantillons de tissus, en utilisant cytométrie en flux multicolore.

Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

Présenté ici est un protocole pour enrichir les spermatozoïdes pachytenés, spermatides ronds, et spermatids allongeant des testicules adultes de souris utilisant un gradient discontinu de densité d'albumine de sérum bovin avec l'équipement standard de laboratoire.

Enrichissement des spermatozoïdes pachytenés et des spermatides à partir de testeurs de souris à l'aide d'équipement de laboratoire standard

Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.

Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Pour obtenir des péricytes corticaux cérébraux de souris répondant aux besoins du scRNA-seq, nous présentons un protocole FACS critique basé sur la sélection CD13⁺/CD31⁻. Nos principaux raffinements améliorent considérablement la viabilité cellulaire et l’intégrité de l’ARN, permettant un profilage transcriptomique fiable.

Isolement des péricytes à partir de tissu cortical de souris à l’aide de FACS pour le séquençage unicellulaire

Découvrez la purification de cellules méiotiques de souris par cytométrie en flux. Cette méthode combine dissociation enzymatique et tri FACS pour isoler à haute pureté les fractions méiotiques. Elle permet d'étudier la dynamique du cycle cellulaire méiotique.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

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