Détection de signalisation Effector-Complexes en aval de BMP4 aide In situ PLA, un dosage Ligature Proximité

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser et de quantifier la signalisation BMP dans les cellules de culture tissulaire. Les BMP se lient aux récepteurs à la surface cellulaire et PHOSPHOLATE trois, smad effecteurs, smad un, smad cinq et SMAD huit. Ceux-ci forment des complexes avec quatre et se déplacent vers le noyau où ils orchestrent la transcription.

Ici, nous utilisons le PLA pour visualiser les complexes qui se forment entre les effecteurs endogènes SMA et smad quatre dans des cellules de culture tissulaire avec ou sans stimulation BMP. Cela commence par l’utilisation parallèle de deux anticorps primaires, dont l’un reconnaît les trois effecteurs phosphorylés, smma, et l’autre reconnaît quatre anticorps secondaires appelés sondes PLA, chacun avec un brin d’ADN court unique qui lui est attaché, se lient aux anticorps primaires lorsque les sondes PLA sont à proximité. Les brins d’ADN interagissent par l’ajout ultérieur de deux cercles formant des oligonucléotides d’ADN.

Ceux-ci sont reliés par une ligature enzymatique et forment un cercle qui est amplifié par réplication du cercle roulant après la réaction d’amplification. L’hybridation de sondes oligonucléotidiques complémentaires marquées met en évidence les taches fluorescentes du produit associées à l’amplification de chaque circularisé. Les produits d’ADN sont facilement visibles.

Lorsqu’elles sont observées au microscope à fluorescence, les taches correspondent à des complexes entre effecteur, seds et smad quatre, ce qui signifie une signalisation BMP active dans la cellule. Les principaux avantages du PLA par rapport aux méthodes existantes sont qu’il est facile à utiliser, très sensible et sans bruit de fond, et qu’il peut être utilisé pour quantifier la signalisation BMP active in situ. La voie BMP est essentielle au développement de plusieurs organes et tissus et à des processus tels que la prolifération et la différenciation des cellules souches.

Le PLA peut être utilisé pour répondre à des questions clés concernant la dynamique de signalisation BMP, les niveaux et la localisation subcellulaire, mais peut également être utilisé pour le diagnostic. Parce que cette voie est à l’origine de plusieurs maladies, BLA peut être utilisé pour étudier d’autres composants de transaction de signal de la BMP ou d’autres voies et peut être adapté pour travailler sur des coupes de tissus ou des embryons entiers. Pour commencer l’essai de ligature de proximité in situ, préparez les cultures cellulaires Neuro deux cellules A sont cultivées dans du GMEM complété par 10 % de FBS une fois d’acides aminés non essentiels, une fois de pyruvate et une fois de L glutamine.

Divisez les cellules à l’aide de trypsine et disposez une plaque de 15 000 à 20 000 cellules par puits. Dans une chambre à 16 puits, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après 24 heures.

Remplacez le milieu de culture par des OGM sans sérum supplémenté et incubez pendant deux à trois heures de plus pour les témoins. Conservez trois puits avec des cellules dans des conditions normales de culture et dans des conditions normales après la deuxième incubation. Inhiber la voie BMP en traitant les cellules avec deux micromolaires dorsa morphine ou induire la signalisation en traitant les cellules avec BMP quatre pendant 10 à 60 minutes.

Après la stimulation cellulaire, aspirez le milieu des puits et lavez doucement les cellules avec du PBS pour éviter le détachement cellulaire. Ne pipetez pas le PBS directement sur les cellules. Ensuite, aspirez le PBS et retirez les chambres, mais laissez le silicium autour des puits.

Ajoutez 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé et filtré dans les puits et incubez pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Après la fixation, lavez les cellules avec du PBS pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation dans un bocal copin. Répétez le lavage deux fois pour un total de trois lavages.

Ensuite, perméez les cellules avec 0,5 % de Triton X 100 dans du PBS dans un bocal à copin et incubez-les pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Ensuite, lavez les cellules avec 0,05 % entre 20 et TB S3 fois pendant cinq minutes par lavage avec agitation dans un bocal d’accouplement. Lancez la procédure de blocage en tapotant la glissière pour retirer la solution de lavage finale.

En prenant soin de ne pas laisser les cellules sécher. Ajoutez une goutte de DUO link to blocking solution à chacun. Bien incuber les cellules dans une solution bloquante pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée composée d’une boîte de pointes de pipette vide avec de l’eau distillée.

Pour préparer les solutions d’anticorps primaires, diluer l’anti-phospho smad 1, 5, 8 et l’anti-SMAD, quatre, un à 100, en duo link deux, diluant anticorps. Utilisez chaque anticorps seul et en combinaison. Maintenant, tapotez la lame pour retirer la solution bloquante de la lame et ajoutez 40 microlitres de solutions d’anticorps dans les puits appropriés et le contrôle négatif Avec diluant uniquement peut être inclus.

Faites cette étape rapidement afin que les cellules ne se dessèchent pas. Maintenant, incubez les lames à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée pendant une heure. Pendant l’incubation, diluer les deux sondes de PLA dans du diluant.

Pour chaque réaction, mélangez huit microlitres de chaque sonde et 24 microlitres de diluant de sorte que les sondes soient diluées un à cinq dans la solution. Après l’incubation d’une heure, tapotez la solution d’anticorps primaire et lavez les lames deux fois avec Duo link sur Wash Buffer a pendant cinq minutes chacune à température ambiante avec agitation dans un bocal d’accouplement. Une fois les lavages terminés, tapotez le tampon de lavage A restant des lames et ajoutez 40 microlitres de la solution de sonde PLA à chacune.

Eh bien, maintenant, incubez les lames à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée. Pendant une heure, le duo se connecte à la crosse de ligature et prépare un volume pour le mélange de ligature. En vortex d’abord, le duo se lie à la crosse ligature et en le diluant une fois dans de l’eau de haute pureté.

Gardez à l’esprit que l’enzyme Ligase est ajoutée de un à 40 dans cette solution et que 40 microlitres du mélange sont nécessaires par puits. Après l’incubation, tapochez la solution de sonde PLA des lames et lavez-les deux fois avec le tampon de lavage. A pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation dans un bocal d’accouplement lors du dernier lavage, prélever les sorties de Duo link Ligase dans un bloc de congélation, puis les ajouter à la solution de ligature jusqu’à une dilution finale de un à 40 et Vortex.

Tapotez maintenant le volume final du tampon de lavage A des lames et ajoutez 40 microlitres de ligature. Mélanger avec de l’enzyme à chacun pendant l. Incuber les lames dans une chambre d’humidité préchauffée pendant 30 minutes.

À 37 degrés Celsius, décongelez le stock d’amplification DUO link et préparez-vous à l’étape d’amplification pendant l’incubation en diluant le stock d’amplification DUO Link dans de l’eau de haute pureté pour garder les réactifs à l’abri de la lumière car ils sont sensibles à la lumière. Une fois l’étape de ligature terminée, tapotez la solution et lavez les lames deux fois avec le tampon de lavage A pendant deux minutes chacune à température ambiante avec agitation dans un bocal d’accouplement pendant le dernier lavage, ajoutez la polymérase duo link à la solution d’amplification jusqu’à une dilution finale de 1, 2, 80 et vortex. Après avoir tapoté le tampon de lavage, ajoutez 40 microlitres de l’amplification mélangée à chaque puits et incubez les lames dans une chambre d’humidité préchauffée sombre pendant 100 minutes à 37 degrés Celsius.

Une fois l’incubation par amplification terminée, prélevez la solution de polymérase des lames et lavez-les dans le tampon de lavage B deux fois pendant 10 minutes par lavage avec de la végétation dans un bocal de couplage, gardez les lames à l’abri de la lumière pendant cette étape car les réactifs sont sensibles à la lumière. Faites suivre les deux lavages d’un trempage dans 0,1 fois le tampon de lavage B.Retirez maintenant complètement le silicium du 16. Puits glisser alors à environ 40 microlitres du duo.

Reliez le support de montage avec dappy à une lamelle et placez-le doucement sur les échantillons, en appuyant légèrement pour qu’il n’y ait pas de bulles d’air sous la lamelle, fixez et scellez la lamelle sur la lame à l’aide de vernis à ongles, en laissant au moins 15 minutes avant l’imagerie. Il s’agit d’images confocales de cellules qui ont été traitées avec deux micromolaires dorsa morphine, un inhibiteur de la voie BMP ou traitées avec 25 nanogrammes par millilitre. BMP quatre pendant 60 minutes.

Des anticorps contre Phospho Smad 1 58 et Smad 4 ont été utilisés pour détecter les complexes actifs de Smad et sont considérés comme des taches rouges. La cellule nucléaire soutenue bleue par dpi. Les signaux PLA ont été comptés avec le logiciel DUO link image tool et le nombre moyen de points dans le noyau par cellule est présenté dans le graphique.

Aucune coloration n’est observée lorsque l’un ou l’autre des anticorps primaires est utilisé seul, ce qui indique qu’il n’y a pas de recherche de fond des sondes PLA et de ligature ultérieure des oligonucléotides. De même, aucune tache n’est détectée dans un autre contrôle négatif émettant les deux anticorps primaires. Dans les cellules neuro deux A cellules SDS page immuno blot révèle la phospho liée SMAD 1 5 8 dans les cellules non traitées et traitées BMP.

Cependant, les niveaux de phospho smad sont nettement réduits dans les cellules traitées avec de la morphine dorsale. L’anticorps contre le PCNA permet de contrôler la charge. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de suivre les étapes et la configuration que nous suggérons pour obtenir des résultats en moins de six heures après la fixation des cellules.

En résumé, les étapes sont le blocage de l’incubation primaire des anticorps, l’incubation des probs PLA, l’amplification de la ligature, le montage d’une imagerie.