Détection de signalisation Effector-Complexes en aval de BMP4 aide In situ PLA, un dosage Ligature Proximité

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser et de quantifier la signalisation BMP dans des cellules en culture tissulaire. Les BMP se lient à des récepteurs situés à la surface cellulaire et PHOSPHORYLENT trois effecteurs Smad : Smad1, Smad5 et SMAD8. Ces derniers forment des complexes avec Smad4 et migrent vers le noyau, où ils orchestrent la transcription.

Ici, nous utilisons le PLA pour visualiser les complexes formés entre les effecteurs SMA endogènes et la protéine smad quatre dans des cellules en culture, en présence ou en l'absence de stimulation par la protéine morphogénétique osseuse (BMP). Cette méthode commence par l'utilisation parallèle de deux anticorps primaires, dont l'un reconnaît les trois effecteurs phosphorylés de smma, et l'autre reconnaît smad quatre. Des anticorps secondaires appelés sondes PLA, chacun portant une courte séquence d'ADN fixée, se lient aux anticorps primaires lorsque les sondes PLA sont en proximité. Les brins d'ADN interagissent grâce à l'ajout ultérieur de deux oligonucléotides d'ADN formant un cercle.

Ils sont joints ensemble par ligature enzymatique et forment un cercle qui est amplifié par réplication en roue de chariot après la réaction d'amplification. L'hybridation de sondes oligonucléotidiques complémentaires marquées met en évidence les taches fluorescentes associées à l'amplification de chaque produit circulaire. Les produits d'ADN sont facilement visibles.

Lorsqu'elles sont observées au microscope à fluorescence, les taches correspondent à des complexes entre l'effecteur, les seds et smad quatre, qui indiquent une signalisation BMP active dans la cellule. Les principaux avantages de la PLA par rapport aux méthodes existantes sont sa facilité d'utilisation, sa grande sensibilité, son absence de fond, et sa capacité à quantifier la signalisation BMP active in situ. La voie BMP est essentielle au développement de plusieurs organes et tissus, ainsi qu'à des processus tels que la prolifération et la différenciation des cellules souches.

Le PLA peut être utilisé pour répondre à des questions essentielles concernant la dynamique, les niveaux et la localisation subcellulaire de la signalisation BMP, mais aussi à des fins diagnostiques. Étant donné que cette voie est impliquée dans plusieurs maladies, le BLA peut être utilisé pour étudier d'autres composants de la transmission du signal dans la voie BMP ou d'autres voies, et peut être adapté pour être appliqué sur des sections de tissus ou des embryons entiers. Pour commencer le test de ligature in situ par proximité, préparez les cultures cellulaires : les cellules Neuro2A sont cultivées dans du GMEM supplémenté avec 10 % de FBS, des acides aminés non essentiels à 1×, du pyruvate à 1× et du L-glutamine à 1×.

Détacher les cellules à l’aide de trypsine et ensemencer de 15 000 à 20 000 cellules par puits. Dans une lamelle-chambre à 16 puits, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après 24 heures.

Remplacez le milieu de culture par du GMEM sans sérum supplémenté et incubez pendant deux à trois heures supplémentaires pour les témoins. Conservez trois puits avec des cellules en culture et conditions normales après la deuxième incubation. Inhibez la voie BMP en traitant les cellules avec deux micromoles de dorsomorphine ou induisez la signalisation en traitant les cellules avec le BMP4 pendant 10 à 60 minutes.

Après la stimulation des cellules, aspirez le milieu des puits et lavez délicatement les cellules avec du PBS afin d'éviter le détachement cellulaire. N'ajoutez pas le PBS directement sur les cellules à l'aide d'une pipette. Aspirez ensuite le PBS et retirez les chambres, mais laissez le silicone autour des puits.

Ajouter 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé et filtré dans les puits et incuber pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Après la fixation, laver les cellules avec du PBS pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation dans un bocal Coplin. Répéter le lavage deux fois pour un total de trois lavages.

Ensuite, rendre les cellules perméables avec du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS dans un bocal Coplin et les incuber pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Puis laver les cellules trois fois avec du Tween 20 à 0,05 % dans du TBS pendant cinq minutes par lavage avec agitation dans un bocal d'hybridation. Commencer la procédure de blocage en tapotant la lame pour éliminer la dernière solution de lavage.

Veiller à ne pas laisser les cellules sécher. Ajouter une goutte de DUO link à la solution de blocage à chaque puits. Incuber les cellules dans la solution de blocage pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée, constituée d'une boîte vide pour embouts de pipette contenant de l'eau distillée.

Pour préparer les solutions d'anticorps primaires, diluez l'anti phospho smad 1 5 8 et l'anti SMAD four un à 1/100 dans le diluant d'anticorps Duo Link deux. Utilisez chaque anticorps seul et en combinaison. Tapez maintenant sur la lame pour éliminer la solution de blocage et ajoutez 40 microlitres des solutions d'anticorps dans les puits appropriés ; un contrôle négatif avec uniquement le diluant peut être inclus.

Effectuez cette étape rapidement afin que les cellules ne s'assèchent pas. Incubez ensuite les lames à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée pendant une heure. Pendant l'incubation, diluez les deux sondes PLA dans le diluant.

Pour chaque réaction, mélanger huit microlitres de chaque sonde et 24 microlitres de diluant afin que les sondes soient diluées au 1/5 dans la solution. Après une heure d'incubation, éliminer délicatement la solution d'anticorps primaire et laver les lames deux fois avec le Duo link vers le tampon de lavage A, cinq minutes chacun, à température ambiante avec agitation dans un bain d'accouplement. Une fois les lavages terminés, éliminer délicatement le tampon de lavage A restant sur les lames et ajouter 40 microlitres de la solution de sondes PLA sur chacune.

Incubez désormais les lames à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée. Pendant une heure, diluez le lot de liaison duo et préparez un volume pour le mélange de liaison. Commencez par vortexer le lot de liaison duo, puis diluez-le à une concentration d’un fois dans de l’eau hautement purifiée.

Tenez compte du fait que l'enzyme ligase est ajoutée au dilution de un à quarante dans cette solution et que 40 microlitres du mélange sont nécessaires par puits. Après l'incubation, retirez délicatement la solution de sonde PLA des lames et lavez-les deux fois avec le tampon de lavage. Pendant le dernier lavage, agitez pendant cinq minutes à température ambiante dans un bain d'incubation. Sortez la ligase Duo link d'un bloc de congélation, puis ajoutez-la à la solution de ligature pour obtenir une dilution finale de un à quarante, et vortexez.

Tapotez maintenant pour éliminer le volume final de tampon de lavage A à partir des lames et ajoutez 40 microlitres de la réaction de ligature. Mélangez avec l'enzyme sur chaque lame. Incubez les lames dans une chambre d'humidité préchauffée pendant 30 minutes.

Décongeler le stock d'amplification DUO link à 37 degrés Celsius et le préparer pour l'étape d'amplification pendant l'incubation en diluant le stock d'amplification DUO link dans de l'eau de haute pureté à une concentration d'une fois. Garder les réactifs à l'abri de la lumière car ils sont sensibles à la lumière. Une fois l'étape de ligature terminée, éliminer la solution par tapotement et laver les lames deux fois avec le tampon de lavage A pendant deux minutes chacune à température ambiante sous agitation dans un bain d'hybridation ; lors du dernier lavage, ajouter la polymérase duo link à la solution d'amplification pour obtenir une dilution finale de 1/280 et vortexer. Après avoir éliminé le tampon de lavage par tapotement, ajouter 40 microlitres du mélange d'amplification dans chaque puits et incuber les lames dans une chambre humide préchauffée et à l'abri de la lumière pendant 100 minutes à 37 degrés Celsius.

Une fois l'incubation de l'amplification terminée, retirez délicatement la solution de polymérase des lames et rincez-les deux fois dans le tampon de lavage B, 10 minutes par rinçage, avec agitation dans un bocal de couplage. Gardez les lames à l'abri de la lumière pendant cette étape, car les réactifs sont sensibles à la lumière. Après ces deux lavages, plongez brièvement les lames dans du tampon de lavage B dilué 10 fois. Retirez ensuite complètement le silicone de la lame à 16 puits, puis ajoutez environ 40 microlitres du duo.

Relier le milieu de montage avec une goutte à une lame couvre-objet et la placer délicatement sur les échantillons, en appuyant légèrement pour qu’il n’y ait aucune bulle d’air sous la lame couvre-objet ; fixer et sceller la lame couvre-objet sur la lame porte-objet à l’aide de vernis à ongles, en laissant au moins 15 minutes avant l’imagerie. Il s’agit d’images de microscopie confocale de cellules traitées avec deux micromoles par litre de dorsomorphine, un inhibiteur de la voie BMP, ou traitées avec 25 nanogrammes par millilitre de BMP quatre pendant 60 minutes.

Des anticorps dirigés contre la protéine Smad 1/5/8 phosphorylée et contre la Smad 4 ont été utilisés pour détecter les complexes Smad actifs, visibles sous forme de points rouges. Les noyaux cellulaires sont colorés en bleu par le DAPI. Les signaux PLA ont été dénombrés à l'aide du logiciel d'analyse d'image DUO link, et le nombre moyen de points présents dans le noyau par cellule est présenté sur le graphique.

Aucune coloration n'est observée lorsque l'un des anticorps primaires est utilisé seul, ce qui indique qu'il n'y a pas de signal de fond provenant des sondes PLA ni de ligation ultérieure des oligonucléotides. De même, aucun point n'est détecté dans un autre contrôle négatif contenant les deux anticorps primaires. Chez les cellules Neuro-2A, l'immunotransfert par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS révèle la présence de SMAD1/5/8 phosphorylé dans les cellules non traitées et dans celles traitées au BMP.

Cependant, les niveaux de Smad phosphorylé sont nettement réduits dans les cellules traitées avec de la morphine dorsale. L'anticorps dirigé contre la PCNA fournit un contrôle de chargement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment suivre les étapes et le montage que nous proposons afin d'obtenir des résultats en moins de six heures après la fixation des cellules.

En résumé, les étapes sont le blocage, l'incubation avec l'anticorps primaire, l'incubation avec les sondes PLA, la ligature, l'amplification et le montage pour l'imagerie.