Génération de plantes dans les composites Medicago truncatula Utilisées pour les dosages nodulation

Bonjour, je m'appelle Oliver Yu au centre des sciences végétales Dan. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment produire des plantes Ute Compote par Agrobacterium Ogn. Cette technique a été introduite au centre Dan par le Dr Chris Taylor, actuellement à l'université d'État de l'Ohio.

Plusieurs de mes anciens membres d'équipe ont amélioré ces techniques au fil des années et aujourd'hui, mes membres actuels d'équipe, le Dr Stone et Mao, ont réalisé cette vidéo afin de montrer comment sont produits les plans composites Harry Root. Les Agrobacterium ZOS sont très similaires à l'Agrobacterium tumefaciens en ce sens qu'ils introduisent de l'ADN étranger dans les plantes, mais les ZOS peuvent induire une formation racinaire plus importante des tissus de type sauvage, conduisant à la formation de plantes composites telles que celle-ci. Ainsi, sur ces plantes composites, certaines racines sont transgéniques tandis que les parties aériennes restent de type sauvage.

Par conséquent, cette technologie ne produira pas de graines transgéniques. Toutefois, il existe trois avantages majeurs des plantes à forte concentration de campé en racine qui rendent cette technologie très utile. Premièrement, de nombreuses espèces végétales, en particulier les espèces dichotomes, peuvent être transformées par l'agent bactérien agro.

Deuxièmement, nous n'avons pas besoin d'établir une culture de tissus avant la transformation. Nous pouvons prélever de nombreuses parties de plantes, telles que des semis, des pousses et des co, pour générer directement des plantes campy. Enfin, nous pouvons obtenir des tissus racinaires transgéniques en quelques semaines.

Pour les transformations transgéniques des cargaisons de soja et de medic, nous pouvons obtenir des racines transgéniques en seulement trois semaines, ce qui est plus rapide qu'une transformation OPIS. Dans l'ensemble, la technologie des plantes à haute cytofréquence racinaire est un outil très utile pour étudier les fonctions des gènes et les phénotypes liés aux racines. Non. Bonjour, je m'appelle Ong.

Bonjour, je m'appelle, voici mon cameraman Bill. Aujourd'hui, nous allons présenter le protocole de la plante composite Harry root. Oui, nous utilisons ce protocole dans plusieurs de nos projets.

Déjà, nous avons commencé, oui. Oui. Pour notre démonstration, nous utiliserons meta cargo Tula comme exemple. Ce sont des gousses mûres de meta cargo.

Placez les gousses dans un récipient de broyage, puis broyez-les avec un mouvement long et ferme. Séparez les graines des gousses en secouant doucement ; placez les graines dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Ajoutez ensuite cinq millilitres d'acide sulfurique concentré.

Effectuer très soigneusement la scarification. Cela prend environ 10 minutes. Vortexer le tube deux à trois fois avec de l'acide.

Pendant le traitement acide, l'enveloppe des graines deviendra jaune. Éliminer l'acide sulfurique du tube et rincer les graines au moins cinq fois avec de l'eau stérile. Faire tremper les graines dans de l'eau déionisée à température ambiante pendant six heures, puis les conserver à quatre degrés Celsius pendant deux jours.

Pour synchroniser la germination, répartir 20 à 30 graines sur du papier filtre humide dans la boîte de Pétri. Après cinq à six jours, transférer les jeunes plantules dans le sol, puis les faire croître dans la serre pendant quatre semaines.

Pour la transformation de plantes composites, nous utilisons généralement la souche d'agrobactérie Zony K 5 99. Le vecteur d'appoint ou le vecteur binaire peut être introduit dans la souche K 5 99 selon le protocole standard de transformation de l'agrobactérie tumefaciens. Inoculer l'agrobactérie, la faire croître à 30 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures ; après la période de croissance, recueillir les cellules en plaçant la solution de culture dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.

Faites-le tourner dans la centrifugeuse à 5 000 G pendant 30 minutes. Resuspendez le culot dans une solution nutritive exempte d'azote. Assurez-vous de diluer les cellules d'agrobactéries à 0,3 à une DO 600.

Cette concentration est importante pour une transformation maximale. Nous utilisons la roche volcanique comme matrice de support. L'utilisation de ce matériau est essentielle pour une transformation à haute fréquence.

Découper la paroi rocheuse à la bonne taille. Boucher. Percer un trou en haut d'environ un centimètre et demi à deux centimètres de diamètre. À l'aide d'une pipette, ajouter cinq millilitres de solution de Agrobacterium Zony resuspendue dans chaque bouchon.

Sélectionnez une section de tige comportant deux à trois bourgeons axillaires et effectuez une coupe oblique. Insérez les sections de la plante dans l'ouverture du mur rocheux. Placez les plantes coupées dans une chambre de croissance ou sur un banc de laboratoire pendant trois semaines.

Ajoutez cinq millilitres de solution nutritive dans chaque alvéole toutes les 10 jours. Après trois semaines, les racines se régénèrent à partir du côté coupé. Imbibez la plante d'eau.

Retirez soigneusement la paroi rocheuse ramollie sans endommager les racines. Veillez à retirer entièrement la paroi rocheuse. Vous pouvez transférer les plantes composites à racines velues dans du sable ou de la perlite. Pour les expériences de symbiose, faites croître le rhizobium dans un milieu d'extrait de levure et de manitol pendant sept jours à 30 degrés Celsius.

Recueillir les cellules de zoïa resuscitées. Suspendre le culot avec la solution nutritive exempte d'azote. Diluer la solution à 0,08 à une DO 600.

Ajouter 10 millilitres de solution ZOA à chaque culture végétale composite, puis faire pousser la plante pendant deux à trois semaines supplémentaires afin de permettre la formation de nodules. Retirer le sable des plantes composites en les déterrant et en les rinçant. Utiliser l'expression de la protéine fluorescente verte pour vérifier la racine transgénique.

Vous utiliserez un microscope à fluorescence pour cela. Toutes nos constructions de racines capillaires possèdent une cassette GFP constitutive permettant de sélectionner les lignées transgéniques. Cette image montre les plantes composites transgéniques à racines capillaires exprimant GFP observées au microscope à fluorescence.

Les racines transgéniques présentant une fluorescence verte plus intense sont faciles à distinguer des racines non transgéniques. Des nodosités se forment dans la racine touffue des plantes composites. Voici le protocole complet.

Encore une fois, la génération de plantes composites à racines capillaires constitue une méthode rapide et simple pour obtenir de grandes quantités de tissu transgénique, en particulier pour les espèces diploïdes. Bien que cette méthode ne permette pas d'obtenir de graines transgéniques, elle peut produire du matériel transgénique en quelques semaines. Elle est particulièrement adaptée aux plantes pour lesquelles l'établissement de cultures de tissus et la transformation posent des difficultés.

Au fil des années, nous avons utilisé cette technologie pour étudier les fonctions des gènes, les fonctions des promoteurs, les microARN, le développement des racines et des racines latérales, la réponse au stress défensif et antibiotique, la nodulation et d'autres processus symbiotiques. Nous avons analysé la réponse hormonale, le profilage métabolique, le profilage génique et l'analyse protéomique à l'aide de plantes composites racinaires supérieures. Nous espérons que cette vidéo vous aidera à adapter ce système à votre espèce préférée.

Vous êtes invités à nous contacter pour toute question relative à cette technologie et bonne chance.