Name: Isolement des Drosophila melanogaster Testicules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Apprenez à isoler rapidement les testicules de mâles Drosophila melanogaster âgés de zéro à trois jours. Cette méthode utilise des aiguilles de dissection et du PBS froid pour préserver l'intégrité tissulaire.

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Les auteurs remercient Vasia Vagin pour l&#39;introduction de cette technique dans notre laboratoire.

<ol><li> Faire une lame de microscope en verre avec un fond noir: Couper papier 20 # blanc à la même taille que la lame du microscope. Couleur d'un côté du papier noir glisser-taille à l'aide d'un marqueur permanent (par exemple, Sharpie). Appliquez la colle blanche (Elmer) pour le côté noir et faire adhérer le papier à la diapositive. La lame peut être réutilisé. Utiliser ¾ "ruban d'étiquettes (Fisherbrand), sécuriser la lame de microscope, côté verre en place, au pad volée CO 2 pour le fixer en place. </li><li> Recueillir 0-3 jours mouches vieux mâle. </li><li> Préparer un seau de glace, un tampon phosphate salin (PBS), aiguilles à dissection. </li><li> Anesthésier 50-100 mouches en utilisant un flux de CO 2 et de les transférer de la bouteille ou le flacon au pad volent près de la lame de microscope. </li><li> Pipeter ~ 50 ul PBS glacé dans une chute au milieu de la lame de microscope. </li><li> Doucement ramasser une mouche mâle avec la dissection d'aiguille par immersion de l'aiguille de dissection dans du PBS, toucher doux du côté ventral (par exemple, près des ailes) de la mouche avec l'aiguille qu'il place dans la goutte de PBS. </li><li> Placer une aiguille sur le milieu de la volée, entre le thorax et l'abdomen, en appuyant fermement. Placer l'autre aiguille entre la sixième (A6) et septième (A7) segments abdominaux (les rayures deuxième et troisième à partir du bas), puis tirer l'abdomen loin du thorax. </li><li> Taquiner les testicules à part d'autres organes, en particulier l'intestin. Surtout dans des mutants de blanc, les testicules et l'intestin se ressemblent. Les principales différences sont que les testicules viennent toujours par paire, chaque testicule est un motif en spirale et est plus blanche que les intestins. </li><li> Stocker les testicules dans PBS glacé dans un tube à centrifuger en polypropylène. </li></ol> Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vue dorsale du système reproducteur masculin, à partir de flybase.org/reports/FBim0000074.html. FlyBase attribution:... "Après la figure 38 A à la page 508 de Miller (1950) A. Miller L'anatomie interne et de l'histologie de l'imago de Drosophila melanogaster, dans M. Demerec, rédacteur en chef, biologie de la drosophile, chapitre 6, pages 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, édition fac-similé, 1994. Copyright 1994 par le Cold Spring Harbor Laboratory Press. Utilisé avec l'aimable autorisation de Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) de presse. Voir <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> . "

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Nous fournissons un protocole pour isoler les testicules du mâle adulte de Drosophila melanogaster. Parce que la technique nécessite la coordination de deux de ses mains, la compétence vient seulement avec la pratique.

<table><tbody><tr><td>Aiguille de dissection</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Lames microscopiques, simples</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Lampe de microscope</td><td>Outil</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Outil</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Système complet Benchtop Flowbuddy</td><td>Outil</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Humidificateur à bulles</td><td>Outil</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de remplissage à bille</td><td>Outil</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Ruban étiquette &amp;#190;&amp;#8221;</td><td>Consommable</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des drosophila melanogaster testicules

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Les testicules de Drosophila melanogaster fournissent un modèle important pour l&#39;étude de la maintenance des cellules souches et la différenciation, la méiose, et soma-germinale interactions. Les testicules sont généralement isolées des mâles adultes 0-3 jours après l&#39;éclosion de la coque de nymphose. Les testicules des mouches de type sauvage sont facilement distingués des autres tissus, car ils sont jaunes, mais les testicules de blanc mouches mutantes, un fond génétique commun des expériences en laboratoire sont similaires dans les deux formes et couleurs à l&#39;intestin voler. Effectuer une dissection sur une lame de microscope en verre avec un fond noir rend l&#39;identification des testicules considérablement plus facile. Les testicules sont retirés de la mouche à l&#39;aide d&#39;aiguilles de dissection. Comparé à des protocoles qui utilisent des pinces pour la dissection des testicules, notre méthode est beaucoup plus rapide, permettant à un individu bien pratiqué la dissection des testicules de 200 à 300 de type sauvage mouches par heure, ce qui donne 400-600 testicules. Testicules de mouches blanches ou de mutants qui réduisent la taille des testicules sont plus difficiles à disséquer et généralement le rendement de 200 à 400 testicules par heure.

Drosophila melanogaster testicules peuvent être rapidement et efficacement isolées des mâles adultes utilisant des aiguilles à dissection. Avec la pratique, on peut facilement isoler dans un ou deux jours d&#39;un montant de testicules suffisant pour l&#39;analyse d&#39;ADN ou d&#39;ARN par séquençage à haut débit ou plus des méthodes traditionnelles de biologie moléculaire ou de protéines pour des dosages d&#39;anticorps ou à base d&#39;enzymes.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

Les testicules de Drosophila melanogaster constituent un modèle important pour l'étude du maintien et de la différenciation des cellules souches, de la méiose et des interactions soma-germinale...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les testicules de drosophiles mâles de type *Drosophila melanogaster* âgées de zéro à trois jours. Cette opération s'effectue en anesthésiant les mouches mâles et en disséquant leurs testicules dans une goutte de PBS froid sous un microscope, à l'aide de deux aiguilles de dissection, en tirant l'abdomen de la mouche vers l'extérieur par rapport au thorax.Enfin, séparez délicatement les testicules du reste du tissu et récupérez-les pour les utiliser dans diverses techniques analytiques telles que l'immunofluorescence, la coloration ou l'isolement d'ARN total et de protéines. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'identification des testicules disséqués peut être difficile à apprendre, étant donné qu'ils sont peu distincts de l'intestin. La procédure sera démontrée par Shemei Ma, technicienne de mon laboratoire.Commencez par préparer un seau rempli de glace, des aiguilles de dissection et environ 100 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Placez le PBS dans le seau à glace pour le refroidir. Préparez une lame de microscope avec un fond noir en découpant du papier blanc de 20 livres pour qu’il s’adapte à la lame.Ensuite, coloriez un côté en noir. À l’aide d’un marqueur indélébile, collez la feuille en place sur la lame et fixez la lame sur le coussin de CO2. Sous un microscope stéréoscopique, anesthésiez un échantillon de mouches âgées de zéro à trois jours à l’aide d’un courant de CO2, puis versez-les sur le coussin.Près de la lame de microscope fixée, identifier les mouches mâles à leurs crochets d'accouplement caractéristiques de couleur foncée et en trier entre 50 et 100. Déposer environ 50 microlitres de PBS glacé au centre de la lame de microscope, en formant une goutte. Prélever une mouche mâle en plongeant une aiguille de dissection dans la goutte de PBS, puis en touchant délicatement la face ventrale de la mouche, ce qui la fait adhérer à l'aiguille.Placer la drosophile dans la goutte de PBS, puis appuyer fermement avec une aiguille entre le thorax et l'abdomen de l'insecte. Appuyer avec l'autre aiguille entre les sixième et septième segments abdominaux, puis tirer l'abdomen vers l'extérieur, loin du thorax. Séparer délicatement les testicules des autres organes, en particulier de l'intestin, qui peut avoir un aspect similaire, afin de faciliter la distinction entre les testicules et l'intestin.Rappelez-vous que les testicules apparaissent toujours par paires, ont une forme spiralée caractéristique et sont plus blancs que le tissu intestinal. Récoltez les testicules dans un tube de microcentrifugeuse contenant du PBS glacé et conservez-les sur de la glace, où ils peuvent être stockés pendant plusieurs heures. Une fois maîtrisée, cette procédure permet de disséquer une drosophile en moins d'une minute.D'autres méthodes, comme le séquençage profond des petits ARN silencieux ou des microARN, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment le répertoire des ARN change-t-il dans une mouche mutante particulière ?

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L&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; Drosophila</em&gt; Folliculo Isolation

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Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

Le but de ce protocole est d’analyser la division cellulaire dans les tissus intacts par microscopie cellulaire vivante et fixe à l’aide de spermatocytes méiotiques Drosophila. Le protocole démontre comment isoler des testicules entiers et intacts des larves de Drosophila et des pupes précoces, et comment les traiter et les monter pour la microscopie.

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Immunomarquage de testicules de drosophiles de mont entier pour l’analyse confocale 3D de grands spermatocytes

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Apprenez à isoler rapidement les testicules de mâles Drosophila melanogaster âgés de zéro à trois jours. Cette méthode utilise des aiguilles de dissection et du PBS froid pour préserver l'intégrité tissulaire.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

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