Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des embryons de souris E 8,5 pour une utilisation dans des tests de chromatine, d'immunoprécipitation ou sur puce. Cela est réalisé en isolant d'abord les embryons de souris et en préparant des suspensions de cellules uniques. La deuxième étape de la procédure consiste à réticuler chimiquement les protéines liées à l'ADN avec l'ADN génomique, suivie d'une sonication pour fragmenter l'ADN.

La troisième étape de la procédure consiste à immunoprécipiter les complexes protéine-chromatine et à isoler l'ADN purifié. La dernière étape de la procédure consiste à analyser l'ADN immunoprécipité purifié par PCR conventionnelle ou par PCR quantitative en temps réel. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant les interactions des protéines avec les séquences régulatrices de gènes spécifiques de la différenciation au cours de l'initiation du programme de différenciation dans les tissus et organes en développement.

Ce semestre peut aider à répondre à de bonnes questions concernant l'initiation du programme de différenciation durant l'embryogenèse, grâce à l'identification de facteurs régulateurs interagissant avec les séquences régulatrices de gènes spécifiques de la différenciation au moment où ceux-ci deviennent compétents pour la transcription. Pour commencer cette procédure, les cornes utérines sont prélevées sur une souris sacrifiée au jour embryonnaire 8,5. Conformément à un protocole approuvé, le tissu est placé dans une boîte de Pétri contenant un milieu de coupe frais à l’aide de ciseaux.

Prélevez séparément chaque site d'implantation et placez-les dans une boîte de Pétri contenant du milieu de dissection frais afin d'éviter l'excès de sang. À l'aide de la pince, retirez la couche utérine de chaque site d'implantation pour exposer le décidua et isoler les embryons individuels à l'aide de la pince. À ce stade du développement, les embryons sont entourés par le sac vitellin pariétal, qui est en contact avec le tissu décidual, le sac vitellin viscéral et l'amnios.

L'amnios est une membrane transparente qui est en contact direct avec l'embryon. Le sac vitellin viscéral se situe entre l'amnios et le sac vitellin pariétal et se distingue facilement chez les embryons de 8,5 à 9,5 jours par la présence de vaisseaux sanguins proéminents qui nourrissent l'embryon. Retirer chaque embryon de ses membranes environnantes et le transférer individuellement dans une nouvelle plaque contenant du milieu de dissection afin d'éliminer l'excès de sang.

Ensuite, transférez chaque embryon dans un tube einor de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de milieu de dissection. L'homogénéisation de l'embryon isolé commence par l'ajout de 200 microlitres de collagénase. Ajoutez la solution de type deux à chaque tube einor contenant les embryons.

Agiter doucement les échantillons dans un agitateur à 37 degrés Celsius à 100 tr/min pendant 20 minutes. Ensuite, resuspendre les échantillons en tapotant pour briser les agrégats cellulaires. Appliquer la suspension cellulaire sur le dessus d'un filtre stérile pour cellules de taille de maillage de 40 microns placé au-dessus d'un tube eppendorf de 1,5 millilitre.

Appliquez immédiatement 600 microlitres de DPBS 1X à température ambiante sur le dessus du filtre à cellules pour terminer la séparation. Une fois la suspension filtrée, jetez le filtre à cellules et centrifugez les échantillons à 4 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminez les surnageants reus.

Suspendez chaque culot dans un millilitre de DPBS 1X à température ambiante. Ensuite, centrifugez les échantillons à 4 000 ×g pendant une minute à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant pour la deuxième fois, resuspendez chaque culot dans 200 microlitres de milieu de dissection à température ambiante. Réalisez la réticulation de la chromatine en ajoutant 5,6 microlitres de formaldéhyde à 37 % aux échantillons de 200 microlitres, afin d'obtenir une concentration finale de 1 % de formaldéhyde.

Incuber les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante. Après l'incubation, centrifuger les échantillons à 4 000 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et éliminer le surnageant. Resuspendre les cellules dans du D-P-B-S froid à 1 X contenant 80 microlitres par millilitre de cocktail d'inhibiteurs de protéases (PIC). Puis centrifuger les échantillons à 4 000 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir éliminé le surnageant, les échantillons peuvent être congelés à moins 80 degrés Celsius et restent stables plusieurs mois avant la sonication. Décongeler le culot cellulaire congelé sur de la glace ou placer le culot obtenu à l'étape précédente sur de la glace. Resuspendre le culot cellulaire dans 100 microlitres de tampon de lyse SDS à température ambiante après la resuspension. Ajouter 100 microlitres supplémentaires de tampon de lyse SDS à température ambiante et resuspendre l'échantillon par pipetage et inversion.

Incubez la suspension cellulaire sur de la glace pendant 10 minutes. Après l'incubation, préparez l'appareil pour cisailler l'ADN réticulé entre 200 et 500 paires de bases. Dans cette démonstration, un DIO geno bio rupture UCD 200 est utilisé.

Soniquez l'échantillon entouré d'un mélange glace-eau. Veillez à ne pas dépasser quatre degrés Celsius ni à le laisser geler avant la centrifugation. Soniquez l'échantillon à 14 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube DPH prérefroidi sur glace. Répartissez l'échantillon soniqué en un maximum de cinq aliquotes. Conservez une aliquote à moins 20 degrés Celsius pour préserver son témoin destiné à l'inversion de la réticulation.

Effectuer une dilution par étapes des autres aliquotes d’un facteur dix dans du tampon de dilution pour puces, contenant du PIC fraîchement ajouté à raison d’un microlitre par 800 microlitres de tampon. Déterminer d’abord les vitesses de centrifugation qui seront utilisées pour la pré-élimination en fonction de l’anticorps qui sera utilisé pour la protéine dans le test sur puce. Des billes A sont utilisées ici car l’anticorps destiné à la puce est de type rabid.

Pré-éliminer les complexes immunoprécipités dilués en ajoutant 75 microlitres d'une solution à 50 % d'ADN de sperme de saumon et de protéines. Incuber à température ambiante pendant quatre heures à 4 degrés Celsius avec agitation rotative ; après l'incubation, centrifuger les échantillons à 2 500 ×g pendant une minute à 4 degrés Celsius. Transférer les surnageants dans un nouveau tube DPH prérefroidi.

Ajouter quatre microgrammes d'anticorps par échantillon à l'Eloqua pré-clarifié et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation rotative. Commencer par ajouter 60 microlitres de la suspension de billes d'aéros, ADN d'espérume de saumon et protéine, dans chaque échantillon et incuber à quatre degrés Celsius avec agitation rotative pendant une heure. Centrifuger les échantillons à 1000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, retirez soigneusement les surnageants et jetez-les en conservant le complexe ADN-protéine sur billes sur de la glace. Resuspendez et lavez les culots comme décrit dans le protocole écrit, à l'aide des tampons un à quatre.

Chaque lavage comprend une période d'incubation de cinq minutes avec rotation, suivie d'une centrifugation à 1000 G pendant une minute et de la suppression du surnageant après lavage. Éluer le complexe anticorps-chromatine en resuspendant vigoureusement le complexe de billes protéiques de chromatine lavé dans 250 microlitres de tampon d'élution fraîchement préparé. Vortexer chaque échantillon pendant cinq secondes, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes avec rotation, après une centrifugation à 2 500 G pendant une minute. À température ambiante, transférer chaque éluat dans un nouveau tube Eppendorf.

Répétez le processus d'élution et combinez l'éluat de chaque échantillon dans le même tube Eppendorf. Pour inverser les liaisons croisées, ajoutez 20 microlitres de chlorure de sodium 5 M à chaque éluat de 500 microlitres. Pour le témoin d'entrée précédemment réservé, ajoutez 40 microlitres de chlorure de sodium 5 M par millilitre.

Chauffer les EIT dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant quatre heures. Pour la course nocturne, déposer 10 microlitres de chaque échantillon du témoin d'entrée sur un gel d'agarose à 2 %, à côté d'un marqueur de taille couvrant 0,1 à un kilobase pair, afin de vérifier la taille des fragments d'ADN. L'ADN apparaîtra sous forme d'une traînée diffuse et non d'une bande nette.

Récupérez l'ADN à partir de chaque échantillon de 500 microlitres à l'aide d'un kit d'extraction sur gel kaya quick. Commencez par ajouter 600 microlitres de tampon qg afin d'optimiser l'adsorption de l'ADN sur la membrane de silice dans une colonne kaya quick spin, puis ajoutez 200 microlitres d'isopropanol avant de charger la colonne. Vérifiez le mélange afin de déterminer si un précipité de SDS est présent.

Si une précipitation de SDS s'est produite, les échantillons doivent être réchauffés dans un bain-marie à 42 degrés Celsius jusqu'à disparition du précipité. Ensuite, appliquez les échantillons sur les colonnes et éluiez l'ADN selon les instructions du fabricant. Le SDS peut interférer avec l'activité de la polymérase PCRT et doit donc être complètement éliminé avant d'effectuer la PCR.

Incubez chaque échantillon d'ADN sur de la glace pour précipiter tout excès de SDS, puis centrifugez à 14 000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Transférez le SANE dans de nouveaux tubes einor. Les EIT d'ADN peuvent être détectés soit par PCR conventionnelle, soit par PCR quantitative en temps réel ou QPCR avec des amorces spécifiques. Pour chaque séquence à analyser, utilisez cinq à 10 microlitres de l'ADN total IIT par réaction de PCR ou de QPCR. Les conditions de PCR et de QPCR varieront.

Cependant, la quantité limitée de matériau initial nécessite des cycles supplémentaires de PCR pour la détection par PCR conventionnelle ; commencez avec 40 cycles et ajustez selon les besoins. À l’aide de ce protocole, des expériences de ChIP ont été réalisées à partir d’embryons E 8,5 et E 9,5. Les ADN purifiés après ChIP ont été analysés par PCR conventionnelle et par PCR quantitative en temps réel.

Les résultats démontrent que le facteur myogénique et régulateur est présent sur le promoteur myogénique chez les embryons E 8,5 et E 9,5. En revanche, aucune indication de liaison myogénique au promoteur myogénique n’a été observée dans la vésicule vitelline, où la myogénèse n’est pas exprimée. Le promoteur de l’interféron gamma, qui contient des séquences correspondant au site de fixation myogénique, a été utilisé comme contrôle négatif, comme attendu : la protéine myogénique n’était liée au promoteur de l’interféron gamma dans aucun des échantillons tissulaires analysés.

Les résultats indiquent que Myogenic est lié au promoteur myogénique dans les somites d'embryons à 8,5 j et 9,5 j, car myo Genin est exprimé spécifiquement dans les somites à ces stades. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et préparer des embryons de souris à 8,5 j pour une précipitation de la chromatine, une analyse qui permettra d'identifier les facteurs régulateurs associés aux gènes spécifiques aux tissus dans les tissus en développement.