Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches neurales humaines à partir de tissu cortical frontal mis au rebut. Cela est réalisé en préparant d'abord à l'avance les solutions et les matériaux avant de disséquer les cerveaux fœtaux humains. Suit ensuite le maintien des cellules souches neurales isolées, incluant leur expansion ultérieure, leur caractérisation et des expérimentations.

Le stockage à long terme est envisageable, tout comme l'établissement de sous-cultures en vue de la différenciation de progéniteurs en types cellulaires neuronaux et gliaux. En définitive, la différenciation de cellules provenant du SNC normal peut être caractérisée et comparée à celle de cellules issues d'un SNC présentant des troubles neurologiques connus. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic de toute affection humaine du SNC.

La technique offre une plateforme simple et fiable pour évaluer les S pathologiques et pour évaluer l'efficacité pharmacologique de nouveaux médicaments dans un trouble donné. En raison de la valeur exceptionnelle des cellules multipotentes, tous les matériaux doivent être prêts à l'avance avant de commencer le protocole. Pour minimiser le risque de compromettre les échantillons, préparez à l'avance la dissection réfrigérée, le bain de milieu réchauffé à 37 degrés Celsius pour la culture, le milieu et les cellules réfrigérés, ainsi que le milieu de congélation pour le stockage à long terme.

En vue de la cryoconservation pour la dissection, préparez des pinces stériles stérilisées à l'autoclave ainsi que des lames de scalpel avec manches prêtes à l'emploi pour la dissociation cellulaire. Prévoyez un pistolet à pipettes, des pipettes de transfert de 10 millilitres et un filtre cellulaire de 40 micromètres. Préparez et mettez de côté plusieurs boîtes de culture de 10 centimètres destinées à la dissection.

Des tubes à centrifuger de 50 millilitres pour la dissociation. Des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre pour le stockage des tissus et des flacons congelés pour la congélation des cellules afin d'assurer le succès. Du tissu viable âgé de 18 à 22 semaines doit être récolté dans les deux heures suivant sa disponibilité.

Idéalement, le tissu fœtal peut être obtenu en quelques minutes après sa disponibilité en organisant la collecte après des interventions chirurgicales choisies. Les tissus sont souvent fragmentés ; toutefois, une partie importante du cerveau reste intacte. Recueillir le cerveau dans une boîte de Pétri de 10 millilitres remplie de milieu de dissection glacé.

Identifier les différentes parties du cortex à l'aide de repères anatomiques. Les limites des cortics frontal, pariétal et occipital sont définies par l'intersection extrapolée du sillon central et du sillon de Sylvius. Dissecter le tissu du cortex frontal situé en avant du sillon central et le long de la bordure du sillon de Sylvius à l'aide de lames chirurgicales.

Veillez à maintenir le ventricule intact et non endommagé. Retirez à présent tout résidu sanguin et les méninges du bloc de cortex frontal séparé. Si l'échantillon n'est pas trop fragmenté et suffisamment volumineux, divisez le bloc en plusieurs échantillons plus petits afin d'en conserver une partie pour l'histologie ainsi que pour des dosages protéiques ou en ARNm.

Transférez maintenant un fragment de cerveau dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et ajoutez un volume de milieu de dissection glacé équivalent à trois fois le volume du tissu. À l’aide d’une pipette, dissociez délicatement le tissu jusqu’à ce que tous les fragments soient désagrégés. Pour suspendre complètement les cellules, filtrez-les à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres.

Centrifugez maintenant la suspension cellulaire et resuspendez le culot cellulaire dans 10 millilitres de milieu de culture frais et chaud. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules et calculez le volume correspondant à 2 millions de cellules. Transférez ensuite chaque volume de 2 millions de cellules dans un flacon de culture de 25 centimètres carrés.

Préparé avec cinq millilitres de milieu de culture tiède. Maintenir les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une semaine. Changer la moitié du milieu une fois par semaine pour les cultures plus longues. Après une à deux semaines en culture, des neurosphères se forment généralement avec un diamètre de cellule souches neuronales (NSC) compris entre 200 et 400 microns.

Pour dissocier les neurosphères en cellules individuelles, incuber les cellules avec du EDTA dans du milieu de Hank pendant 15 minutes. Pour préparer les cellules en suspension pour un subculture, centrifuger les cellules, les laver avec du Hank et resuspendre les cellules dans du milieu de culture chaud.

Pour initier la différenciation, ensemencez les cellules dissociées sur des lamelles revêtues de poly-L-lysine et de laminine à une densité de 100 000 cellules par lamelle et incubez pendant 30 minutes. Les cellules peuvent facilement être différenciées en oligodendrocytes, neurones ou astrocytes.

Pour la différenciation neuronale, maintenir les cellules en milieu contenant B 27 pendant sept jours. Pour la culture de différenciation en astrocytes, cultiver les cellules en milieu contenant du FBS pendant sept jours. Pour la différenciation en oligodendrocytes, maintenir les cellules en milieu modifié contenant des facteurs de croissance pendant deux jours, puis, après deux jours, utiliser le même milieu modifié sans les facteurs de croissance pendant cinq jours supplémentaires afin de conserver les cellules souches.

Après centrifugation des suspensions cellulaires dissociées, resuspendez les cellules dans un milieu de congélation à une concentration de 10 millions de cellules par flacon. Par millilitre, congélez lentement les cellules à moins 20 degrés Celsius avant de les congeler à moins 80 degrés Celsius pour une conservation à long terme. Transférez-les ensuite dans de l'azote liquide.

Ensuite, les cellules sont décongelées rapidement dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius et resuspendues. Dans du D-M-E-M-F 12 réchauffé contenant 10 % de sérum pour un lavage. Les cellules réchauffées sont ensuite centrifugées, l'excédent est aspiré, puis elles sont resuspendues dans le milieu de culture réchauffé.

Des cellules souches neurales de taille moyenne provenant d'un fœtus normal, à un âge gestationnel de 18 semaines, ont été cultivées pour former des neurosphères, lesquelles ont été transfectées avec la GFP. Les neurosphères ont ensuite été différenciées afin de produire plusieurs types cellulaires, puis fixées et marquées avec des marqueurs cellulaires et la rumine.

La multipotentialité est observée par l'expression de marqueurs indiquant la présence de neurones, d'astrocytes et d'oligodendrocytes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler, d'agrandir et de manipuler des cellules souches neurales humaines à partir de tissu cortical frontal mis au rebut. Ces régions offrent une opportunité unique d'étudier les pathologies du cortex humain et de tester l'efficacité potentielle d'agents pharmacothérapeutiques.